一種對(duì)果蠅實(shí)施低溫麻醉的方法
【專利摘要】一種對(duì)果蠅實(shí)施低溫麻醉的方法，屬于遺傳學(xué)及發(fā)育生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。通過該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)遺傳學(xué)中重要模式生物果蠅的高生物安全性和環(huán)境友好性的麻醉，該麻醉操作簡(jiǎn)單，果蠅麻醉時(shí)間可控，麻醉后果蠅的壽命及繁殖能力不受影響。其是在-15攝氏度～-5攝氏度的環(huán)境溫度下對(duì)果蠅進(jìn)行麻醉，麻醉時(shí)間為25～35秒，然后將麻醉后的果蠅轉(zhuǎn)移到0攝氏度～5攝氏度的環(huán)境溫度中，20分鐘內(nèi)完成對(duì)果蠅的后續(xù)觀測(cè)與操作；最后將果蠅轉(zhuǎn)移到室溫環(huán)境下，實(shí)現(xiàn)果蠅的蘇醒、后續(xù)培養(yǎng)及觀測(cè)。本發(fā)明通過程序化控制環(huán)境溫度，在保證果蠅處于麻醉狀態(tài)之余，避免果蠅體內(nèi)因低溫時(shí)間過長形成冰晶而損害果蠅的生理健康、壽命和繁殖能力。
【專利說明】一種對(duì)果蠅實(shí)施低溫麻醉的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于遺傳學(xué)及發(fā)育生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種對(duì)果蠅實(shí)施低溫麻醉的方法，通過該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)遺傳學(xué)中重要模式生物果蠅的高生物安全性和環(huán)境友好性的麻醉，該麻醉操作簡(jiǎn)單，果蠅麻醉時(shí)間可控，麻醉后果蠅的壽命及繁殖能力不受影響。
【背景技術(shù)】
[0002]黑腹果蜆(Drosophilamelanogaster),昆蟲綱，雙翅目，果蜆科。是目前人類研究的最徹底的生物之一，它本身具有繁殖快、代時(shí)短、子代多等特點(diǎn)，基因測(cè)序已完成，是重要的遺傳學(xué)研究模式生物，在遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)及科研中具有重要的地位。以果蠅為對(duì)象的科研及教學(xué)活動(dòng)中需要對(duì)果蠅進(jìn)行麻醉，麻醉后的果蠅可以通過人工篩選進(jìn)行多種后續(xù)實(shí)驗(yàn)和研究。麻醉技術(shù)需要兼顧動(dòng)物從接觸麻醉操作到失去運(yùn)動(dòng)能力的時(shí)間(麻醉時(shí)間)，動(dòng)物保持麻醉狀態(tài)的時(shí)間(麻醉持續(xù)時(shí)間)、動(dòng)物脫離麻醉狀態(tài)的時(shí)間(蘇醒時(shí)間)，動(dòng)物經(jīng)過麻醉操作后的生存能力(存活率)。
[0003]目前國內(nèi)及國際上對(duì)果蠅的麻醉方法主要有5種，乙醚麻醉、乙醇麻醉、乙酸乙酯麻醉、二氧化碳麻醉以及低溫麻醉。
[0004]國內(nèi)目前普遍采用乙醚麻醉技術(shù)實(shí)現(xiàn)果蠅的麻醉，乙醚麻醉技術(shù)較為傳統(tǒng)和經(jīng)典，但是隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，乙醚麻醉的缺點(diǎn)及安全隱患逐漸顯現(xiàn)，具體體現(xiàn)為:1)乙醚是一種麻醉劑，在使用過程中除可以麻醉果蠅之外，對(duì)操作者身體健康有一定危害，容易造成操作者頭暈、惡心等中毒癥狀；2)乙醚是一種易揮發(fā)易燃易爆有機(jī)試劑，其密度大于空氣，即使保持實(shí)驗(yàn)過程 中的良好通風(fēng)，也不能完全避免乙醚對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者的傷害和燃爆隱
