一種清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于海藻生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法。利用海洋中下水層底棲性的水蚤，將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與水蚤相混合，利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。采用本發(fā)明能高效、徹底清除各種經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段的污染雜藻，同時(shí)對(duì)經(jīng)濟(jì)海藻安全無(wú)害。
【專利說(shuō)明】一種清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海藻生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大型海藻主要包括褐藻(brown seaweed)、紅藻(red seaweed)和綠藻(greenseaweed)。其中許多經(jīng)濟(jì)種類是人工栽培的對(duì)象,例如褐藻類的海帶(Saccharina spp.)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)、羊棲菜(Sargassum fusiforme),紅藻類的紫菜(Pyropiaspp.)、紅毛菜(Bangia spp.)、江蘺(Gracilaria spp.)、石花菜(Gelidium spp.)、麒麟菜(Eucheuma spp.),以及綠藻類的將苔與石藥(Ulva spp.)。
[0003]通過(guò)人工栽培獲得的海藻產(chǎn)品既可以提供健康食品(如紫菜、紅毛菜、海帶、裙帶菜、滸苔)、也可用于碘、甘露醇、藻膠等重要化工原料(如海帶、江蘺、石花菜、麒麟菜)、以及海洋藥物(如羊棲菜、紅毛菜)與蛋白試劑(如紫菜)的提取原料，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。另外，栽培海藻在新能源(如發(fā)酵產(chǎn)乙醇、甲烷)、新材料(如海藻多糖紡織纖維)領(lǐng)域也具有突出的應(yīng)用潛力。
[0004]大型經(jīng)濟(jì)海藻的自然生活史除了宏觀階段(即常見(jiàn)的葉狀、管狀、分枝狀、膜狀、片狀藻體)，通常還存在微觀階段(例如海帶、裙帶菜、紫菜的單列細(xì)胞絲狀體)。除了自然發(fā)育過(guò)程，微觀階段還包括在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)或人工誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生的特殊過(guò)程(例如石莼、滸苔的絲狀體)，以及可長(zhǎng)期保存并維持的幼苗期(例如石莼、滸苔的幼苗)。 [0005]與陸地植物不同，大型海藻的生活史微觀階段可以獨(dú)立生活，既可以長(zhǎng)期保存，又易于擴(kuò)繁增殖形成遺傳均一的純系，由此成為種質(zhì)保存與種質(zhì)擴(kuò)繁的主要對(duì)象；同時(shí)，通過(guò)發(fā)育調(diào)控還可進(jìn)入宏觀生活史階段，體現(xiàn)植物細(xì)胞發(fā)育的全能性，因此，也常作為遺傳選育(如純系雜交)、基因工程等多種海藻生物技術(shù)操作的受體材料；尤為重要的是，微觀階段還是部分經(jīng)濟(jì)海藻人工栽培過(guò)程的重要環(huán)節(jié)(例如紫菜貝殼絲狀體培育階段)?？梢哉f(shuō)，生活史微觀階段是大型經(jīng)濟(jì)海藻栽培生產(chǎn)與科研操作的重要對(duì)象。
[0006]但是，由于生活史微觀階段的藻體十分微小，在保存和培養(yǎng)過(guò)程中極易受到絲狀或單細(xì)胞藍(lán)藻、硅藻等微藻的污染，對(duì)后續(xù)試驗(yàn)或生產(chǎn)造成干擾。由于微藻在營(yíng)養(yǎng)吸收與增殖速率等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，若不及時(shí)清除，往往會(huì)將目標(biāo)藻完全包裹并導(dǎo)致死亡，對(duì)生產(chǎn)或科研造成嚴(yán)重影響。
[0007]現(xiàn)有解決方法包括:1)通過(guò)顯微操作對(duì)目標(biāo)藻進(jìn)行重新分離，這高度依賴相關(guān)設(shè)備和操作經(jīng)驗(yàn)，還需花費(fèi)時(shí)間將目標(biāo)藻從單一個(gè)體開(kāi)始重新增殖；2)使用化學(xué)試劑選擇性控制雜藻生長(zhǎng)，例如利用二氧化鍺通過(guò)干擾硅代謝抑制硅藻，但是，雜藻自身或通過(guò)孢子會(huì)產(chǎn)生耐受，因此往往只具有抑制效果，很難完全清除，另外，化學(xué)試劑也會(huì)對(duì)目標(biāo)藻產(chǎn)生抑制和傷害；3)直接丟棄。因此，控制雜藻污染，需要發(fā)展新的思路和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]針對(duì)上述在科研和生產(chǎn)過(guò)程中出現(xiàn)的突出問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法。
