莧色藜抗病性相關(guān)基因ChaNDR1a及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一種莧色藜抗病性相關(guān)蛋白ChaNDR1a，其具有序列2所示的氨基酸序列。同時，本發(fā)明還公開了編碼上述蛋白的DNA分子、含有上述DNA分子的重組表達載體以及表達上述DNA分子的宿主細胞。此外，本發(fā)明還公開了制備上述DNA分子的方法、特異性擴增上述DNA分子的引物以及上述DNA分子在提高植物抗病性中的應(yīng)用。本發(fā)明在揭示了莧色藜ChaNDR1a基因具有抗病性特性的基礎(chǔ)上，不僅為進一步揭示莧色藜高效、廣譜的抗病性分子機制奠定了基礎(chǔ)，也進一步提高了莧色藜作為廣泛應(yīng)用的枯斑寄主，在植物抗病性中的應(yīng)用。
【專利說明】莧色藜抗病性相關(guān)基因ChaNDRIa及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及莧色藜抗病性相關(guān)基因ChaNDRla及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]1995年，Centry等人在研究擬南芥與丁香假單胞菌(Pst)之間的互作時，發(fā)現(xiàn)了一個可能涉及擬南芥抗病途徑的基因，由于其具有非小種?；共⌒?，故命名為((non-race-specific disease resistancel, NDR1)。
[0003]NDRl基因位于擬南芥第三條染色體上，限制性片段長度多態(tài)性(RestrictionFragment Length Polymorphism, RFLP)標記出其位于 g6220 與 g4711 之間的 8.5 厘摩(cM)(Century, 1995)。NDRl蛋白是一個質(zhì)膜蛋白，它經(jīng)歷了幾個翻譯后修飾，包括羧基末端處理和氨基端糖基化(Century, 1997 ；Coppinger et al.，2004)?；蚪MDNA序列分析顯示，NDRl含有一個單一的660個堿基對的開放閱讀框(ORF) (Century, 1997)。
[0004]Coppinger等(2004)通過序列分析預(yù)測NDRl是一個C-末端糖基肌醇(GPI)錨定蛋白，并通過選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜法(SM-MS)得到驗證。NDRl蛋白結(jié)構(gòu)中的ω位點、斷裂位點和疏水尾巴為GPI錨定蛋白的基本特點。 [0005]Kn印per等(2011)通過與哺乳動物整合素蛋白LEA14進行同源建模，預(yù)測了 NDRl蛋白的高級結(jié)構(gòu)。對預(yù)測結(jié)果進行進一步分析發(fā)現(xiàn)該蛋白與涉及信號感知和先天免疫反應(yīng)的哺乳動物整合素蛋白具有幾個極其相似之處。進一步的模擬表明NDRl的主要核心結(jié)構(gòu)與膜結(jié)合亞單位(即纖連蛋白域)FNIII具有很強的相似性，NDRl和整合的假定跨膜結(jié)構(gòu)域都連接到一個大的單一 β -片上(Hynes, 2009)。根據(jù)相鄰的三個氨基酸的α -螺旋結(jié)構(gòu),確定了在溶劑中暴露的氨基酸178至180位置存在的一個類似整合素蛋白Arg-Gly-Asp (RGD)的NGD結(jié)構(gòu)域(Asn-Gly-Asp)。在宿主-真菌互作中，防御信號中的NGD域是一個潛在的配體結(jié)合位點，該位點涉及質(zhì)膜細胞壁粘附(Manning et al.，2008 ；Dodds et al.，2009)。此外，據(jù)推測NGD位點也是病原菌效應(yīng)蛋白和分泌系統(tǒng)的靶標和作用模式，大概是通過破壞細胞壁質(zhì)膜粘著斑而方便病原體進入(Wang et al.，2009)。
[0006]通過突變實驗表明，NDRl是一個重要的誘導(dǎo)防御反應(yīng)的抗性基因，并具有非小種?；共⌒?Century，1995)。在過去的十多年中，通過闡明NDRl參與的遺傳相互作用，發(fā)現(xiàn)NDRl參與了植物防御信號，并作為防御信號激活所需的核心元件，激活CC-NB-LRR類R蛋白(Aarts et al.，1998)。
[0007]擬南芥突變體ndrl-Ι植株中，由細菌引起的水楊酸(salicylic acid, SA)或通過UV-C光或缺氧產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species,R0S)都被減弱了，并且在由細菌或ROS誘導(dǎo)的SAR也受損，但外源SA類似物BTH誘導(dǎo)的SAR不受影響。從而表明，NDRl在ROS的下游和SA的上游發(fā)揮功能(Shapiro, 2001)。
