一種水稻稻瘟病抗性基因RMg41及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因RMg41及其應用。本發(fā)明公開了水稻稻瘟病新抗性基因RMg41的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列。該基因?qū)儆贜BS-LRR類型抗病基因家族的成員。本發(fā)明中的抗稻瘟病基因克隆自對稻瘟病菌表現(xiàn)出高抗的水稻品系，并將其轉(zhuǎn)化至對稻瘟病菌感病的品種中，利用稻瘟病菌侵染的方法對其抗病能力進行評估，從而最終確定該基因?qū)λ镜疚敛【哂锌剐浴?br> 【專利說明】-種水稻稻瘟病抗性基因 RMg41及其應用
[0001]

【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因 RMg41及其應 用。
[0003]

【背景技術】
[0004] 植物抗病基因是植物與病原菌長期相互作用的結(jié)果，在植物的生理和進化過程中 扮演著十分重要的角色。由于植物病害每年給農(nóng)、林生產(chǎn)帶來巨大的損失，合理有效地防 治植物病害是保障農(nóng)、林可持續(xù)發(fā)展所必須解決的關鍵問題之一。大量實踐證明，開發(fā)和 利用已有的植物抗病種質(zhì)資源是防治植物病害的最為有效的方法之一（Tanksley et al. 2007 ;董玉琢，2001)。
[0005] 傳統(tǒng)的抗病品種培育，通常是將優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種與抗病性強的材料雜交，然后通 過不斷的回交選育，最后得到抗病且優(yōu)質(zhì)的新品種。盡管這一方法十分有效，但極其耗時， 當新品種培育出來之后，可能對病原菌新進化產(chǎn)生的株系或小種表現(xiàn)為感?。═anksley et al. 2007);經(jīng)典的圖位克隆方法利用抗病和感病的品種雜交，然后對大量的分離后代接種 病菌、鑒定抗性、遺傳作圖等，最后在精確遺傳定位的基礎上進行克隆。這種方法取得了很 好的效果，在植物抗病基因的克隆中起到了非常重要的作用（如抗白葉枯病基因 Xa21的 分離和利用，Song et al. 1995)，但因其周期長、費時費力、分離和等位性檢測較難等原 因，不適合大量克隆抗病基因的需要。同時，因抗病基因獨特的遺傳方式，也使該方法的 應用受到了很大的限制。以水稻抗稻瘟病基因為例，該類基因在基因組中通常成簇（gene cluster)分布（Wang et al. 1999;Liu et al. 2002; Lin et al. 2007)，在不同品種的 同源染色體間的位置和結(jié)構也多呈不對稱分布，等位關系不明確，拷貝數(shù)變異大（Yang et al. 2007; Ding et al. 2007a; Sun et al. 2008; Li et al. 2010)。這些遺傳現(xiàn)象，大 大增加了圖位克隆的難度，嚴重影響了抗病基因的克隆效率。
[0006] 近年來，隨著植物抗病及抗病相關基因分子水平研究的突破性的進展，使我們對 植物抗病及抗病相關基因的結(jié)構、功能、起源、變異及保存的認識有了根本性的變化。自從 第一個植物抗病基因 Hml在1992年被Johal和Briggs從玉米中分離以來（Tanksley et al. 2007 ;董玉琢，2001)，到目前為止，已經(jīng)超過50個植物抗病基因從不同的植物中得以 克隆和分離，其中主要類型的抗病基因為NBS-LRR結(jié)構類型（Nucleotide-binding site and leucine-rich-repeat，即核苷酸結(jié)合位點和富亮氨酸重復蛋白）的抗病基因。由于這 些基因在結(jié)構與功能上都具有高度的相似性，結(jié)合其獨特的遺傳與進化特征，為快速的克 隆與鑒定這些基因提供了便利，也為高效地利用抗病種質(zhì)資源提供了新的機遇。