[0009]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0010]一種清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，利用海洋中下水層底棲性的水蚤，將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與水蚤相混合，利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。
[0011]進(jìn)一步的說(shuō)，以海洋中下水層底棲性水蚤，通過(guò)飼喂淡水單細(xì)胞綠藻維持生長(zhǎng)并使其增殖；將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與水蚤相混合，利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。
[0012]所述將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與與水蚤按20-30只/cm2藻體相混合，進(jìn)行利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。其中，水蚤投放少些僅是清除的慢些而已。
[0013]待完全清除雜藻后再將海藻材料與水蚤分離。
[0014]所述海洋中下水層底棲性水蚤為日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)。
[0015]所述大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段為綠藻石莼、滸苔的幼苗以及絲狀體，褐藻裙帶菜、海帶的絲狀配子體， 紅藻紫菜或紅毛菜的絲狀孢子體。
[0016]所述雜藻為單細(xì)胞藍(lán)藻、絲狀藍(lán)藻與硅藻。
[0017]所述淡水單細(xì)胞綠藻為雨生紅球藻、小球藻。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提出了一種新思路，具有如下有益效果:
[0019]1.本發(fā)明技術(shù)不依賴任何設(shè)備與試劑。使用海洋中下層底棲性的水蚤，潮間帶均有分布，分布廣泛、易于分離獲得，容易經(jīng)高效增殖獲得生物量。
[0020]2.本發(fā)明的雜藻清除方法非常高效，一般只需處理30分鐘，而現(xiàn)有顯微分離方法高度依賴相關(guān)設(shè)備和操作經(jīng)驗(yàn)，還需花費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間將目標(biāo)藻從單一個(gè)體開(kāi)始重新增殖。而化學(xué)處理法一般需連續(xù)處理幾天到一周時(shí)間。
[0021]3.本發(fā)明對(duì)目標(biāo)藻完全無(wú)害，非常安全。較化學(xué)處理等常用現(xiàn)有技術(shù)，依賴水蚤對(duì)雜藻的攝食行為進(jìn)行清除，對(duì)目標(biāo)藻不產(chǎn)生任何影響，而化學(xué)處理法往往會(huì)嚴(yán)重抑制目標(biāo)藻的生長(zhǎng)。
[0022]4.本發(fā)明可對(duì)絲狀藍(lán)藻、硅藻等污染雜藻進(jìn)行徹底清除。而化學(xué)處理等現(xiàn)有技術(shù)往往只能抑制雜藻生長(zhǎng)，雜藻自身或通過(guò)孢子會(huì)產(chǎn)生耐受，很難完全清除。
[0023]5.本發(fā)明技術(shù)適用的海藻材料非常廣泛，清除雜藻方法具有很高的通用性。使用的水蚤口器尺寸大于一般常見(jiàn)的絲狀藍(lán)藻直徑和單細(xì)胞藍(lán)藻、硅藻，小于褐藻、綠藻、紅藻等常見(jiàn)海藻微觀階段的尺寸，因此，會(huì)選擇性清除污染雜藻。
[0024]6.本發(fā)明為了避免海洋微藻飼喂的水蚤取用時(shí)對(duì)目標(biāo)藻產(chǎn)生二次污染，使用淡水來(lái)源的微藻(例如雨生紅球藻)對(duì)水蚤進(jìn)行飼喂，可完全保證水蚤的正常取食和生長(zhǎng)，即使取用時(shí)淡水藻污染了目標(biāo)藻，在海水培養(yǎng)液中也不會(huì)存活。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的水蚤電鏡形態(tài)學(xué)特征，其中(左.完整個(gè)體；右.口器)。[0026]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的水蚤光學(xué)顯微鏡形態(tài)學(xué)特征，其中箭頭示卵囊。
[0027]圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的基于COl基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其中Sample為本發(fā)明分離的水蚤。
[0028]圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的水蚤攝食淡水單細(xì)胞綠藻，其中，左.攝食前；右.攝食后，示消化道內(nèi)紅色，右下角為投喂的雨生紅球藻，標(biāo)尺:50 μ m。
[0029]圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的水蚤完全去除滸苔幼苗污染的絲狀藍(lán)藻，其中，自左至右示同一個(gè)體的去除過(guò)程，箭頭示雜藻集中分布位置。
