藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法：選用菊葉薯蕷無菌苗葉片接種在MS大量+2×MS微量+MS有機+2×MS鐵鹽+6-BA1.0～5.0mg/L+NAA0.2～0.8mg/L+IBA0.2～0.8mg/L+GA30.1～0.8mg/L+3％蔗糖+0.75％瓊脂固體培養(yǎng)基上，獲得根葉俱全的不定芽，然后轉(zhuǎn)接在MS+6-BA0.1～1.0mg/L+NAA0.2～0.8mg/L+IBA0.2～0.8mg/L+GA30.1～0.8mg/L+矮壯素0.5～1.0mg/L+3％蔗糖+0.75％瓊脂固體培養(yǎng)基上增殖和生根；最后移栽和大田塊莖繁育。該方法效果好，是一種在最短的時間內(nèi)獲得大量試管苗的快速繁殖方法。
【專利說明】藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于藥用菊葉薯蕷的組培【技術(shù)領域】，具體涉及一種藥用菊葉薯蕷組培苗批一步成苗批量化生產(chǎn)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]薯蕷是一種多年生藤本植物，主要分布于亞洲(中國、印度、緬甸)和美洲(墨西哥、美國、巴西)的熱帶、亞熱帶地區(qū)，尤以中國和墨西哥居多。據(jù)記載，全球薯蕷科植物約650種,我國62種，墨西哥菊葉薯菌(D1scorea composite Hemsl.)是產(chǎn)量和阜素含量最聞的一個品種。
[0003]薯蕷屬植物(D1scorea)具有重要的藥用價值，其根莖皂甙元是目前世界上合成避孕藥、鎮(zhèn)疼消炎藥、麻醉藥、腎上腺皮質(zhì)激素、性激素以及蛋白同化激素等300多種甾體類藥物的起始原料，被醫(yī)藥界稱之為“藥用黃金”;在醫(yī)藥工業(yè)中占有重要地位。而且薯蕷塊莖中的淀粉是生產(chǎn)工業(yè)酒精的原料，也是一種較好的生物能源。
[0004]組培快繁是近些年來在種苗繁殖過程中應用得最為廣泛的一門新興實用技術(shù)，目前，世界上已有幾千種植物通過組織培養(yǎng)獲得成功，但能大量應用于生產(chǎn)并能產(chǎn)生經(jīng)濟效益的僅有幾十種，如香蕉、甘蔗、蘭花、非洲菊、馬鈴薯等。其主要原因有兩個方面:一是取決于市場需求及批量；二是生產(chǎn)的技術(shù)和成本。菊葉薯蕷的組培繁殖同其他種苗的組培繁殖一樣，提高煉苗成活率、建立高效穩(wěn)定的組培繁殖方法、降低生產(chǎn)成本就成了能否進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種高效低耗量的菊葉薯蕷組織培養(yǎng)方法，該方法配方效果佳，培養(yǎng)周期短，易操作，培養(yǎng)程序簡單，培養(yǎng)效率高，穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低，是一種在最短的時間內(nèi)獲得大量試管苗的快速繁殖方法。而且本發(fā)明方法不污染環(huán)境，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)，已達到產(chǎn)業(yè)化水平。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的:
[0007]藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，依次包括以下步驟:
[0008](I)外植體的選擇與接種:選用菊葉薯蕷幼嫩器官經(jīng)組織培養(yǎng)獲得的2?3cm高且生長健壯、長勢均勻、品質(zhì)良好的無菌試管苗為材料；然后將菊葉薯蕷無菌試管苗的葉片接種在 MS 大量 +2 XMS 微量 +MS 有機 +2 XMS 鐵鹽 +6-BA1.0 ?5.0mg/L+NAA0.2 ?0.8mg/L+IBA0.2?0.8mg/L+GA30.1?0.8mg/L+3%蔗糖+0.75%瓊脂固體培養(yǎng)基上，獲得根葉俱全的試管苗；
[0009](2)增殖生根:將步驟(I)獲得的不定芽轉(zhuǎn)接在MS+6-BA0.1?1.0mg/L+NAA0.2?
