蘇云金芽胞桿菌分泌殺蟲基因sip1A,表達(dá)蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及“蘇云金芽胞桿菌sip1A基因，表達(dá)蛋白及其應(yīng)用”，屬于生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】。殺蟲蛋白，具有如SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列，及編碼該殺蟲蛋白的基因，優(yōu)選所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。上述基因?qū)η食崮亢οx具有高毒力，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的抗藥性產(chǎn)生。CGMCC No964120140905
【專利說明】蘇云金芽胞桿菌分泌殺蟲基因 sip1A，表達(dá)蛋白及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是進(jìn)一步，本發(fā)明涉及對鞘翅目農(nóng)業(yè)害蟲具 有高毒力的Bt分泌殺蟲基因及由該基因所編碼的蛋白質(zhì)。

【背景技術(shù)】
[0002] 蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭 氏陽性細(xì)菌，是一種對害蟲毒力強(qiáng)且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動(dòng)物和人 無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個(gè)目3000多種 害蟲有活性。Bt在芽胞形成期可形成殺蟲晶體蛋白（Insecticidal CrystalProteins, ICPs)，也稱δ-內(nèi)毒素（delta-endotoxin),它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切 關(guān)系[Schnepf. E, Crickmore. N, Van Rie. J. , Lereclus. D, Baum. J, Feitelson. J, Zeigler. D.R. , Dean. D. H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 1998, 62(3) :775-806.]。自 1981 年 Schnepf 等克隆了 Bt 的第 一個(gè)ICPs基因，并于1985年發(fā)表了它的DNA堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起，目前 (2014年4月）共776個(gè)，其中cry基因738個(gè)，cry模式基因289個(gè)；cyt基因38個(gè)，cyt模 式基因11個(gè)。當(dāng)今，采用噴施化學(xué)農(nóng)藥防治手段固然可以減輕害蟲對農(nóng)作物的為害，但化 學(xué)農(nóng)藥造成環(huán)境污染，長期以來，大量噴施化學(xué)殺蟲劑，不僅會(huì)增強(qiáng)害蟲的抗藥性，使益 蟲及其它生態(tài)區(qū)系遭受破壞，而且嚴(yán)重污染環(huán)境，提高生產(chǎn)成本，破壞生態(tài)平衡。蘇云金 芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用于蟲害防治。蘇 云金芽胞桿菌除了直接作為生物農(nóng)藥以外，1996年全世界第一例轉(zhuǎn)基因抗蟲植物在美國獲 準(zhǔn)應(yīng)用，它使用的基因來自Bt crylAc。在接下來的幾年里，轉(zhuǎn)crylAb基因的抗蟲玉米，轉(zhuǎn) cry3Aa基因的抗蟲土豆等相距問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有crylAc/crylAb 基因的抗蟲棉以來，已經(jīng)被普遍種植。在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第一個(gè)12年（1996-2007)中， 由于能得到持續(xù)穩(wěn)定的收益，農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物量逐年增加。2013年，27個(gè)國家的1800 萬農(nóng)民種植了 1.752億公頃（4. 33億英畝）的轉(zhuǎn)基因作物，比2012年持續(xù)增長了 3%，即 500萬公頃（1200萬英畝）。1800萬農(nóng)民從轉(zhuǎn)基因作物中獲益，其中90%為資源匱乏的小農(nóng) 戶。前五個(gè)種植轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展中國家是亞洲的中國和印度、拉丁美洲的巴西和阿根廷 以及非洲的南非，共種植8270萬公頃的轉(zhuǎn)基因作物，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的47%， 并且這五個(gè)國家的人口約占全球70億人口的41%。中國750萬資源匱乏的小農(nóng)戶種植了 420萬公頃的Bt棉花，采用率為90%，平均每戶農(nóng)民種植0. 5公頃的Bt棉花。轉(zhuǎn)基因作物 商業(yè)化給工業(yè)化國家和發(fā)展中國家的農(nóng)民都帶來了經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。蘇云金芽胞桿菌及 其基因發(fā)掘已成為可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中重要課題。