[0030]圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的水蚤完全去除石莼幼苗污染的硅藻，其中，上下行分別為兩個(gè)個(gè)體，自左至右示去除過(guò)程，箭頭示雜藻集中分布位置。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法及該方法所達(dá)到的效果作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0032]實(shí)施例1:水蚤的分離培養(yǎng)以及形態(tài)與分子鑒定
[0033]1.蚤種分離培養(yǎng)
[0034]從青島海域潮間帶采集下層底棲性水蚤，用消毒海水進(jìn)行沖洗并分離兩個(gè)配對(duì)個(gè)體，通過(guò)飼喂底棲硅藻維持生長(zhǎng)并增殖群體。 [0035]2.形態(tài)觀察
[0036]挑取典型完整個(gè)體，利用掃描電鏡和光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)特征并成像，電鏡可見(jiàn)水蚤的口器直徑約為10 μ m,大于常見(jiàn)的絲狀藍(lán)藻直徑、以及單細(xì)胞藍(lán)藻與硅藻，同時(shí)小于常見(jiàn)大型經(jīng)濟(jì)海藻微觀階段的細(xì)胞尺寸。光鏡可見(jiàn)雌性個(gè)體形成卵囊，內(nèi)含大量卵，有很高的繁殖速率(見(jiàn)圖1、圖2)。
[0037]3.分子鑒定
[0038]為了避免外源生物的污染，提取基因組總DNA前使用Tris-EDTA-NaCl緩沖液反復(fù)沖洗樣本。參照產(chǎn)品說(shuō)明書，使用微量組織樣品試劑盒(Qiagen)，取整只個(gè)體提取DNA。針對(duì)甲殼類設(shè)計(jì)PCR通用引物(正向引物crcoxf:5 ’ -GGTCCTGTAATCATAAAGAYATYGG-3 ’，反向引物 crcoxrl:5，-GCGACTACATAATAAGTRTCRTG-3，與 crcoxr2:5，-TCTATCCCAACTGTAAATATRT-GRTG-3’ )擴(kuò)增線粒體編碼的COl基因片段。反應(yīng)采用50 μ I體系，反應(yīng)條件如下:940C 5min;36 個(gè)循環(huán)(94°C lmin, 46°C 30s, 72°C 1.5min) ;72°C IOmin0 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證后使用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化(Omega)。純化產(chǎn)物送測(cè)序公司雙向測(cè)序(參見(jiàn)SEQ IDN0.1)。
[0039]選擇相關(guān)參考序列，將水蚤線粒體COl基因片段利用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)測(cè)得樣本序列與日本虎斑猛水蚤Tigriopus japonicus線粒體COl基因序列高度同源,與該種參考序列(NCBI Acc N0.JN129180.1)相似度為98%，由此確定分離的水蚤樣本為節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、燒足亞綱(Copepoda)、猛水蚤目(Harpacticoida)、虎斑猛水蚤屬(Tigriopus)的日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)(見(jiàn)圖3)。
[0040]SEQ ID N0.1為水蚤COl部分基因序列，
[0041]TAAAGATATTGGAACTTTGTATTTAATTGCTGGCGCATGAGCGGGTTTTGTAGGAGCCGCTATAAGTGTTTTAATCCGCCTGGAGTTAGGGCAGTGTGGGAGGTTTTTAGGTAATGATCAGCTTTATAATGTTCTTGTAACTGCTCATGCTTTCGTAATGATTTTTTTTATGGTTATACCTGTTTTAATTGGAGGATTTGGTAATTGACTTGTACCCCTGATGCTGGGAGCCCCAGATATGGCTTTTCCACGTCTTAATAATYTAAGATTTTGGTTTTTGATTCCAGCTTTATTAATGTT
ATTGTTAAGGAGGGCTGTAGAAGCAGGGGCTGGAACCGGGTGAACTGTGTATCCCCCATTAAGAGCTGTTGGTCATG
CGGGAAGTTCGGTTGATTTTGCTATCTTCTCACTTCATTTGGCGGGTGTTTCTTCATTGCTGGGGGCTGTGAATTTT
ATTAGCACTATTTTTAATTTGCGGGTTTTTGGTTTGTACTTAGATTTGGTTCCTTTGTTTGTTTGGTCCGTGCTCTT
AACAGCTATTTTGYTGTTGCTTTCCTTACCTGTCTTGGCTGGTGCCATTACTATGTTGTTGACGGATCGTAACTTGA
ATTCTTGTTTTTATGATGTGAGGGGTGGGGGAGATCCTATTCTTTACCAACACTTATTTTGATTTTTTGGGCATCCC
GAAGTTTACATTTTAATTCTCCCAGGGTTTGGATTAATTTCGCATATTATTTCtCAAGAAACCTCTAAAAAAGAAGT
TTTTGGGGTATTGGGTATAATTTATGCTATAGCGTCTTATCGGTGTTTTGGGGTTTGTTGTATGGGCTCATCACATA
TTTACTGTGGGTCTGGACACGGACACTCGTGCCTATTTTACTTCTGCAACTATAATTATTGCTGTTCCCACTGGTAT
