一種油桐葉柄高效直接再生植株的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種油桐葉柄直接再生植株的方法,屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域。主要通過油桐葉柄直接誘導(dǎo)不定芽、繼代增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽等過程,不僅為快速繁殖優(yōu)良油桐植株提供了一條途徑,而且為以后通過基因工程的方法改良油桐的抗性、提高油桐產(chǎn)量及油脂質(zhì)量等性狀,以及為油桐遺傳體系的建立打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),為培育轉(zhuǎn)基因油桐提供更廣的途徑和技術(shù)支撐。
【專利說明】一種油桐葉柄高效直接再生植株的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于油桐細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及一種油桐葉柄高效直接再生植株的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 油桐（Vernicia fordii)為大戟科（Euphorbiaceae)油桐屬（Vernicia)植物的統(tǒng) 稱，是重要的工業(yè)油料樹種，與油茶、核桃和烏桕并稱我國四大木本油料樹種。從油桐種 子榨取的油稱為桐油，是世界上最優(yōu)質(zhì)的植物干性油，為油漆、印刷墨油的優(yōu)良原料。桐 油具有干燥快、附著力強(qiáng)、比重輕、富光澤、耐酸堿、耐高溫、抗凍裂、防水等優(yōu)良特性。此外， 桐油還是一種優(yōu)良涂料，是合成新型復(fù)合材料的基本原料，具有廣泛的用途。近年來，隨 著全球人口增加和經(jīng)濟(jì)的飛速增長，資源開發(fā)利用過度，發(fā)展油桐產(chǎn)業(yè)已迫在眉睫，如何 挖掘油桐這一寶貴資源在生物質(zhì)能源等領(lǐng)域的重要作用，推進(jìn)油桐規(guī)?；l(fā)展是當(dāng)前科 研工作者艱巨的任務(wù)，也是幫助山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的手段之一。目前，油桐的常規(guī)育苗方 法主要為實(shí)生苗及嫁接苗，嫁接苗雖然能夠保持母本的優(yōu)良性狀，但成本較高，不利于規(guī) 模化生產(chǎn)。同時(shí)，油桐枯萎病是我國油桐產(chǎn)區(qū)一種毀滅性病害，嚴(yán)重影響了油桐產(chǎn)業(yè)的穩(wěn) 定發(fā)展。通過組織培養(yǎng)可以快速繁殖油桐脫毒苗，在此基礎(chǔ)上通過遺傳體系轉(zhuǎn)化而獲得抗 病植株，在木本油料植物遺傳改良方面有廣闊的前景。
[0003] 油桐的離體培養(yǎng)研究很晚，到目前為止僅有以油桐離體葉片通過間接器官發(fā)生 途徑獲得再生植株的報(bào)道，但由于葉片較嫩，在農(nóng)桿菌侵染過程中特別容易受傷，再生活 性降低，對實(shí)現(xiàn)油桐的遺傳體系轉(zhuǎn)化產(chǎn)生很大的障礙，并且，葉片容易失水，對卡那霉素 的抗性較低，在卡那霉素篩選過程中容易死亡，而葉柄較葉片健壯，目前試驗(yàn)證明，葉柄 在侵染過程中不容易死亡，對卡那霉素的抗性較強(qiáng)，因此，葉柄在油桐遺傳體系轉(zhuǎn)化過程 中比葉片更有優(yōu)勢。同時(shí)，葉柄是莖中韌皮部和木質(zhì)部的延伸，它是由一層或多層沒有特 定功能的薄壁細(xì)胞組成，這些細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力。這些薄壁細(xì)胞對植物生長調(diào)節(jié) 劑和環(huán)境條件的變化非常敏感，因此，葉柄周圍的薄壁細(xì)胞比其它細(xì)胞更容易分化成新的 器官。利用植物離體器官直接再生不定芽不需經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)周期短，且在培養(yǎng) 過程中外植體不易發(fā)生變異的優(yōu)點(diǎn)在其他植物中已有報(bào)道，但油桐離體組織直接再生不 定芽比較少見。本發(fā)明人前期曾用離體油桐葉片來再生植株，當(dāng)用此相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng) 條件以及步驟在本發(fā)明的葉柄培養(yǎng)時(shí)并未取得很好的效果（如表1)。所以本發(fā)明重新考慮 以油桐無菌苗葉柄為外植體，尋求新的配方及培養(yǎng)條件，通過一步直接誘導(dǎo)不定芽、繼代 增殖、生根和煉苗移栽等過程，旨在建立一個高效穩(wěn)定的油桐葉柄離體快繁體系，為油桐 快速繁殖及遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵還在于能夠大大提高農(nóng)桿菌浸染實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的可能 性，為油桐快速繁殖及遺傳轉(zhuǎn)化提供更廣的途徑和技術(shù)支撐。