[0003] 由于目前商品化的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的抗蟲基因種類比較單一，如此大面積推廣種 植存在害蟲避難所減少與害蟲抗藥性上升的風(fēng)險(xiǎn)。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基 因組合來避免害蟲抗藥性上升的風(fēng)險(xiǎn)。因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲基因，可 以豐富殺蟲基因資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來源，提高Bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的 抗蟲效果，并且可以降低害蟲對Bt毒蛋白的抗性風(fēng)險(xiǎn)，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重要 的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種對鞘翅目害蟲大猿葉甲高毒力的蘇云金芽胞桿菌QZL38,及其殺 蟲新基因分泌基因 siplA和其晶體殺蟲蛋白，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使之表現(xiàn)出對 相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌和轉(zhuǎn)基因植物的抗藥性產(chǎn)生。
[0005] 蘇云金芽胞桿菌菌株QZL38,其保藏編號(hào)為：CGMCC No. 9641。
[0006] 蘇云金芽胞桿菌菌株QZL38在殺滅鞘翅目農(nóng)業(yè)害蟲中的應(yīng)用。
[0007] 殺蟲分泌蛋白SiplA，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0008] siplA基因，編碼殺蟲蛋白SiplA。
[0009] 優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
[0010] -種表達(dá)載體，其特征是含有siplA基因。
[0011] 所述表達(dá)載體為pEB-siplA，其骨架載體為pEB，其結(jié)構(gòu)如圖6所示；或者所述表達(dá) 載體為pET21b-crylCa，其骨架載體為pET21b，其結(jié)構(gòu)如圖7所示。
[0012] 一種微生物轉(zhuǎn)化體，其特征是含有siplA基因。
[0013] siplA基因在殺滅大猿葉甲等鞘翅目農(nóng)業(yè)害蟲中的應(yīng)用。
[0014] 所述應(yīng)用是將siplA基因表達(dá)的蛋白作為生物殺蟲劑的有效成分。
[0015] 本發(fā)明從遼寧千山圓通觀附近土壤中分離得到一株蘇云金芽胞桿菌菌株QZL38， 其保藏編號(hào)為CGMCC No. 9641，該菌株生物學(xué)特性為在生長周期中可以產(chǎn)生芽胞，并且同時(shí) 產(chǎn)生有毒殺鞘翅目害蟲作用的伴胞晶體，其對大猿葉甲具有很強(qiáng)的殺滅能力；從該菌株中 得到一個(gè)新基因的陽性克隆，即pEB-sip (見圖6)，對其進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)克隆SiplA中含 有1188個(gè)堿基，見SEQ ID N01，編碼395個(gè)氨基酸，見SEQ ID N02。從上述陽性克隆提取 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入受體菌，得到表達(dá)菌株，測定基因的表達(dá)蛋白的活性，基因表達(dá)的SiplA蛋白對 大猿葉甲的初篩生測結(jié)果為校正死亡率為100%，見表1。
[0016] SiplA基因可按生物技術(shù)的常規(guī)方法轉(zhuǎn)化微生物、植物，表現(xiàn)出對相關(guān)翹翅目害蟲 的毒性。
[0017] 將上述基因轉(zhuǎn)化菌株，表達(dá)得到的蛋白可以制成生物農(nóng)藥用于殺死鞘翅目害蟲。 同時(shí)，可以轉(zhuǎn)入植物構(gòu)建抗蟲轉(zhuǎn)基因植物，用于害蟲的防治。
[0018] 本發(fā)明分離克隆的Bt sip基因序列及其基因表達(dá)產(chǎn)物能夠?qū)η食崮看笤橙~甲，榆 藍(lán)葉甲害蟲產(chǎn)生強(qiáng)毒力，特別是對大猿葉甲有高活性，是很好的生物殺蟲基因，有很廣泛的 應(yīng)用前景。通過該sip基因與crylAc、crylAb、crylBa、cry2Ab等基因表達(dá)產(chǎn)物組合，可擴(kuò) 大對鞘翅目害蟲的殺蟲譜。通過應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物和植物，使它們表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒 性，可克服或延緩昆蟲對工程菌和轉(zhuǎn)基因植物抗藥性的產(chǎn)生。
[0019] 菌株保藏信息：
[0020] 菌種分類命名：蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringensis)
[0021] 保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0022] 保藏日期：2014年09月5日
[0023] 保藏編號(hào)：CGMCC No. 9641

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1光學(xué)顯微鏡下觀察菌株QZL38菌體的形態(tài)，
[0025] 圖2電鏡下菌株QZL38菌體形態(tài)，
[0026] 圖3含有目的基因的基因組PCR鑒定，
[0027] M:Marker(100、200、500、750、1000、2000、3000、5000bp)
[0028] 圖4siplAa基因全長PCR結(jié)果，
[0029] M:Marker(100、200、500、750、1000、2000、3000、5000bp)，
[0030] 圖5siplAa基因在大腸桿菌中表達(dá)蛋白的SDS-PAGE，
[0031] 其中a為pEB-siplA重組質(zhì)粒的表達(dá)，b為pET-siplA重組質(zhì)粒的表達(dá)，