0.8mg/L+IBA0.2 ?0.8mg/L+GA30.1 ?0.8mg/L+ 矮壯素 0.5 ?1.0mg/L+3%蔗糖 +0.75%瓊脂的瓊脂固體培養(yǎng)基上進行增殖和生根；
[0010](3)試管苗移栽:試管苗出瓶移栽前，將根葉俱全的幼苗分成單株，出瓶的幼苗先用500?800倍的多菌靈或代森錳鋅浸泡10?15分鐘，隨后將幼苗移至有頂玻璃的移栽容器中，在溫度為20?30°C，濕度80?90%的條件下生長，25?30d長出新葉時，既已成活；
[0011](4)大田塊莖繁育:將移栽成活的幼苗，在自然條件煉苗3?5d后，移栽至大田進行塊莖繁育。
[0012]步驟⑴使用的培養(yǎng)基優(yōu)選:MS大量+2 X MS微量+MS有機+MS鐵鹽+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+3%蔗糖 +0.75% 瓊脂?；蛘邇?yōu)選:MS 大量 +2 XMS微量 +MS 有機 +MS 鐵鹽 +6-BA3.0mg/L+NAA0.6mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.3mg/L+3 % 蔗糖+0.75% 瓊脂。
[0013]步驟(I)中將無菌試管苗外植體葉片按I?2cmXl?2cm分成小塊。每瓶一般接種6-10塊。
[0014]步驟(2)使用的培養(yǎng)基優(yōu)選:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壯素 1.0mg/L+3 % 蔗糖 +0.75 % 瓊脂?；蛘邇?yōu)選:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壯素 1.0mg/L+3 %蔗糖 +0.75% 瓊脂。
[0015]步驟(I)葉片誘導出的不定芽增殖生根時，新芽莖段或頂芽去掉新葉，再分成I節(jié)I芽轉(zhuǎn)入增殖生根培養(yǎng)基中增殖生根。去掉的新葉又按照步驟(I)的方法接種。增殖生根時每隔25?30d繼代一次。
[0016]步驟(I)和(2)的培養(yǎng)溫度為24°C ±2，1000?20001x弱光環(huán)境中，每天10?12小時光照培養(yǎng)。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0018]1、利用無菌試管苗為外植體，穩(wěn)定性好、操作簡便，取材容易，不需經(jīng)過體外消毒，恢復期短；
[0019]2、無菌葉片在誘導培養(yǎng)基上能同步誘導不定芽和根；莖段在增殖生根培養(yǎng)基上能同步誘導側(cè)芽和不定根；
[0020]3、根據(jù)前人的研究，菊葉薯蕷的組織培養(yǎng)主要采用外植體-愈傷組織(誘導培養(yǎng))-分化幼苗(分化培養(yǎng))-生根(生根培養(yǎng))等多個培養(yǎng)程序完成，至少需要10d左右。本發(fā)明將初代與繼代、增殖與生根，多個培養(yǎng)程序簡化為一步完成，葉片僅需50?60天形成完整植株，帶芽莖段僅需25?30天形成完整植株。4?5個月內(nèi)可獲得大量完整植株，進行大規(guī)模工廠化育種。
[0021]3、大規(guī)模工廠化生產(chǎn)時，本發(fā)明根據(jù)生產(chǎn)需要設計培養(yǎng)方法，首先用葉片誘導大量不定芽，抑制根的形成，提高增殖倍數(shù)，加快基礎苗的繁殖；批量化生產(chǎn)階段同步誘導側(cè)芽和不定根，增殖與生根簡化為一步完成，即“一步成苗”方法，形成完整植株只需30天左右，節(jié)約了 25?30天的生根時間。
[0022]4、常規(guī)技術(shù)生產(chǎn)100萬株菊葉薯蕷組培苗，根據(jù)每瓶繼代苗形成10株用于生根的組培苗，需生產(chǎn)20萬瓶組培苗，其中包括10萬瓶繼代苗，10萬瓶生根苗。本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)100萬株菊葉薯蕷組培苗，僅需生產(chǎn)10萬瓶增殖生根苗。本發(fā)明不僅減少了無菌操作步驟，而且節(jié)約了培養(yǎng)室空間，簡化了健康種苗生產(chǎn)程序，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。
[0023]5、前人研究證明，菊葉薯蕷的人工馴化引種和離體培養(yǎng)快速繁殖的研究取得了較大的進展，但無菌短枝難生根、試管苗的移栽成活率很低，這兩大核心問題成為菊葉薯蕷組培快繁技術(shù)擴大化生產(chǎn)的瓶頸。本發(fā)明不僅創(chuàng)造出一步成苗方法，而且移栽成活率高(達90%以上)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為菊葉薯蕷初代培養(yǎng)無菌葉片同步誘導不定芽和根生長情況；
[0025]圖2為菊葉薯蕷繼代培養(yǎng)同步誘導側(cè)芽和不定根生長情況；
[0026]圖3為移栽成活的菊葉薯蕷試管苗生長情況；
[0027]圖4為移栽成活的菊葉薯蕷試管苗生長情況；
[0028]圖5為栽培當年(8個月左右)盾葉薯蕷試管苗的單株種莖生長情況。