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對目前油桐采用葉盤法直接誘導(dǎo)不定芽再生植株技術(shù)存在的 缺陷，在此基礎(chǔ)上，提供了一種油桐葉柄高效直接再生植株的方法，該方法利用油桐無菌 苗葉柄直接誘導(dǎo)出不定芽，其誘導(dǎo)率高，不定芽健壯，不定芽繼代增殖系數(shù)高，壯苗效果 好，生根率高，關(guān)鍵還在于能夠大大提高農(nóng)桿菌浸染實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的可能性。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的。
[0006] -種油桐葉柄直接再生植株的方法，包括以下步驟：
[0007] 將油桐無菌苗葉柄，在無菌條件下切成長為0.5-l.Ocm的葉柄，接種到 WPM+1. 0-4. Omg/L ΚΤ+0. 01-0. lmg/L NAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽，暗培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)到光照 條件下培養(yǎng)20-25天，培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/ d ;然后經(jīng)過繼代、增殖、壯苗和生根培養(yǎng)獲得完整植株；最后進(jìn)行煉苗、移栽。
[0008] 上述方法中增殖培養(yǎng)的具體過程如下：將葉柄誘導(dǎo)的不定芽切下接種到 WPM+2. 0-3. Omg/L ΚΤ+0. 05-0. lmg/L IBA+1. 0-2. Omg/L GA3 的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的繼代增 殖培養(yǎng)，暗培養(yǎng)3天后，在光照條件下培養(yǎng)20-35天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為 2100-22001x,光照時(shí)間 12-14h/d。
[0009] 上述方法中壯苗培養(yǎng)的具體過程如下：將增殖培養(yǎng)得到的芽轉(zhuǎn)接到WPM+0. 5mg/ LKT+1. 0-2. Omg/L NAA+2. Omg/L GA3的培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)1天后，在光照條件 下培養(yǎng)15-20天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/d。
[0010] 上述方法中生根培養(yǎng)的具體過程如下：將壯苗培養(yǎng)獲得2-4cm的苗接到 1/4MS+0. 1-0. 3mg/L IBA的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C ;暗培養(yǎng)3-5天， 再轉(zhuǎn)到光照下培養(yǎng)5-7天即可生根，光照強(qiáng)度為2100-22001X，光照時(shí)間12-14h/d。
[0011] 上述方法中煉苗、移栽的具體過程如下：
[0012] 將生根后的苗先在人工氣候箱中進(jìn)行移栽前煉苗，煉苗保持空氣相對濕度為 70-80%，3-5天后從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到營養(yǎng)杯中，基質(zhì)為泥炭土： 珍珠巖：黃土 = 2:1:1，用薄膜蓋住營養(yǎng)杯口，保持恒定的氣候條件，兩周后取出薄膜， 逐步進(jìn)行正常水肥管理。
[0013] 上述的油桐葉柄直接再生植株的方法優(yōu)選：
[0014] 葉柄誘導(dǎo)不定芽使用的培養(yǎng)基為：WPM+3. Omg/L KT+0. 05mg/L NAA ;
[0015] 增殖培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為：WPM+3. Omg/L KT+0. 05mg/L IBA+2. Omg/L GA3 ;
[0016] 所述的油桐無菌苗的獲得過程如下：
[0017] 選取成熟的油桐當(dāng)年生種子，取除種皮，將種仁用自來水沖洗5_8min，然后浸泡 15-20h，中間換水3-4次，然后在超凈工作臺中用0. 1%的HgCl2消毒3-5min，用無菌水 沖洗4-6次，接種在1/2MS基本培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-5天，再轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)20-30 天即可長大成苗；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/d。
[0018] 所述方法中用到的培養(yǎng)基均附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH調(diào)至5. 4-5. 8。
