一種豬akirin2基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬akirin2基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQ：ID：1所示。本發(fā)明所述的豬akirin2基因啟動(dòng)子在外源基因真核表達(dá)、轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。本發(fā)明確定了200bp的最小啟動(dòng)子片段的活性最強(qiáng)。本發(fā)明提供寡核苷酸引物序列、克隆載體、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化的宿主、外源蛋白表達(dá)的方法。這些為進(jìn)一步開展豬akirin2基因在豬的肌衛(wèi)星細(xì)胞及其他相關(guān)細(xì)胞中調(diào)控的研究提供了基礎(chǔ)，同時(shí)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因研究。
【專利說明】-種豬akirin2基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種豬akirin2基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物體在生長(zhǎng)、發(fā)育過程中，能夠根據(jù)環(huán)境的改變以及自身的需要適時(shí)地表達(dá)出 合適的蛋白質(zhì)分子。這往往是需要通過一定的程序來調(diào)控基因的表達(dá)。真核生物基因的表 達(dá)調(diào)控可以分為幾個(gè)層次和水平，包括DNA水平、RNA水平和蛋白質(zhì)水平。RNA水平包括了 轉(zhuǎn)錄起始、轉(zhuǎn)錄后加工及降解（RNAi就是在該水平的基因表達(dá)調(diào)控）。一般認(rèn)為轉(zhuǎn)錄起始的 調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)，最主要和重要的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄的起始階段。真核生物通 過順式作用元件和反式作用因子以及反式作用因子之間的相互作用來影響RNA聚合酶的 活性，進(jìn)而調(diào)控目的基因的表達(dá)。真核生物的啟動(dòng)子就是包含了增強(qiáng)子和沉默子在內(nèi)的順 式作用兀件之一。
[0003] 啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因上游的一段DNA序列，也是RNA聚合酶辨認(rèn)、識(shí)別、結(jié)合并 起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。這就意味著，其下游基因是否將被轉(zhuǎn)錄，以及轉(zhuǎn)錄的頻次都與這 段DNA有關(guān)，正因?yàn)槿绱耍瑔?dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式作用元件之一。隨著基因工程 技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到啟動(dòng)子對(duì)外源目的基因表達(dá)的重要作用。傳統(tǒng)的組成型啟動(dòng) 子在啟動(dòng)外源基因表達(dá)的同時(shí)，也使目的基因在其他組織器官造成了累計(jì)和浪費(fèi)甚至危及 到轉(zhuǎn)基因個(gè)體。隨后陸續(xù)出現(xiàn)了組織特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等等。因此，克隆基因的 啟動(dòng)子，探討基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)構(gòu)及與之相互結(jié)合的可能的轉(zhuǎn)錄因子，將有助于從理論 上揭不基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)并有可能應(yīng)用于細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因的研究中。目如還未見 有關(guān)豬的akirin2基因啟動(dòng)子的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一種豬akirin2基因啟動(dòng)子 的核苷酸序列及其應(yīng)用，為了研究豬akirin2基因啟動(dòng)子的活性區(qū)域，本發(fā)明克隆了豬 akirin2基因上游的核苷酸序列（_1036bp至+34bp)，并與載體pGL3-basic連接構(gòu)建了一 系列的缺失體，采用雙熒光素酶報(bào)告試劑盒，對(duì)啟動(dòng)子的不同區(qū)域的活性進(jìn)行了分析。本發(fā) 明的結(jié)果提供了豬akirin2啟動(dòng)子核苷酸序列及其主要的順式作用元件，含引物載體及細(xì) 胞，并驗(yàn)證了不同核苷酸片段的啟動(dòng)效率。本發(fā)明的豬akirin2啟動(dòng)子可用于豬akirin2 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究并用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因研究。
[0005] 其具體技術(shù)方案為：
[0006] -種豬akirin2基因啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ :ID :1所示。
[0007] 本發(fā)明所述豬akirin2基因啟動(dòng)子在外源基因真核表達(dá)、轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。
[0008] 本研究克隆獲得了豬akirin2基因啟動(dòng)子序列，并采用在線分析軟件對(duì)該序列進(jìn) 行了預(yù)測(cè)分析，推測(cè)判定了豬akirin2基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及部分轉(zhuǎn)錄因子及結(jié)合 位點(diǎn)；采用雙熒光素酶報(bào)告基因載體，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞，研究了啟動(dòng)子的活性，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染 了重組熒光素酶的載體PGL3-F1. 0、pGL3-F0. 7、pGL3-F0. 4和pGL3-F0. 2組的相對(duì)熒光素酶 活性均比轉(zhuǎn)染空載體pGL3-basic組有所升高，而且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，確定了 200bp的 最小啟動(dòng)子片段的活性最強(qiáng)。這些為進(jìn)一步開展豬akirin2基因在豬的肌衛(wèi)星細(xì)胞及其他 相關(guān)細(xì)胞中的應(yīng)用及對(duì)akirin2基因的調(diào)控研究提供了基礎(chǔ)，同時(shí)該啟動(dòng)子序列還可應(yīng)用 于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因研究。。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1是豬基因組DNA，Μ為DNAmaker DL15000,泳道1為豬的基因組DNA，Μ : DNAmaker DL15000 ；