[0005]國際上目前普遍采用二氧化碳麻醉技術(shù)實(shí)現(xiàn)果蠅的麻醉，二氧化碳是較為成熟的果蠅麻醉方法，目前有二氧化碳果蠅麻醉槍，有相關(guān)的試驗(yàn)設(shè)備及操作方法，但是需要的設(shè)備成本較高，而且二氧化碳比重大于空氣，且屬于呼吸抑制劑，操作過程中同樣需要保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境良好通風(fēng)，并且要求實(shí)驗(yàn)過程中隨時(shí)監(jiān)控環(huán)境二氧化碳濃度，或者氧濃度，生物安全度和環(huán)境友好性不足。
[0006]乙醇麻醉時(shí)果蠅的個(gè)體差異較為明顯，難于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作和推廣；乙酸乙酯麻醉與乙醚麻醉效果及局限性相似，同樣存在因揮發(fā)性較大，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者身體有損傷，生物安全性及環(huán)境友好度不夠的缺點(diǎn)。
[0007]與上述果蠅麻醉方法相比，低溫麻醉具有環(huán)境友好性和安全性，有研究指出黑腹果蠅具有較好的低溫抗性，研究中發(fā)現(xiàn)低溫可以誘使黑腹果蠅出現(xiàn)麻醉癥狀，低溫麻醉的黑腹果蠅可以在室溫下蘇醒，存活并可以產(chǎn)生后代。目前對(duì)果蠅進(jìn)行低溫麻醉時(shí)，需要先將果蠅麻醉瓶長時(shí)間放置在低溫環(huán)境中，果蠅麻醉后在室溫下迅速蘇醒(時(shí)間小于120秒)，果蠅保持在麻醉狀態(tài)時(shí)間過短，蘇醒過快，不利于以果蠅為對(duì)象的科研及教學(xué)活動(dòng)的進(jìn)行，所以到目前為止沒有果蠅的低溫麻醉技術(shù)及設(shè)備投入科研及教學(xué)使用。關(guān)于果蠅的低溫研究，目前主要集中在馴化果蠅適應(yīng)低溫，利用低溫對(duì)果蠅進(jìn)行保存和收藏。[0008]這種情況下，探索可適用于多數(shù)生物實(shí)驗(yàn)室的、安全有效的果蠅麻醉方法，消除生物實(shí)驗(yàn)室潛在的安全隱患，具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種果蠅麻醉方法，該麻醉方法利用果蠅驟然進(jìn)入低溫環(huán)境時(shí)的“假死”，離開低溫環(huán)境后迅速恢復(fù)活動(dòng)能力的生理機(jī)制，對(duì)果蠅實(shí)現(xiàn)麻醉時(shí)間可控的麻醉操作，為以果蠅為對(duì)象的科研和教學(xué)工作提供生物安全的、環(huán)境友好的果蠅麻醉方法。
[0010]本發(fā)明是通過設(shè)置一種程序化的低溫操作流程，實(shí)現(xiàn)果蠅的迅速麻醉、麻醉狀態(tài)保持、以及麻醉狀態(tài)解除的果蠅麻醉方法。通過程序化控制環(huán)境溫度，在保證果蠅處于麻醉狀態(tài)之余，避免果蠅體內(nèi)因低溫時(shí)間過長形成冰晶而損害果蠅的生理健康、壽命和繁殖能力。
[0011]本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)方法如下:
[0012]I)在-15攝氏度~-5攝氏度的環(huán)境溫度下對(duì)果蠅進(jìn)行麻醉，麻醉時(shí)間為25~35秒；
[0013]2)然后將麻醉后的果蠅轉(zhuǎn)移到O攝氏度~5攝氏度的環(huán)境溫度中，20分鐘內(nèi)完成對(duì)果蠅的后續(xù)觀測(cè)與操作；
