一種牛胚胎玻璃化冷凍甩管解凍和直接移植方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種牛胚胎玻璃化冷凍甩管解凍和直接移植方法，屬于胚胎低溫生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明方法包括：(1)牛胚胎冷凍用細(xì)管中先加入一段解凍液，然后裝入一段空氣；(2)裝入一段冷凍液，再裝入一段空氣；(3)裝入一段冷凍液，并在該段冷凍液中置入牛胚胎，再裝入一段空氣；(4)裝入一段解凍液并封閉管口，冷凍；(5)甩管解凍，直接移植；冷凍液為含有EG、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液，解凍液為含F(xiàn)BS的mPBS溶液。本發(fā)明方法操作簡便，對操作人員技術(shù)要求不高，冷凍后的牛胚胎甩管解凍后可直接移植，解凍后的胚胎存活率100％，擴(kuò)張率94％，移植后妊娠率達(dá)57％，是一種高效、簡便易行的方法，適用于產(chǎn)業(yè)化推廣。
【專利說明】一種牛胚胎玻璃化冷凍甩管解凍和直接移植方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物胚胎冷凍保存及胚胎移植【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種牛胚胎玻璃 化冷凍甩管解凍和直接移植方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自從Rail等（1985)發(fā)明胚胎玻璃化冷凍保存方法以來，使冷凍勿需借助冷凍儀， 可在室溫下進(jìn)行操作，程序得到極大地簡化。后經(jīng)許多研宄者的改進(jìn)，目前卵母細(xì)胞/胚胎 的玻璃化冷凍方法僅需1分鐘左右即可完成一個程序。在此過程中，許多研宄者創(chuàng)造性地 發(fā)明了許多冷凍的承載物體，并被命名為多種方法。如今常用的主要有以下幾種方法：尼龍 環(huán)玻璃化法（Cryoloop)、開放式拉管法（OPS，Open Pulled Straw)、微細(xì)玻璃管法（GMP)、微 滴法（Microdrops)、半細(xì)管法（hemi-straw)。但上述方法在應(yīng)用中仍存在著諸多的問題， 如：尼龍環(huán)玻璃化法一次冷凍卵母細(xì)胞/胚胎數(shù)量有限，且需要特殊的冷凍管固定裝置才 易于長期保存。開放式拉管法（OPS)由于細(xì)管重量較輕，冷凍時易漂浮在液氮面，且該方法 的細(xì)管管壁較薄，易斷裂，在液氮中極易斷裂而造成卵母細(xì)胞/胚胎丟失，不利于卵母細(xì)胞 /胚胎的長期保存。微細(xì)玻璃管法（GMP)突出問題是冷卻速率慢（最高限制在20000°C/ min左右），易造成卵母細(xì)胞/胚胎損傷；并且GMP在冷凍中容易斷裂，造成卵母細(xì)胞/胚胎 丟失；且GMP的直徑和體積很小，限制了一次冷凍卵母細(xì)胞/胚胎的數(shù)量；而且GMP的虹吸 效果十分顯著，這也增加了操作的難度。微滴法（Microdrops)缺點(diǎn)是在貯存過程中無法進(jìn) 行標(biāo)識，容易污染，不利于卵母細(xì)胞/胚胎的長期貯存。半細(xì)管玻璃化冷凍法（hemi-straw) 缺點(diǎn)是操作較難，對專業(yè)技術(shù)人員的水平要求較高，需要有操作熟練的技術(shù)人員，不太適用 于初學(xué)者。國內(nèi)外對牛胚胎冷凍甩管解凍和直接移植法的研宄還存在操作比較復(fù)雜，冷凍 液毒性較高及冷凍效率較低等諸多問題。這些因素影響了玻璃化冷凍方法在牛胚胎移植生 產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。
[0003] 為了適應(yīng)牛胚胎移植大規(guī)模生產(chǎn)需要，簡化胚胎冷凍解凍操作程序，降低生產(chǎn)成 本，提高胚胎移植效率，國內(nèi)外研宄人員進(jìn)行了牛胚胎冷凍甩管解凍和直接移植法的試驗。 該方法的共同點(diǎn)是以牛凍精細(xì)管做為玻璃化冷凍載體，稀釋液（即解凍液）段占比較大，牛 胚胎在管外經(jīng)預(yù)處理液平衡后，置于玻璃化冷凍液段中，投入液氮冷凍保存。解凍時從液氮 中取出細(xì)管，經(jīng)空氣浴，水浴解凍后，甩管混勻管內(nèi)液體。牛胚胎在管內(nèi)平衡一段時間后，剪 掉封口端，然后直接裝入移植槍進(jìn)行胚胎移植。表1為國內(nèi)外牛胚胎冷凍甩管解凍和直接 移植法的研宄進(jìn)展。