[0032] I :IPTG誘導(dǎo)的pEB-siplA蛋白；2 :IPTG誘導(dǎo)的pEB空載體蛋白；
[0033] 3 :IPTG誘導(dǎo)的pET21b-siplA蛋白；4 :IPTG誘導(dǎo)的pET21b空載體非可溶組分；
[0034] 圖6重組載體pEB-sip IA的結(jié)構(gòu)圖，
[0035] 圖7重組載體pET2 lb-sip IA的結(jié)構(gòu)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 實(shí)施例1、分離得到蘇云金芽胞桿菌菌株QZL38
[0037] 本 申請人:的實(shí)驗(yàn)室工作人員從遼寧省千山土壤中分離的得到一株蘇云金芽胞桿 菌，蘇云金芽胞桿菌的芽胞由外向內(nèi)依次為芽胞外壁、芽胞衣、皮層、芽胞內(nèi)壁，原生質(zhì)膜和 原生質(zhì)體。其中皮層的主要成分是肽聚糖，不含營養(yǎng)細(xì)胞的多聚糖磷壁酸，它保持著芽胞的 脫水狀態(tài)和耐熱性，另一方面，芽胞形成過程中，會(huì)產(chǎn)生大量DPA-Ca鰲合物，使得芽胞中 的生物大分子形成耐熱凝膠，在80°C下熱處理20min，蘇云金芽胞桿菌芽胞也不會(huì)死亡并 且休眠的芽胞在75°C的亞致死溫度下處理15min，活化效果最好，不但促其快速萌發(fā)，還可 提高芽胞的成活率（喻子牛1990)。依據(jù)這一特性，可實(shí)施溫度篩選（Knowles B H，Ellar D J. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis d-endotoxins with different specificity[J]. Biochimica et biophysica acta，1987, 924:509-518.;戴蓮韻，王學(xué)聘等.中國八個(gè)自然保護(hù)區(qū)森林土壤 中蘇云金芽胞桿的分布[J].微生物學(xué)報(bào)，1994,30(2) 117-121)。
[0038] 1、1菌株的分離
[0039] 1)取分裝的土樣加入到50ml大離心管中，至錐形管錐形處。
[0040] 2)加滅菌水至15ml處，放入玻璃珠5?10顆。
[0041] 3)用振蕩器將土樣打碎。
[0042] 4)放入水浴鍋中80°C，20分鐘。
[0043] 5)取I. 5ml的EP管，每個(gè)管中加 Iml滅菌水，再從50ml管中取10微升菌液加入 到EP管中混勻。
[0044] 6)從EP管中取100微升噴到1/2LB培養(yǎng)基中，涂勻。
[0045] 7)放入到30°C溫箱中培養(yǎng)2?3天。
[0046] 8)鏡檢觀察。
[0047] 晶體觀察
[0048] 光學(xué)顯微鏡：
[0049] 將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復(fù)紅染液染色3min， 清水沖洗，IOOx油鏡進(jìn)行鏡檢，石炭酸復(fù)紅染液配制方法參見文獻(xiàn)（Baroy F，Lecadet M M, Deleluse A. Cloning and sequencing of three new putative toxin genes from Clostridium bifermentans[J]· Gene, 1998,211:293-295)。見圖 I 所示。在 1/2LB 培養(yǎng)基 上培養(yǎng)48h后形成單菌落，光學(xué)顯微鏡下觀察到菌株QZL38菌體為長桿狀，芽胞為長圓棒 狀，晶體為雙錐形。
[0050] 電鏡顯微觀察：
[0051] 掃描電鏡制樣：孢晶混合液滴于玻璃片上，干燥，經(jīng)鋨酸固定，而后經(jīng)酒精梯度脫 水，臨界點(diǎn)干燥，離子濺射噴金（2nm厚），New Bio-TEM H-7500掃描電鏡觀察拍照。如圖2 所示。
[0052] 生物學(xué)測定表明，對小菜蛾、甜菜夜蛾的初篩生測結(jié)果為校正死亡率為100%。
[0053] 將該菌株保藏，其保藏編號(hào)CGMCC No. 9641。
[0054] 實(shí)施例2.獲得新基因
[0055] 2. 1利用sip類基因通用引物檢測菌株QZL38,引物如下
[0056] SP5 GTTGCTCTATAATATGGATTAGCAC
[0057] SP3 CTGGTAAACCAATAAATATGCAAG
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 蘇云金芽胞桿菌菌株QZL38,其保藏編號(hào)為：CGMCC No. 9641。
2. 蘇云金芽胞桿菌菌株QZL38在殺滅鞘翅目害蟲中的應(yīng)用。
3. 殺蟲蛋白SiplAa，其氣基酸序列如SEQ ID NO 2所不。 4. siplAa基因，編碼殺蟲蛋白SiplAa。
5. 權(quán)利要求4所述的siplAa基因，其核苷酸序列如SEQ ID N01所示。
6. -種表達(dá)載體，其特征是含有權(quán)利要求4或5所述的siplAa基因。
7. 權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體為pEB-siplAa，其骨架載體為pEB，其結(jié)構(gòu)如圖6所示； 或者所述表達(dá)載體為pET21b-crylCa，其骨架載體為pET21b，其結(jié)構(gòu)如圖7所示。
8. -種微生物轉(zhuǎn)化體，其特征是含有權(quán)利要求4或5所述的siplAa基因。
9. 權(quán)利要求4或5所述的siplAa基因在殺滅大猿葉甲，榆藍(lán)葉甲，金龜子害蟲中的應(yīng) 用。
10. 權(quán)利要求9所述應(yīng)用，是將權(quán)利要求4或5所述的siplAa基因表達(dá)的蛋白作為生 物殺蟲劑的有效成分。
【文檔編號(hào)】A01P7/04GK104388349SQ201410675353
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】李海濤, 高繼國, 劉榮梅, 張金波, 張 杰 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)