[0014]3)最后將步驟2)的果蠅轉(zhuǎn)移到室溫環(huán)境下，實(shí)現(xiàn)果蠅的蘇醒、后續(xù)培養(yǎng)及觀測(cè)。
[0015]前面方法步驟I)中所述的-15攝氏度~-5攝氏度的環(huán)境溫度以及步驟2)中所述的O攝氏度~5攝氏度的 環(huán)境溫度可以通過壓縮機(jī)制冷或半導(dǎo)體制冷實(shí)現(xiàn)，環(huán)境溫度傳遞及維系的冷媒可以是空氣也可以是溶液；溶液包括水，水與甲醇、乙醇、乙二醇、甘油、氯化鈣、磷酸二氫鹽或亞硅酸鹽等化學(xué)物質(zhì)的混合溶液，混合溶液中的各個(gè)組成成分的比例可以參考相關(guān)的物理化學(xué)手冊(cè)。
[0016]一般情況下，果蠅保存在培養(yǎng)瓶中。當(dāng)將果蠅進(jìn)行麻醉時(shí)，需要將果蠅從原來的培養(yǎng)瓶中按照標(biāo)準(zhǔn)操作轉(zhuǎn)移到麻醉瓶內(nèi)。所述的標(biāo)準(zhǔn)操作是:首先輕敲果蠅培養(yǎng)瓶使得培養(yǎng)瓶內(nèi)果蠅落到培養(yǎng)瓶底部，迅速打開培養(yǎng)瓶塞子，將培養(yǎng)瓶與麻醉瓶的瓶口對(duì)接，保持瓶口對(duì)接狀態(tài)使得麻醉瓶垂直立于培養(yǎng)瓶之下，麻醉瓶瓶口垂直向上，培養(yǎng)瓶瓶口向下，輕敲麻醉瓶，果蠅落到麻醉瓶底部，迅速移開果蠅培養(yǎng)瓶，將麻醉瓶塞子塞好，從而完成果蠅轉(zhuǎn)移到果蠅麻醉瓶中的操作。麻醉瓶、培養(yǎng)瓶一般是玻璃的。
[0017]上述方法中，步驟2)是在O攝氏度~5攝氏度的實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)面上完成對(duì)果蠅的后續(xù)觀測(cè)與操作，這里的觀測(cè)即對(duì)果蠅遺傳狀態(tài)進(jìn)行觀測(cè)，主要包括果蠅眼睛(紅眼、白眼、棒眼)、翅膀(長翅、殘翅、小翅)、體色(黑檀體、黑體、黃身)、剛毛(直剛毛、焦剛毛)等；所述的操作包括對(duì)上述各種遺傳狀態(tài)的果蠅進(jìn)行分別計(jì)數(shù)、測(cè)量果蠅體長、稱量果蠅體重、分辨及選擇雌雄果蠅等。
[0018]與【背景技術(shù)】相比:
[0019]I)本發(fā)明所述的程序化低溫果蠅麻醉技術(shù)避免采用具有易燃、易揮發(fā)性質(zhì)的有機(jī)試劑作為麻醉劑，避免了麻醉劑使用時(shí)的安全隱患和對(duì)操作人員的身體傷害；
[0020]2)程序化低溫果蠅麻醉技術(shù)在麻醉果蠅時(shí)采用的環(huán)境溫度低于零攝氏度，不需要對(duì)果蠅麻醉瓶進(jìn)行長時(shí)間預(yù)冷，提高了實(shí)驗(yàn)操作的效率，降低了實(shí)驗(yàn)操作的難度，使得果蠅在近生理的條件下驟遇低溫，生理性觸發(fā)果蠅的“假死”機(jī)制，時(shí)間進(jìn)程小于30秒，以麻醉后的果蠅的壽命和繁殖能力做考察對(duì)象，證實(shí)該低溫環(huán)境對(duì)果蠅生理機(jī)能影響降至最低；[0021 ] 3)程序化低溫果蠅麻醉技術(shù)將麻醉后的果蠅放置在O~5攝氏度溫度區(qū)間的微型環(huán)境中不大于20分鐘，確保對(duì)麻醉后的果蠅有充分的時(shí)間進(jìn)行后續(xù)操作與觀測(cè)，以麻醉后的果蠅的壽命和繁殖能力做考察對(duì)象，證實(shí)該溫度下該時(shí)間段內(nèi)，環(huán)境溫度對(duì)果蠅生理機(jī)能影響降至最低；
[0022]4)完成麻醉狀態(tài)下操作的果蠅轉(zhuǎn)移到常溫培養(yǎng)瓶中，自然恢復(fù)果蠅環(huán)境溫度，實(shí)現(xiàn)果蠅蘇醒，果蠅蘇醒快速，壽命和繁殖能力不受程序低溫麻醉操作影響。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1