【具體實施方式】
[0029]以下結(jié)合實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0030]在本發(fā)明所述的配方范圍內(nèi)效果均不錯，只是以下兩個實施例為進一步優(yōu)選的情況。
[0031]實施例1、組織培養(yǎng)快速繁殖菊葉薯蕷
[0032]一、培養(yǎng)基配制和滅菌
[0033]初代培養(yǎng)基:MS大量 +2 X MS 微量 +MS 有機 +MS 鐵鹽 +6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+3% 蔗糖 +0.75% 瓊脂；
[0034]增殖生根培養(yǎng)基:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壯素
1.0mg/L+3 %蔗糖+0.75%瓊脂。以上培養(yǎng)基121 °C下，滅菌20分鐘。
[0035]二、初代培養(yǎng)
[0036]取菊葉薯菌(D1scorea composite Hemsl.)無菌試管苗葉片，按I?2cmX I?2cm分成小塊，將葉片轉(zhuǎn)入裝有初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿外植體個數(shù)為6?10個，在下述培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng):24°C左右，每天10小時光照，光照強度為1000?20001x左右；培養(yǎng)8周左右，獲267個形成1-3個節(jié)的不定芽，誘導率達到85%以上，同步誘導不定芽和根生長情況如圖1所示。
[0037]三、繼代培養(yǎng)
[0038]取上述267個株系中的267個株系進行繼代繁殖，具體方法如下:將步驟二獲得的不定芽繼代培養(yǎng)時，新芽莖段或頂芽去掉新葉，再分成I節(jié)I芽轉(zhuǎn)入增殖生根培養(yǎng)基中，每隔25?30d繼代一次。每次繼代中，每個莖段或頂芽長出2-6cm高的叢生芽，同時從莖段基部長出1-5條根的完整植株。同步誘導側(cè)芽和不定根生長情況如圖2所示；培養(yǎng)條件同步驟二。新芽葉片繼續(xù)按I?2cmX I?2cm的規(guī)格分成小塊，接種在初代培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)8周后，75%葉片的長成l-5cm高的不定芽，同時從莖段基部長出1_5條根的完整植株。
[0039]四、試管苗移栽:
[0040]試管苗出瓶移栽前，將根葉俱全的幼苗分成單株，出瓶的幼苗先用500?800倍的多菌靈或代森錳鋅浸泡15分鐘，隨后將幼苗移至有頂玻璃的移栽容器中，在溫度為20?30°C，濕度80?90%的條件下生長，25?30d長出新葉時，既已成活，成活率達到90%以上，生長情況如圖3所示。栽培當年(8個月左右)，獲10g/株以上的優(yōu)質(zhì)種莖。試管苗田間生長情況如圖4和圖5所示。
[0041]五、大田塊莖繁育:
[0042]將移栽成活的幼苗，在自然條件煉苗3?5d后，移栽至大田進行塊莖繁育。
[0043]本發(fā)明所提供的菊葉薯蕷組織培養(yǎng)繁殖方法，無菌葉片為外植體，取材容易，數(shù)量大，遺傳穩(wěn)定性高，不需經(jīng)過體外消毒，恢復期短等優(yōu)勢。在初代培養(yǎng)過程中，能同步誘導不定芽和根，繁殖系數(shù)大。繼代培養(yǎng)階段，無菌葉片采用同步誘導不定芽和根的方法，莖段或頂芽采用同步誘導側(cè)芽和不定根的方法，不僅簡化了健康種苗生產(chǎn)程序，而且生產(chǎn)成本低。常規(guī)技術(shù)生產(chǎn)100萬株菊葉薯蕷組培苗，根據(jù)每瓶繼代苗形成10株用于生根的組培苗，需生產(chǎn)20萬瓶組培苗，其中包括10萬瓶繼代苗，10萬瓶生根苗。本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)100萬株菊葉薯蕷組培苗，僅需生產(chǎn)10萬瓶繼代生根苗。本發(fā)明不僅減少了無菌操作步驟，而且節(jié)約了培養(yǎng)室空間，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。而且菊葉薯蕷的無菌短枝難生根、試管苗的移栽成活率很低，這兩大核心問題成為菊葉薯蕷組培快繁技術(shù)擴大化生產(chǎn)的瓶頸。本發(fā)明不僅創(chuàng)造出一步成苗方法，而且移栽成活率高(達90%以上)。
[0044]實施例2、組織培養(yǎng)快速繁殖菊葉薯蕷
[0045]一、培養(yǎng)基配制和滅菌
[0046]初代培養(yǎng)基:MS大量 +2 X MS 微量 +MS 有機 +MS 鐵鹽 +6-BA3.0mg/L+NAA0.6mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.3Hig/!+3 % 蔗糖 +0.75 % 瓊脂。