[0019] 本發(fā)明主要過程包括：油桐葉柄直接誘導(dǎo)不定芽，通過繼代增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、 生根培養(yǎng)、煉苗及移栽。該方法對油桐葉柄直接不定芽誘導(dǎo)率高，不定芽繼代增殖系數(shù)高， 壯苗效果好，生根率高；不僅為快速繁殖大量優(yōu)良油桐植株提供了一條新的技術(shù)途徑，而 且為以后通過基因工程的方法改良油桐抗性、培育抗病植株，提高油桐產(chǎn)量及油脂質(zhì)量等 性狀，以及為油桐遺傳體系的建立打下基礎(chǔ)。這為油桐從傳統(tǒng)的育種方式向分子育種方向 邁進(jìn)提供了可行性，為以后緩解生物能源短缺方面有著重要意義。
[0020] 此外，油桐離體組織直接再生不定芽比較少見。本發(fā)明的詳細(xì)優(yōu)勢總結(jié)如下：
[0021] 1、本發(fā)明采用的離體組織是葉柄，較健壯，在農(nóng)桿菌侵染過程中不容易死亡，對 卡那霉素的抗性也較強(qiáng)，因此，葉柄在油桐遺傳體系轉(zhuǎn)化過程中比葉片更有優(yōu)勢；
[0022] 2、葉柄是莖中韌皮部和木質(zhì)部的延伸，它是由一層或多層沒有特定功能的薄壁 細(xì)胞組成，這些細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞分裂能力。這些薄壁細(xì)胞對植物生長調(diào)節(jié)劑和環(huán)境條件 的變化非常敏感，因此，葉柄周圍的薄壁細(xì)胞比其它細(xì)胞更容易分化成新的器官；
[0023] 3、本發(fā)明采用離體葉柄直接再生植株，基本不會產(chǎn)生愈傷組織，葉柄接種23天 就可以長出不定芽，且芽體長勢正常、健壯，更有利于繼代增殖，比葉片誘導(dǎo)不定芽的時(shí) 間縮短了 23. 33%，這在轉(zhuǎn)基因過程中具有更大的可操作性。
[0024] 4、本發(fā)明通過油桐葉柄誘導(dǎo)的不定芽無論從長勢、芽體長度、葉片數(shù)量、葉片顏 色、芽的粗度及質(zhì)地等方面都要好于葉片誘導(dǎo)的不定芽（圖15-16)。由圖可知，葉片誘導(dǎo) 的不定芽雖然較密，芽體較多，但大部分芽畸形，沒有明顯的頂芽和莖，只長葉片，不利 于后期的繼代培養(yǎng)，因此，通過油桐葉柄誘導(dǎo)的不定芽生長健壯，主莖明顯，能過克服葉 片誘導(dǎo)不定芽的不足，從而為油桐遺傳改良提供了更廣的途徑。
[0025] 5、本發(fā)明人前期曾用離體油桐葉片來再生植株，當(dāng)用此相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條 件以及步驟在本發(fā)明的葉柄培養(yǎng)時(shí)并未取得很好的效果（如表1)。試驗(yàn)表明，用誘導(dǎo)葉片 的培養(yǎng)基配方對葉柄不定芽的誘導(dǎo)效果較差，主要原因是葉柄和葉片所含的營養(yǎng)成分及 內(nèi)源激素的含量是不同的。所以本發(fā)明重新考慮以油桐無菌苗葉柄為外植體，從培養(yǎng)基類 另IJ、植物生長調(diào)節(jié)劑種類等方面尋求新的配方及培養(yǎng)條件，通過一步直接誘導(dǎo)不定芽、繼 代增殖、生根和煉苗移栽等過程，旨在建立一個高效穩(wěn)定的油桐葉柄離體快繁體系，為油 桐快速繁殖及遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵還在于能夠大大提高農(nóng)桿菌浸染實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的可 能性，為油桐轉(zhuǎn)基因植株的培育提供更廣的途徑和技術(shù)支撐。
[0026] 表1植物生長調(diào)節(jié)劑對油桐葉片與葉柄不定芽誘導(dǎo)的影響
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種油桐葉柄直接再生植株的方法，其特征在于，包括以下步驟： 將油桐無菌苗葉柄，在無菌條件下切成長為0. 5-1. Ocm的葉柄，接種到 WPM+1. 0-4. Omg/L ΚΤ+0. 01-0. lmg/L NAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽，暗培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)到光照 條件下培養(yǎng)20-25天，培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/ d ;然后經(jīng)過繼代增殖、壯苗和生根培養(yǎng)獲得完整植株；最后進(jìn)行煉苗、移栽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐葉柄直接再生植株的方法，其特征在于，繼代培養(yǎng) 的具體過程如下：將葉柄誘導(dǎo)的不定芽切下接種到WPM+1. 0-2. Omg/L ΚΤ+0. 1-0. 