[0008]通過擬南芥突變體ndrl-Ι的感病性檢測，NDRl對攜帶無毒基因avrB, avrRpml, avrRpt2和avrPph3中任何一個的丁香假單胞菌具有抗性(Century, 1995)。同時，NDRl基因的突變嚴重削弱了擬南芥在響應(yīng)攜帶無毒基因avrRpt2的丁香假單胞菌時，HR和SAR的誘導(dǎo)能力，也降低了突變體植株P(guān)Rl基因的表達水平(Shapiro，2001)。Coppinger等人通過研究轉(zhuǎn)基因技術(shù),在擬南芥的ndrl_l突變體中過量表達NDR1,可以增強擬南芥抵御一些細菌的能力，如番茄丁香假單胞菌，但對非細菌性病原菌的抗性增強不明顯，如蕪菁皺縮病毒和白粉病。
[0009]通過抗病基因工程來研究NDRl的功能也有所報道。竇道龍等(2003)通過構(gòu)建植物高效表達載體PNDR，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將從擬南芥Wassilewskija生態(tài)型中克隆到的NDRl基因轉(zhuǎn)化到煙草中。獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株后，選取PCR陽性植株進行Southern雜交分析，結(jié)果證實NDRl基因已整合到受體基因組中。然后，利用離體葉片鑒定了 10株轉(zhuǎn)基因煙草對赤星病和晚疫病的抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中有3株抗性顯著提高(接種I周時，僅在葉片摩擦部位形成壞死)，而且表達該基因的煙草沒有種屬專一性。
[0010]人們從擬南芥中發(fā)現(xiàn)了 45個與NDRl和HINl (煙草中與NDRl序列相似的抗病基因)相關(guān)的基因，這些基因?qū)儆贜HL(似NDR1/HIN1)大家族。這些基因不同程度地參與了植物防御途徑，如NHLlO 在黃瓜花葉病毒引起的過敏反應(yīng)中被誘導(dǎo)表達。
[0011]由此可見，NDRl基因確實參與了植物的抗病反應(yīng)，而且與NDRl序列相似的基因也可能具有抗病性，這為廣泛克隆并研究植物抗病基因奠定了基礎(chǔ)。
[0012]近年來，人們對其它植物中的NDRl同源基因的抗病性也做了一定的研究。例如，Cacas等人從咖啡中克隆到了與擬南芥NDRl功能上同源的基因CaNDRla，將該基因在擬南芥ndrl-Ι突變體中過量表達,能恢復(fù)擬南芥對丁香假單胞菌的抗性(Cacas et al., 2011) ?同時，他們還通過瞬時表達系統(tǒng)，確定CaNDRla蛋白和擬南芥NDRl蛋白一樣也通過C末端處理定位于質(zhì)膜上，且與類似RIN4的蛋白互作，從而證明了 NDRl蛋白在咖啡和擬南芥之間的功能上和生化特性上的保守性。
[0013]Lu等(2013)克隆了柑橘中的NDRl同源基因，即CsNDRl，并證實過表達CsNDRl能彌補擬南芥突變體ndrl-Ι對丁香假單胞菌的抗性，也能增強對卵菌綱病原體Hyaloperonospora arabidopsidis的抗性。這種過表達與SA產(chǎn)物的增加和防御標記蛋白PATHOGENESIS RELATED I (PRl)的表達正相關(guān)，這說明CsNDRl的過表達可激活SA介導(dǎo)的防御信號，從而導(dǎo)致廣譜抗病性的產(chǎn)生。此外，他們還發(fā)現(xiàn)，在感染與柑橘火龍病相關(guān)的細菌病原體Candidatus Liberibacter的柑橘中，能誘導(dǎo)溫和的PRl的表達和SA的積累，從而進一步證實CsNDRl是擬南芥NDRl的一個功能性同源基因。
[0014]覓色藜(Chenopodium amaranticolor)是一年生覓科藜屬的草本植物(2n = 6x, x=9),可與多種植物病毒發(fā)生超敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR),是廣泛應(yīng)用于植物病毒學(xué)研究中一種枯斑寄主。據(jù)統(tǒng)計，莧色藜與至少16個植物病毒屬的多種病毒互作，誘發(fā)HR,例如,黃瓜花葉病毒、大S.花葉病毒、煙草花葉病毒、馬鈴薯Y病毒等危害嚴重的植物病毒，表現(xiàn)顯著的抗病毒特性。莧色藜在初始侵染葉片上產(chǎn)生局部枯斑，通過HR將初始侵染的病毒殺死，完全限制病毒的系統(tǒng)擴散。盡管莧色藜是植物病毒研究中廣泛應(yīng)用的枯斑寄主，但其高效、廣譜的抗病性分子機制迄今尚未深入研究，嚴重限制了莧色藜在植物抗病性中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0015]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明一方面提供了一種莧色藜抗病性相關(guān)蛋白ChaNDRla，其具有序列2所示的氨基酸序列。