[0010] 圖 2 是 akirin2promoter PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0011] 圖 3 是酶切鑒定，其中，M :DL5000 ;1-4 :pGL3-F0. 2(DraI) :2120bp，1099bp， 1056bp,692bp,19bp ；5-7 ：pGL3-F0. 4(KpnI) ：5131bp,55bp ；8-12 ：pGL3-F0. 7(Κρη I)： 5078bp,408bp ； 13-17 ：pGL3-Fl. 0(Kpn I) ：5079bp,486bp, 221bp ；
[0012] 圖4是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的效率分析，A :正常光；B :綠色熒光。
[0013] 圖5是豬akirin2基因啟動(dòng)子的活性分析

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0015] 本發(fā)明涉及的遺傳資源大白豬和長(zhǎng)白豬雜交的二元健康豬采集于中國河南省。
[0016] 1材料與方法
[0017] 1.1樣品采集
[0018] 取健康豬的肌肉組織，用錫箔紙包好迅速冷凍于液氮中，置于_80°C低溫冰箱保存 備用。
[0019] 主要儀器
[0020] 臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf，Germany);溫度梯度 PCR儀（Sensoquest，Germany); 凝膠成像系統(tǒng)（Alphalmager HP，USA);微量核酸蛋白檢測(cè)儀NanoDrop-1000(Thermo, USA);二氧化碳培養(yǎng)箱（MC0-5AC，三洋）；倒置顯微鏡（Leica，Germany);智能熒光細(xì)胞分 析儀（JuLi，Korea) ;Fluroskan Ascent FL 突光和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（Thermo, USA)。
[0021] 1.2主要試劑
[0022] 質(zhì)粒pGL3_basic和pRL-TK為本室保存；雙熒光素酶檢測(cè)試劑Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，USA) ;pMD19_T 試劑盒；T4DNA 連接酶；大腸桿菌 Ε· Coli 0冊(cè)&菌株為本室保；他16細(xì)胞株；01^0培養(yǎng)基 ；胎牛血清（四季青，杭州）；0.25(%胰酶（含 EDTA)DMS0(sigma，USA) ;Turbofect 轉(zhuǎn)染試劑（Thermo, USA)。
[0023] 1.4配制的溶液
[0024] 1)Digestion Buffer
[0025] 分別取505(10%)311^、恥(：1(3厘）211^40丁六（0.5厘）311^、1'1^8-!1(：1(1]\1?!18.0)0.611^， 混勻后定容至60mL。
[0026] 2)蛋白酶K
[0027] 稱取10mg的蛋白酶Κ，加入lmL滅菌的蒸餾水至完全溶解。
[0028] 1· 5 方法
[0029] 1. 5. 1基因組DNA的提取
[0030] 采用蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提，從豬的肌肉組織中提取基因組DNA。具體操作 如下：
[0031] (1)從-80°c取出組織，放入液氮研磨，并轉(zhuǎn)移至一干凈的2. OmL的離心管中。
[0032] (2)加入 0· 5mL 的 digestion buffer 和 6 μ L 蛋白酶 K 混勻。
[0033] (3) 55°C水浴鍋中消化過夜（12_18h)。
[0034] (4)加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（24 : 25 : 1)，輕輕顛倒混勻，室溫靜置 30min〇
[0035] (5)4°C 1，700g離心lOmin，此時(shí)，溶液分三層。
[0036] (6)轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管中，加入1/2體積的10M乙酸銨和2倍體積的無水乙 醇，混勻，_20°C放置lOmin。
[0037] (7)4°C 1，700g離心2min，棄上清，將離心管倒扣在吸水紙上，盡可能除去上清。
[0038] (8)加入 lmL75% 乙醇，4°C 12, 000g 離心 5min，棄上清。
[0039] (9)加入適量的TE進(jìn)行溶解。
[0040] 0. 5%的瓊脂糖凝|父電泳檢測(cè)所提取基因組DNA的質(zhì)量。
[0041] 1.5. 2引物設(shè)計(jì)
[0042] 根據(jù)已經(jīng)克隆出來的豬akirin2的mRNA序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫的Gene中搜索 akirin2(Sus scrofa)的Y端的上游調(diào)控序列。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1036和+34處設(shè)計(jì) 上游和下游引物。為了后續(xù)能將獲得的片段連入載體pGL3-basic，分別在上游引物和下游 引物的5'端加上ΚρηΙ和Hind III酶切位點(diǎn)。同時(shí)，為了確定最佳的啟動(dòng)子片段，在轉(zhuǎn)錄 起始位點(diǎn)上游的-180、-384和-737處分別設(shè)計(jì)了 3條引物，并在引物的5'端也加上Κρη I酶切位點(diǎn)。引物序列見表1，引物由上海生工合成。
[0043] 表1擴(kuò)增不同片段大小的akirin2啟動(dòng)子的引物序列
[0044] TablelPrimers for the cloning of akirin2 promoter
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬akirin2基因啟動(dòng)子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ :ID :1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的豬akirin2基因啟動(dòng)子在外源基因真核表達(dá)、轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK104099332SQ201410204418
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】郭豫杰, 楊國宇, 高會(huì)貞, 王月影, 鐘凱, 魯維飛, 韓立強(qiáng), 張超 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)