[0047]繼代培養(yǎng)基:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壯素1.0mg/L+3 %鹿糖 +0.75% 瓊脂。
[0048]以上培養(yǎng)基121 °C下，滅菌20分鐘。
[0049]采用上述培養(yǎng)基配方，其它基本操作方法同實施例1 一致，效果與實施例1相當。
【權(quán)利要求】
1.藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，其特征在于，依次包括以下步驟: (1)外植體的選擇與接種:選用菊葉薯蕷幼嫩器官經(jīng)組織培養(yǎng)獲得的2?3cm高且生長健壯、長勢均勻、品質(zhì)良好的無菌試管苗為材料；然后將菊葉薯蕷無菌試管苗的葉片接種在 MS 大量 +2 X MS 微量 +MS 有機 +2 X MS 鐵鹽 +6-BA1.0 ?5.0mg/L+NAA0.2 ?0.8mg/L+IBA0.2?0.8mg/L+GA30.1?0.8mg/L+3%蔗糖+0.75%瓊脂固體培養(yǎng)基上，獲得根葉俱全的試管苗； (2)增殖生根:將步驟(I)獲得的不定芽轉(zhuǎn)接在MS+6-BA0.1?1.0mg/L+NAA0.2?0.8mg/L+IBA0.2 ?0.8mg/L+GA30.1 ?0.8mg/L+ 矮壯素 0.5 ?1.0mg/L+3%蔗糖 +0.75%瓊脂的瓊脂固體培養(yǎng)基上進行增殖和生根； (3)試管苗移栽:試管苗出瓶移栽前，將根葉俱全的幼苗分成單株，出瓶的幼苗先用500?800倍的多菌靈或代森錳鋅浸泡10?15分鐘，隨后將幼苗移至有頂玻璃的移栽容器中，在溫度為20?30°C，濕度80?90%的條件下生長，25?30d長出新葉時，既已成活； (4)大田塊莖繁育:將移栽成活的幼苗，在自然條件煉苗3?5d后，移栽至大田進行塊莖繁育。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，其特征在于，步驟⑴使用的培養(yǎng)基:MS大量+2XMS微量+MS有機+MS鐵鹽+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+3% 蔗糖 +0.75% 瓊脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，其特征在于，步驟⑴使用的培養(yǎng)基:MS大量+2XMS微量+MS有機+MS鐵鹽+6-BA3.0mg/L+NAA0.6mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.3mg/L+3% 蔗糖 +0.75% 瓊脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，其特征在于，步驟(I)中將無菌試管苗外植體葉片按I?2cmX I?2cm分成小塊。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，其特征在于，步驟(2)使用的培養(yǎng)基:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L+IBA0.2mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壯素 1.0mg/L+3%鹿糖 +0.75%瓊脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，其特征在于，步驟(2)使用的培養(yǎng)基:MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+IBA0.3mg/L+GA30.lmg/L+ 矮壯素 1.0mg/L+3%鹿糖 +0.75%瓊脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5或6所述的藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，其特征在于，步驟(I)葉片誘導出的不定芽增殖生根時，新芽莖段或頂芽去掉新葉，再分成I節(jié)I芽轉(zhuǎn)入增殖生根培養(yǎng)基中增殖生根。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，其特征在于，去掉的新葉又按照步驟(I)的方法接種。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，其特征在于，增殖生根時每隔25?30d繼代一次。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或5或6所述的藥用菊葉薯蕷組培一步成苗批量化生產(chǎn)的方法，其特征在于，步驟⑴和⑵的培養(yǎng)溫度為24°C ±2，1000?20001x弱光環(huán)境中，每天10?12小時光照培養(yǎng)。
【文檔編號】A01H4/00GK104221862SQ201410456600
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】黃麗芳, 史端甫, 賀龍澤 申請人:長沙縣龍澤農(nóng)業(yè)科技有限公司