[0007] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，同時也是我國最主要的 栽培作物之一，但其每年都遭受到嚴重的病蟲害的侵擾，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的損失。其 中，稻瘟病是分布最廣、危害水稻最嚴重的病害之一，嚴重影響到水稻的產(chǎn)量，全球每年由 稻癌病引起的水稻產(chǎn)量損失占11-30% (約合1. 57億美元，http://www. fungalgenomics. ncsu. edu)，直接威脅到稻農(nóng)增收和國家的糧食安全。無論在世界還是在我國，解決稻瘟病 難題一直是保障水稻持續(xù)生產(chǎn)的一個優(yōu)先研究的課題。
[0008] 稻瘟病防治的最大困難之一是病菌本身變異與分化速度快(凌忠專等，2004)。新 的稻癌病菌生理小種層出不窮，已有的抗病基因 （Plant disease resistance, R基因）很 快喪失抗性，而尋找新的抗病材料越來越難，水稻稻癌病對水稻生產(chǎn)的威脅也越來越大。對 應易變的病原菌，水稻必須擁有很多抗病基因。從已經(jīng)定位的70-80個基因位點來看，水稻 抗稻瘟病基因數(shù)量眾多。但是，到目前為止已經(jīng)克隆的抗稻瘟病基因僅14個。雖然已經(jīng)定 位的基因可以通過分子標記輔助選擇的方法加以利用，這一選育過程繁瑣、耗時，當新品種 培育出來之后，可能對新產(chǎn)生的變異菌株表現(xiàn)為感病，克隆并直接轉(zhuǎn)化抗病基因可能是最 直接有效的培育抗病品種的途徑。因此，使用新的思路，開發(fā)能快速克隆抗稻瘟病基因的新 方法，就顯得尤為重要。
[0009] 本發(fā)明利用生物信息學的手段，結(jié)合NBS-LRR類抗病基因的特征，在水稻基因組 中對可能的抗病基因位點進行準確定位，從而可以快速地將候選抗病基因克隆出來，經(jīng)過 篩選，能夠快速高效的從水稻中分離出多個具有稻瘟病抗性的基因。
[0010]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是，分離克隆水稻高抗品種中攜帶的稻瘟病抗性基因 RMg41及包含 調(diào)控這個基因的啟動子的DNA片段。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述稻瘟病抗性基因 RMg41所編碼的蛋白質(zhì)序列。
[0013] 本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述抗性基因的載體。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株。
[0015] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述蛋白質(zhì)在制備抗稻瘟病菌藥物中的應用。
[0016] 本發(fā)明涉及克隆和鑒定一種包含RMg41基因的DNA片段，此基因編碼的蛋白能使 水稻對稻瘟病菌所引起的病害產(chǎn)生特異性的抗病反應。其中，所述片段分別如序列表SEQ ID NO: 1所示或者基本上相當于SEQ ID NO: 1所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO: 1所示序列的亞片段。該DNA序列編碼一種NBS-LRR類蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所分離、克隆的RMg41抗性基因編碼的NBS-LRR蛋白包含兩個主要的結(jié)構域： NBS和LRR區(qū)域，該蛋白的C-末端有22個LRR重復。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明提供的RMg41基因序列信息（SEQ ID N0:1)，本領域技術人員可以通過 以下方法獲得與RMg41等同的基因：（1)通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得；（2)以RMg41基因片段為探 針篩選水稻或其它植物的基因組文庫或cDNA文庫獲得；（3)根據(jù)RMg41基因序列信息設計 寡核昔苷酸引物，用PCR擴增的方法從水稻或其它植物的基因組、mRNA和cDNA中獲取； (4)在RMg41基因序列的基礎上用基因工程方法改造獲得；（5)用化學合成的方法獲得該基 因。