[0024]根據(jù)表1和具體果蠅麻醉后操作時(shí)間需要，按照果蠅低溫麻醉環(huán)境溫度的需求進(jìn)行冷媒選擇和冷媒含量計(jì)算。本實(shí)施例中選擇乙醇-水混合物作為冷媒,通過乙醇的不同添加量，可以實(shí)現(xiàn)不同的冷媒最低傳質(zhì)溫度。計(jì)算公式為AT = -1.86XbB，其中bB為一千克水中添加的乙醇的摩爾數(shù)，AT為冷媒理論最低傳質(zhì)溫度，而所設(shè)置的低溫麻醉溫度(即果蠅麻醉瓶所處冷媒提供的環(huán)境溫度)要比冷媒理論最低傳質(zhì)溫度高2~3攝氏度。
[0025]如在I千克水中添加10.16摩爾乙醇即配制36.1 %的乙醇-水溶液，就可以實(shí)現(xiàn)-18.9攝氏度的冷媒理論最低傳質(zhì)溫度，以乙醇-水混合物作為冷媒能保證在我們進(jìn)行果蠅麻醉操作時(shí)(-15攝氏度~-5攝氏度)冷媒體系穩(wěn)定且不結(jié)冰。本實(shí)施例中，按照表1中所示乙醇-水混合冷媒的乙醇體積百分比含量配制各個(gè)操作溫度下的冷媒，進(jìn)行后續(xù)溫度相關(guān)研究。
[0026]表1表明了果蠅 分別在O攝氏度、-5攝氏度、-10攝氏度及-15攝氏度麻醉30秒后轉(zhuǎn)移到室溫環(huán)境下的蘇醒時(shí)間和蘇醒后培養(yǎng)24小時(shí)的存活情況，如表1所示，麻醉30秒時(shí)，在各個(gè)溫度下(除O攝氏度外)果蠅都能被全部麻醉，而麻醉后的果蠅轉(zhuǎn)移到室溫后蘇醒所需時(shí)間的長短與果蠅麻醉溫度有關(guān)。100秒到250秒后，蘇醒的果蠅就會(huì)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)與飛行。進(jìn)行果蠅的觀測(cè)與操作時(shí)，觀測(cè)與操作的時(shí)間不能大于果蠅蘇醒所需要的時(shí)間，100秒到250秒的觀測(cè)與操作時(shí)間，很難滿足多數(shù)操作者的操作需求。本發(fā)明中對(duì)果蠅進(jìn)行麻醉的溫度應(yīng)該在-15攝氏度~-5攝氏度之間。
[0027]實(shí)施例2
[0028]表2表明了果蠅麻醉后在O攝氏度、-5攝氏度、-10攝氏度及-15攝氏度繼續(xù)保持600秒(10分鐘)及1200秒(20分鐘)后立即轉(zhuǎn)移到室溫時(shí)的果蠅蘇醒所需時(shí)間及果蠅的24小時(shí)存活率。如表2所示，除O攝氏度外，雖然保存溫度降低后，果蠅在室溫的蘇醒時(shí)間也有所延長，但是果蠅也隨著保存溫度的降低出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，果蠅死亡不利于以果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的后續(xù)研究。
[0029]實(shí)施例3
[0030]如表1、表2所示，無論是將麻醉后的果蠅立即轉(zhuǎn)移到室溫后，還是將果蠅麻醉后再保持一定時(shí)間，都不能夠滿足以果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的后續(xù)研究工作(一個(gè)是蘇醒時(shí)間短，一個(gè)是果蠅存活率低)。
[0031]因此，我們發(fā)展了本發(fā)明所述的新的果蠅麻醉技術(shù)，即將果蠅低溫麻醉后，再放置在O~5攝氏度的低溫環(huán)境內(nèi)保持一段時(shí)間(如表3)，進(jìn)行后續(xù)觀測(cè)與操作后，再放入室溫環(huán)境實(shí)現(xiàn)果蠅的蘇醒。操作人員可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)技術(shù)及實(shí)驗(yàn)操作所需要的操作時(shí)間，選擇果蠅麻醉溫度(-5攝氏度、-10攝氏度及-15攝氏度)、麻醉后果蠅的低溫保溫溫度(O~5攝氏度)及低溫保溫時(shí)間(10~20分鐘)。