5mg/L IBA+2. Omg/L GA3的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的繼代培養(yǎng)，暗培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)到光照條件下培 養(yǎng)10-20天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/d。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐葉柄直接再生植株的方法，其特征在于，增殖培養(yǎng)的具 體過程如下：將繼代培養(yǎng)得到的健壯不定芽切下接種到WPM+2. 0-3. Omg/L ΚΤ+0. 05-0. lmg/ LIBA+1. 0-2. Omg/L GA3的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的增殖培養(yǎng)，暗培養(yǎng)1天后，在光照條件下 培養(yǎng)20-35天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/d。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐葉柄直接再生植株的方法，其特征在于，壯苗培養(yǎng)的具 體過程如下：將增殖培養(yǎng)得到的芽轉(zhuǎn)接到WPM+0. 5mg/L KT+1. 0-2. 0mg/L NAA+2. 0mg/L GA3 的培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)1天后，在光照條件下培養(yǎng)15-20天；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001X，光照時(shí)間12-14h/d。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐葉柄直接再生植株的方法，其特征在于，生根培養(yǎng)的具 體過程如下：將壯苗培養(yǎng)獲得2-4cm的苗接到1/4MS+0. 1-0. 3mg/L IBA的培養(yǎng)基中進(jìn)行生 根培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C ;暗培養(yǎng)3-5天，再轉(zhuǎn)到光照下培養(yǎng)5-7天即可生根，光照 強(qiáng)度為2100-22001x,光照時(shí)間12-14h/d。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐葉柄直接再生植株的方法，其特征在于，煉苗、移栽的 具體過程如下： 將生根后的苗先在人工氣候箱中進(jìn)行移栽前煉苗，煉苗保持空氣相對濕度為 80%，3-5天后從培養(yǎng)瓶中取出，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到營養(yǎng)杯中，基質(zhì)為泥炭土：珍 珠巖：黃土 = 2:1:1，用薄膜蓋住營養(yǎng)杯口，保持恒定的氣候條件，兩周后取出薄膜，逐 步進(jìn)行正常水肥管理。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的油桐葉柄直接再生植株的方法，其特征在于，葉柄 誘導(dǎo)不定芽使用的培養(yǎng)基為：WPM+3. 0mg/L KT+0. 05mg/L NAA。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的油桐葉柄直接再生植株的方法，其特征在于，增殖 培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基為：WPM+3. 0mg/L KT+0. 05mg/L IBA+2. 0mg/L GA3。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐葉柄直接再生植株的方法，其特征在于，所述的油桐無 菌苗的獲得過程如下： 選取成熟的油桐當(dāng)年生種子，取除種皮，將種仁用自來水沖洗5-8min，然后浸泡 15-20h，中間換水3-4次，然后在超凈工作臺中用0. 1%的HgCl2消毒3-5min，用無菌水 沖洗4-6次，接種在1/2MS基本培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-5天，再轉(zhuǎn)到光照條件下培養(yǎng)20-30 天即可長大成苗；培養(yǎng)溫度為26 士 1°C，光照強(qiáng)度為2100-22001x，光照時(shí)間12-14h/d。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的油桐葉柄直接再生植株的方法，其特征在于，所述方法中 用到的培養(yǎng)基均附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH調(diào)至5. 4-5. 8。
【文檔編號】A01H4/00GK104054579SQ201410327567
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】譚曉風(fēng), 李澤, 張琳, 盧錕, 龍洪旭, 袁軍, 林青, 吳玲利, 曾艷玲 申請人:中南林業(yè)科技大學(xué)