[0018] 本發(fā)明提供的稻瘟病抗性基因 RMg41具有重要的應用價值。將所述的RMg41基因 序列用任何一種轉(zhuǎn)化方法導入水稻或其他植物細胞，可獲得表達所述基因的轉(zhuǎn)基因抗病品 種，從而應用于生產(chǎn)。本發(fā)明所述的基因構建到植物轉(zhuǎn)化載體中，可以對所述基因或其調(diào)控 序列適當修飾，也可以用其它啟動子取代所述基因原有的啟動子，從而拓寬抗譜或增強抗 性。
[0019] 本發(fā)明具有如下有益效果：將克隆的抗稻瘟病基因轉(zhuǎn)入感病的植物中，有助于獲 得新的抗病植物?？寺〉目共』蚰茉诓煌奈锓N間轉(zhuǎn)移并利用，從而能夠克服傳統(tǒng)抗病 育種中遠緣雜交的困難。此外，可以用轉(zhuǎn)基因技術在植物中累加多個抗病基因，縮短育種周 期。本發(fā)明還能夠進一步提供或應用上述DNA片段獲得的抗病轉(zhuǎn)基因植株和相應的種子， 以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種子?？梢杂?有性雜交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其他植株。
[0020]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是本發(fā)明流程不意圖。圖IA :抗稻癌病候選位點的確定；圖1B-E :抗稻癌病 基因的分離與克??；圖IF-G :抗稻瘟病基因的遺傳轉(zhuǎn)化；圖IH :轉(zhuǎn)化體的鑒定。
[0022] 圖2為稻瘟病抗性基因 RMg41的轉(zhuǎn)化體的潮霉素抗性基因和CaMV 35S啟 動子的PCR檢測電泳圖；圖IA為CaMV 35S啟動子的PCR擴增產(chǎn)物，泳道1為載體 pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR擴增產(chǎn)物，泳道2為受體TP309的非轉(zhuǎn)化體的PCR擴增產(chǎn) 物，泳道3-8為轉(zhuǎn)化體的PCR擴增產(chǎn)物；圖IB為潮霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物，泳道1為載體 pCAMBIA1300-AscI質(zhì)粒的PCR擴增產(chǎn)物，泳道2為受體TP309的非轉(zhuǎn)化體的PCR擴增產(chǎn)物， 泳道3-7為轉(zhuǎn)化體的PCR擴增產(chǎn)物。
[0023] 圖3為轉(zhuǎn)化有RMg41基因的植株抗性鑒定圖。圖3A :稻瘟病抗性基因 RMg41的轉(zhuǎn) 化植株的抗性鑒定圖；圖3B :對照植株TP309的抗性鑒定圖。
[0024]

【具體實施方式】
[0025] 實施例一至實施例八的試驗流程如圖1所示。
[0026] 實施例一：稻瘟病抗性基因 RMg41的進化分析 以水稻全基因組測序品種93-11和日本晴為基礎，首先鑒定基因組中所有的NBS-LRR 類型的抗病基因，并構建系統(tǒng)進化樹。在此基礎上，我們選取了 20個候選的抗稻瘟病基因 位點，其中一個基因位點就是RMg41。該位點具有以下的特點：（1)該基因多以基因家族和 基因簇的形式存在，在日本晴基因組中有4個相近的拷貝，在93-11基因組中只有1個拷 貝；（2)在其LRR區(qū)域，特別是xxLxLxx區(qū)域具有較高的Ka/Ks值。
[0027] 實施例二：稻瘟病抗性基因 RMg41 (0s03g63150_GM)的分離與克隆 利用公共數(shù)據(jù)庫測序品種日本晴（Nipponbare)和93-11為參考序列，設計引物（引物 兩端皆帶有酶切位點AscI)。引物序列參見序列表，正向引物序列如SEQ ID N0:4所示；反 向引物序列如SEQ ID N0:5所示。
[0028] 以抗病水稻品種Tet印，谷梅2號和Q2436為模板，利用長片段PCR技術 (Long-PCR)擴增候選基因片段。PCR程序如下：95°C預變性5分鐘，95°C變性30秒，60°C 復性45秒，68 °C延伸7分鐘，共35個循環(huán)，隨后72 °C保溫10分鐘，最后KTC恒溫。隨后對 PCR產(chǎn)物進行割膠回收。
[0029] 實施例三：雙功能基礎載體的準備 將稀有酶切位點AscI導入雙功能載體pCAMBIA1300的多克隆位點BamHI和Sail之間， 取代酶切位點Xbal，構成帶有稀有酶切位點AscI的基礎載體pCAMBIA1300-AsCI。