CAAAATTTTCAGGTGGGTAGGCACTTTGTACGGTAGTAAACCTAGATATAGGGCTTCTTTTAGCTGGGCCCTGGGCT
TTATTTTCCTGTTTACTTTAGGAGGGTTGACGGGTATTATTTATCCA
[0042]4.淡水 單胞藻飼喂
[0043]為了避免海洋微藻飼喂的水蚤取用時(shí)對(duì)目標(biāo)藻產(chǎn)生二次污染，改用淡水單胞藻(雨生紅球藻)對(duì)水蚤進(jìn)行飼喂，光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)水蚤對(duì)淡水單胞藻可正常取食(見(jiàn)圖4)。
[0044]實(shí)施例2:用水蚤清除污染滸苔幼苗的絲狀藍(lán)藻
[0045]滸苔幼苗可用于保存種質(zhì)，絲狀藍(lán)藻是常見(jiàn)的污染生物，非常容易與苗體發(fā)生嚴(yán)重的纏繞并最終完全包裹，因完全抑制光合作用并競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致保存的幼苗種質(zhì)死亡。
[0046]取處于長(zhǎng)期休眠狀態(tài)并于假根部嚴(yán)重污染絲狀藍(lán)藻的幼苗，與適量水蚤(約20只)在培養(yǎng)皿中混合，處理約半小時(shí)。整個(gè)過(guò)程每隔IOmin進(jìn)行鏡檢拍照(見(jiàn)圖5)。圖中可見(jiàn)，絲狀藍(lán)藻與假根發(fā)生嚴(yán)重纏繞，但水蚤對(duì)藍(lán)藻的清除非常徹底而高效。
[0047]實(shí)施例3:用水蚤清除污染石莼幼苗的硅藻
[0048]石莼幼苗可用于保存種質(zhì)，硅藻是常見(jiàn)的污染生物，非常容易與苗體發(fā)生粘附，嚴(yán)重的會(huì)完全包裹，因完全抑制光合作用并競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致保存的幼苗種質(zhì)死亡。
[0049]取處于長(zhǎng)期休眠狀態(tài)并嚴(yán)重污染硅藻的石莼幼苗，與適量水蚤(約20只)在培養(yǎng)皿中混合，處理約半小時(shí)。整個(gè)過(guò)程每隔IOmin進(jìn)行鏡檢拍照(見(jiàn)圖6)。圖中可見(jiàn)，單細(xì)胞硅藻與幼苗藻體發(fā)生嚴(yán)重粘附，但水蚤對(duì)硅藻的清除非常徹底而高效。
[0050]實(shí)施例4:用水蚤清除污染裙帶菜絲狀配子體的硅藻
[0051]裙帶菜絲狀配子體可用于保存種質(zhì)與遺傳操作，以及生產(chǎn)上制備克隆苗，硅藻是常見(jiàn)的污染生物，非常容易與苗體發(fā)生粘附，現(xiàn)有技術(shù)常使用二氧化鍺抑制硅藻，但同樣會(huì)對(duì)裙帶菜配子體造成負(fù)面影響。
[0052]取嚴(yán)重污染硅藻的裙帶菜絲狀配子體，與適量水蚤(約20只)在培養(yǎng)皿中混合，處理約半小時(shí)，水蚤對(duì)硅藻的清除非常徹底而高效。
【權(quán)利要求】
1.一種清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:利用海洋中下水層底棲性的水蚤，將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與水蚤相混合，利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。
2.按權(quán)利要求1所述的清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:以海洋中下水層底棲性水蚤，通過(guò)飼喂淡水單細(xì)胞綠藻維持生長(zhǎng)并使其增殖；將污染雜藻的大型海藻生活史微觀階段與水蚤相混合，利用水蚤的自然攝食行為去除污染雜藻。
3.按權(quán)利要求1或2所述的清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:待完全清除雜藻后再將海藻材料與水蚤分離。
4.按權(quán)利要求1或2所述的清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:所述海洋中下水層底棲性水蚤為日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)。
5.按權(quán)利要求1或2所述的清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:所述大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段為綠藻石莼、滸苔的幼苗以及絲狀體，褐藻裙帶菜、海帶的絲狀配子體，紅藻紫菜或紅毛菜的絲狀孢子體。
6.按權(quán)利要求1或2所述的清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:所述雜藻為單細(xì)胞藍(lán)藻、絲狀藍(lán)藻與硅藻。
7.按權(quán)利要求1或2所述的清除大型經(jīng)濟(jì)海藻生活史微觀階段雜藻污染的方法，其特征在于:所述淡水單細(xì) 胞綠藻為雨生紅球藻、小球藻。
【文檔編號(hào)】A01G33/00GK103999763SQ201410157855
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】姜鵬, 吳春輝, 張光濤, 陳華新, 李富超, 趙瑾 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所