[0016]本發(fā)明另一方面提供了編碼上述蛋白的DNA分子。
[0017]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，編碼上述蛋白的DNA分子具有序列I所示的核苷酸序列。
[0018]本發(fā)明另一方面提供了含有上述DNA分子的重組表達載體。
[0019]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，上述重組表達載體為pCAM-35S-GFP_ChaNDRla或pCAMBIA2300-ChaNDRlao
[0020]本發(fā)明另一方面提供了表達上述DNA分子的宿主細胞。
[0021]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，上述宿主細胞為農(nóng)桿菌，更加優(yōu)選為農(nóng)桿菌EHA105菌株或LBA4404菌株。
[0022]本發(fā)明另一方面提供了制備上述DNA分子的方法，其包括以下步驟:
[0023]1、提取莧色藜總RNA并合成cDNA ;
[0024]2、利用莧色藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)資源，設(shè)計特異性引用，通過RT-PCR，獲得擴增產(chǎn)物，其中特異性引物優(yōu)選具有序列3和序列4所示的核苷酸序列；
[0025]3、將擴增產(chǎn)物與T載體連接，優(yōu)選PMD18-T載體，對擴增產(chǎn)物進行測序分析，獲得所述DNA分子。
[0026]本發(fā)明另一方面提供了一種特異性擴增莧色藜抗病性相關(guān)基因ChaNDRla的引物，其具有序列3和序列4所示的核苷酸序列。
[0027]本發(fā)明再一方面提供了本發(fā)明上述DNA分子在提高植物抗病性中的應(yīng)用。
[0028]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，上述病原體為TMV或CMV。
[0029]本發(fā)明從廣譜抗病性植物莧色藜中克隆了與擬南芥NDRl同源的基因，即ChaNDRla基因。同時，在明確了 ChaNDRla表達量分析和亞細胞定位的基礎(chǔ)上，通過ELISA檢測了轉(zhuǎn)基因T1代煙草植株對病毒的抗性，揭示了莧色藜ChaNDRla基因具有抗病性的特性，不僅為進一步揭示莧色藜高效、廣譜的抗病性分子機制奠定了基礎(chǔ)，也進一步提高了作為廣泛應(yīng)用的枯斑寄主，莧色藜在植物抗病性中的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1:覓色藜ChaNDRla蛋白與擬南芥NDRl蛋白序列比對圖。
[0031]圖2:莧色藜NDRla蛋白與其它植物NDRl蛋白之間的進化關(guān)系圖。
[0032]圖3:接種TMV和CMV后，0h、16h、40h、60h時，莧色藜ChaNDRla表達量變化圖。
[0033]圖4:接種TMV和CMV前后，莧色藜ChaNDRla亞細胞定位圖。
[0034]圖5:轉(zhuǎn)莧色藜ChaNDRla基因的T1代轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測圖。
[0035]圖6:接種TMV后，煙草中病毒增長情況柱狀圖。
【具體實施方式】
[0036]下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。應(yīng)當指出，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。[0037]下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等的《分子克隆:實驗室手冊》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件。
[0038]下面實施例中采用的酶與試劑，其具體來源為=T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自
New England Biolabs (NEB)公司；Taq 酶、基因克隆試劑盒In-Fusion”'HD Cloning Kit 購
自Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒與DNA凝膠回收試劑盒為Axygen公司生產(chǎn)；辣根過氧化物酶標二抗與TMB底物顯色試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；提取植物總RNA的TRIzol 購自 Invitrogen 公司；M_MLV Reverse Trascriptase 和 oligo (dT)購自 Promega