[0030] 實施例四：候選抗性基因與基礎載體的連接 用限制性內(nèi)切酶AscI，在37攝氏度條件下同時酶切PCR產(chǎn)物與基礎載體質(zhì)粒3h，之后 進行純化回收。在T4連接酶的作用下，將回收過的酶切好的候選基因片段和切開的基礎載 體pCAMBIA1300-AscI片段在15攝氏度條件下連接過夜。
[0031] 實施例五：候選抗性基因的遺傳轉(zhuǎn)化 將攜有候選基因的雙功能載體導入根瘤農(nóng)桿菌EHA105,采用農(nóng)桿菌介導法，將候選基 因轉(zhuǎn)化到水稻普感品種新2號，TP309和Co39中。最后一共獲得20株獨立的轉(zhuǎn)化體。
[0032] 實施例六：PCR分子檢測 以轉(zhuǎn)化體植株提取出的DNA為模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S啟動子的特 異性引物進行PCR反應。潮霉素抗性基因的引物序列參見序列表，正向引物序列如SEQ ID N0:6;反向引物序列如SEQ ID N0:7。CaMV35S啟動子的引物序列參見序列表，正向引物序 列如SEQ ID N0:8;反向引物序列如SEQ ID N0:9。
[0033] 實施例七：轉(zhuǎn)化體的抗性鑒定 選擇10個來源地不同，區(qū)別力好的獨立稻瘟病菌生理小種作為檢測的病原菌種。利用 稻瘟病菌小種接種感染T2代轉(zhuǎn)基因植株和對照品種，篩選抗病性改變的轉(zhuǎn)化體?？剐澡b定 結(jié)果顯示候選基因 RMg41在普感品種TP309的遺傳背景下，對2個病原菌株都顯示不同程 度的抗性，表明候選基因 RMg41具有特異性抗性且被成功克?。▓D2和圖3)。
[0034] 實施例八：稻瘟病抗性基因 RMg41的基因結(jié)構和蛋白結(jié)構分析 采用步移法對RMg41的DNA序列進行了測序。RMg41基因 DNA長度為3771bp，含有3個 開放讀碼框，2個內(nèi)含子和3個外顯子。RMg41編碼的蛋白序列如SEQ ID N0:2所示。RMg41 基因編碼1個由1256個氨基酸殘基組成的蛋白多肽。RMg41蛋白屬于NBS-LRR蛋白，其蛋 白的C-末端為22個LRR重復。
【權利要求】
1. 一種水稻抗稻瘟病基因RMg41，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示的DNA序列，或者 其核苷酸序列是與SEQ ID NO: 1所示的DNA序列在相似度上> 95%相似的DNA序列，或其核 苷酸序列的功能相當于SEQ ID N0:1所示DNA序列的亞片段,或者如SEQ ID N0:1所示的 DNA序列經(jīng)過替換、缺失或增加一個或多個核苷酸且編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權利要求1所述基因序列編碼的蛋白。
3. 根據(jù)權利要求2所述的蛋白，其氨基酸序列分別如SEQ ID N0:2所示，或SEQ ID N0:2所示的序列經(jīng)過替換、缺失、或添加部分氨基酸而形成的具有相同功能的氨基酸序列。
4. 一種調(diào)控如權利要求1所述水稻抗稻瘟病基因RMg41的啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種水稻抗稻瘟病基因RMg41，其特征是含有調(diào)控水稻抗稻 瘟病基因RMg41的啟動子，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6. 含有權利要求1所述基因的轉(zhuǎn)化載體。
7. 含有權利要求6所述轉(zhuǎn)化載體的宿主細胞根癌農(nóng)桿菌EHA105。
8. 含有權利要求6所述轉(zhuǎn)化載體的轉(zhuǎn)基因植物。
9. 權利要求1所述的基因在抗稻瘟病水稻育種中的應用。
10. 權利要求2所述蛋白在制備抗稻瘟病菌藥物中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK104372011SQ201410462383
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權日:2014年9月11日
【發(fā)明者】楊四海, 張彥春, 張小輝, 田大成 申請人:南京大學