[0032]具體的技術(shù)方案如下:
[0033]1、通過控制在水中加入乙醇的量來實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境溫度的控制，從而實(shí)現(xiàn)O攝氏度、-5攝氏度、-10攝氏度或-15攝氏度冷媒環(huán)境的程序控溫；
[0034]2、將果蠅從培養(yǎng)瓶中按照標(biāo)準(zhǔn)操作轉(zhuǎn)移到麻醉瓶中，將麻醉瓶裝載在由熱的不良導(dǎo)體材料構(gòu)建的果蠅麻醉瓶托架上，通過托架將果蠅麻醉瓶迅速浸入上述不同溫度的冷媒中，保證麻醉瓶從浸入冷媒到離開冷媒的時(shí)間為30秒；
[0035]3、將麻醉瓶內(nèi)的果蠅迅速轉(zhuǎn)移到溫度為O~5攝氏度的果蠅操作臺(tái)上，在20分鐘內(nèi)完成對(duì)果蠅的后續(xù)操作和觀測(cè)。
[0036]對(duì)于一般的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)而言，果蠅在零下5攝氏度麻醉其麻醉時(shí)間和蘇醒時(shí)間基本可以滿足實(shí)驗(yàn)操作所需，此時(shí)按照表1所示，冷媒中的乙醇體積百分比含量為18~20 %，此濃度的乙醇不具有燃燒、爆炸等潛在危險(xiǎn)，也不具有環(huán)境威脅性，具有較高的生物安全性和環(huán)境友好性。
[0037]表1:實(shí)施例1的低溫-瞬時(shí)麻醉效果對(duì)比
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種對(duì)果蠅實(shí)施低溫麻醉的方法，其步驟如下: 1)在-15攝氏度~-5攝氏度的環(huán)境溫度下對(duì)果蠅進(jìn)行麻醉，麻醉時(shí)間為25~35秒； 2)然后將麻醉后的果蠅轉(zhuǎn)移到O攝氏度~5攝氏度的環(huán)境溫度中，20分鐘內(nèi)完成對(duì)果蠅的后續(xù)觀測(cè)與操作； 3)最后將步驟2)的果蠅轉(zhuǎn)移到室溫環(huán)境下，實(shí)現(xiàn)果蠅的蘇醒、后續(xù)培養(yǎng)及觀測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種對(duì)果蠅實(shí)施低溫麻醉的方法，其特征在于:所述的環(huán)境溫度是通過壓縮機(jī)制冷或半導(dǎo)體制冷實(shí)現(xiàn)的，環(huán)境溫度傳遞及維系的冷媒是空氣或溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的一種對(duì)果蠅實(shí)施低溫麻醉的方法，其特征在于:溶液為水、水與甲醇、水與乙醇、水與乙二醇、水與甘油、水與氯化鈣、水與磷酸二氫鹽或水與亞硅酸鹽的混合溶液。
4.如權(quán)利要求1所述的一種對(duì)果蠅實(shí)施低溫麻醉的方法，其特征在于:步驟2)是在O攝氏度~5攝氏度的實(shí)驗(yàn) 操作臺(tái)面上完成。
【文檔編號(hào)】A01K67/033GK104012475SQ201410267683
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】周杰, 張雪蘭, 劉艷, 呂明, 孟令軍, 權(quán)宇彤, 王亞文, 孟慶繁, 滕利榮 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)