公司；SYBR? Select Mix (Applied Biosystems, P/N4472897);其它實驗試劑均為進口或
國產(chǎn)分析純。
[0039]下面實施例中采用的實驗儀器分別為:PCR儀，BIO-RAD TlOOTMThermal cycler ；凝膠成像儀器，Bio-Rad公司；電泳儀，Bio-Rad公司；熒光定量PCR儀，ABI7500Real TimeSystem。其它儀器包括:恒溫搖床，恒溫水浴鍋、電子天平、離心機、渦旋儀、純水儀、恒溫培
養(yǎng)箱等。 [0040]實施例1:覓色藜ChaNDRla基因的克隆及ChaNDRla蛋白進化樹的構(gòu)建[0041 ] 1、莧色藜葉片總RNA的提取和cDNA的合成
[0042]參照Chomczynski 等(Chomczynski P, Sacchi N.Single-step method of RNAisolation by acid guanidinium thiocyanate-pheno1-chloroform extraction[J].Anal, bioche.，1987，162 (I): 156-159.)的方法，取 50 ~150mg 的莧色藜葉片在液氮中充分研磨，用 TRIzol Reagent (Invitrogen)提取總 RNA。根據(jù) M-MLV ReverseTranscriptase (Promega)試劑盒方法,進行 cDNA 合成。
[0043]2、莧色藜ChaNDRla基因的克隆
[0044]利用已完成的覓色藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)資源(Zhang Y, Pei X，Zhang C，et al.Denovo foliar transcriptome of Chenopodium amaranticolor and analysis ofits gene expression during virus-1nduced hypersensitive response[J].PloSone, 2012,7(9): e45953.)，設(shè)計特異引物，具體克隆引物參見表1。
[0045]表1.本發(fā)明所用引物序列表
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種莧色藜抗病性相關(guān)蛋白ChaNDRla，其具有序列2所示的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其具有序列I所示的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述DNA分子的重組表達載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其為重組表達載體 pCAM-35S-GFP-ChaNDRla 或 pCAMBIA2300_ChaNDRla。
6.表達權(quán)利要求2或3所述DNA分子的宿主細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其為農(nóng)桿菌，優(yōu)選為農(nóng)桿菌EHA105菌株或LBA4404 菌株。
8.一種制備權(quán)利要求2或3所述DNA分子的方法，其包括以下步驟: (1)提取莧色藜總RNA并合成cDNA； (2)利用莧色藜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)資源，設(shè)計特異性引用，通過RT-PCR，獲得擴增產(chǎn)物，其中特異性引物優(yōu)選具有序列3和序列4所示的核苷酸序列； (3)將擴增產(chǎn)物與T載體連接，優(yōu)選pMD18-T載體，對擴增產(chǎn)物進行測序分析，獲得所述DNA分子。
9.一種特異性擴增莧色藜抗病性相關(guān)基因ChaNDRla的引物，其具有序列3和序列4所示的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求2或3所述的DNA分子在提高植物抗病性中的應(yīng)用，其中病原體優(yōu)選為TMV 或 CMV。
【文檔編號】A01H5/00GK103980356SQ201410255165
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】張永強, 李為民, 張超, 龔前園 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所