[0004] 表1國內(nèi)外牛胚胎冷凍甩管解凍和直接移植法研宄進(jìn)展
[0005]
【權(quán)利要求】
1. 一種玻璃化冷凍液在冷凍牛胚胎中的應(yīng)用，其特征在于，將牛胚胎置于該冷凍液中， 于液氮中冷凍保存；所述冷凍液為含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，冷凍液通過以下方法配制得到： a) mPBS溶液中加入聚蔗糖和蔗糖，使其終濃度分別為300g/L和0. 5mol/L，得到FS溶 液； b) 向FS溶液中加入乙二醇，二者體積比為65 :35,得到EFS35溶液即為冷凍液。
3. -種用于解凍牛胚胎的解凍液，其特征在于，其為向mPBS溶液中加入胎牛血清，二 者體積比為9:1。
4. 權(quán)利要求3所述的解凍液在冷凍甩管解凍牛胚胎中的應(yīng)用，其特征在于，含有以下 步驟： (1) 牛胚胎冷凍用細(xì)管中先加入一段解凍液，然后裝入一段空氣； (2) 接著裝入一段冷凍液，再裝入一段空氣； (3) 裝入一段冷凍液，并在該段冷凍液中置入牛胚胎，再裝入一段空氣； (4) 裝入一段解凍液并封閉管口，投入液氮冷凍； (5) 甩管解凍，直接移植； 所述冷凍液為EFS35,其為含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液。
5. -種牛胚胎玻璃化冷凍甩管解凍和直接移植方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 牛胚胎冷凍用細(xì)管中先加入一段解凍液，然后裝入一段空氣； (2) 接著裝入一段冷凍液，再裝入一段空氣； (3) 裝入一段冷凍液，并在該段冷凍液中置入牛胚胎，再裝入一段空氣； (4) 裝入一段解凍液并封閉管口，投入液氮冷凍； (5) 甩管解凍，直接移植； 所述冷凍液為EFS35,其為含有乙二醇、聚蔗糖和蔗糖的mPBS溶液；所述解凍液為含 10% (V/V)胎牛血清的mPBS溶液。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述冷凍液通過以下方法配制得到： a) mPBS溶液中加入聚蔗糖和蔗糖，使其終濃度分別為300g/L和0. 5mol/L，得到FS溶 液； b) 向FS溶液中加入乙二醇，二者體積比為65 :35,得到EFS35溶液即為冷凍液。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（1)加入的解凍液長度為7. 5cm，空氣 為 0? 5cm ; 步驟（2)中加入的冷凍液長度為0. 4cm，空氣長度為0. 5cm ; 步驟（3)中加入的冷凍液長度為0. 5-0. 7cm，空氣長度為0. 5cm ; 步驟（4)中加入的解凍液長度為0. 9-1. lcm。
8. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在牛胚胎置入冷凍液之前，還包括在 20-25°C下，將牛胚胎移入乙二醇溶液中平衡2.5-3min，然后移入步驟（3)的冷凍液中；所 述乙二醇溶液為乙二醇與mPBS溶液按照體積比1:9混合配制而成。
9. 如權(quán)利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，從牛胚胎移入冷凍液到投入液氮中 冷凍應(yīng)在30秒之內(nèi)完成。
10. 如權(quán)利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，從液氮中取出冷凍牛胚胎的細(xì)管， 在空氣中停留5-10秒，然后浸入20-25°C水浴中平行晃動，待細(xì)管內(nèi)的溶液融化后，手持細(xì) 管快速甩動使管內(nèi)的冷凍液和稀釋液充分混勻，細(xì)管自解凍后于室溫下平衡6-15min移植 于受體。
【文檔編號】A01N1/02GK104488853SQ201510015346
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月12日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月12日
【發(fā)明者】朱士恩, 傅祥偉, 周艷華, 張有文 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)