甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系的選育方法
【專利摘要】本發(fā)明甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系的選育方法，包括：1）選育具有孤雌生殖遺傳特性的四倍體早代穩(wěn)定系；2）選育攜帶顯性遺傳性狀且具有孤雌遺傳特性的八倍體油菜。3）甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系鑒定及選育：選擇帶顯性性狀的上述八倍體植株與質(zhì)不育或核不育的純合不育系單株測交，并對(duì)測交后代進(jìn)行形態(tài)鑒定及育性鑒定。本發(fā)明方法誘導(dǎo)效率極高。通過本發(fā)明獲得的油菜誘導(dǎo)系，在油菜新材料、新品種選育中有廣泛的應(yīng)用，能提高油菜新品系或新品種純合的速度，提高育種效率，快速選育優(yōu)良保持系、恢復(fù)系及常規(guī)油菜新品種。
【專利說明】甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系的選育方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明與農(nóng)業(yè)有關(guān)，特別與甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系的選育方法有關(guān)。
[0002]【背景技術(shù)】:
甘藍(lán)型油菜(Brassica napus,四倍體)新品種選育，首先是選育新的自交系或遺傳穩(wěn)定的株系純合系，在抗性、產(chǎn)量、品質(zhì)等要求上滿足生產(chǎn)需要，最后審定為新的油菜新品種(常規(guī)品種)。正常情況下通過常規(guī)的人工雜交選育一個(gè)常規(guī)油菜品種需要6— 7代的時(shí)間，如果選育雜交品種，需要培育穩(wěn)定的不育系、保持系、恢復(fù)系，油菜新品種選育時(shí)間更長，10 —15年。常規(guī)油菜新品系選育是通過兩個(gè)遺傳背景不同的品系雜交形成F1代，F(xiàn)1代自交形成F2代，F(xiàn)2代再選擇優(yōu)良單株自交形成F3代，F(xiàn)3再選單株自交，一直到F6-F7代才能獲得穩(wěn)定的油菜新品系，以I年I代計(jì)算，所花時(shí)間大概在7—8年的時(shí)間，通過異地加代也需要4年左右的時(shí)間。[0003]目前，在油菜中還未有誘導(dǎo)系的報(bào)道。所謂“誘導(dǎo)系”是指，用該植物作為父本用其花粉對(duì)同類植株授粉，能誘導(dǎo)同類植株(母本)產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)，如產(chǎn)生單倍體、純合二倍體等。在植物中運(yùn)用誘導(dǎo)系進(jìn)行新品種選育最多的是玉米，但玉米中的誘導(dǎo)系也只是單倍體誘導(dǎo)系。最早出現(xiàn)的玉米單倍體誘導(dǎo)系為stock6，該誘導(dǎo)系只能誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生單倍體，然后單倍體植株再進(jìn)行人工染色體加倍形成純合二倍體，且誘導(dǎo)效率較低，一般誘導(dǎo)效率在10%以下(以收獲種子中獲得單倍體數(shù)計(jì)算)。本發(fā)明所用方法能有效選育甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系，且該誘導(dǎo)系能直接誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜產(chǎn)生純合四倍體后代，無需進(jìn)行人工染色體加倍來獲得純合系；且誘導(dǎo)效率高，最高可達(dá)100%，一般的誘導(dǎo)效率都在50%以上。誘導(dǎo)系誘導(dǎo)母體植株產(chǎn)生純合四倍體的主要原理是:誘導(dǎo)系能誘導(dǎo)母體植株，大孢子生殖細(xì)胞(卵細(xì)胞)產(chǎn)生孤雌生殖效應(yīng)，且卵細(xì)胞能進(jìn)行染色體加倍，即卵細(xì)胞孤雌生殖產(chǎn)生的后代就為純合的四倍體，產(chǎn)生該現(xiàn)象的機(jī)理目前尚不明確。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的為了提供一種甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系的選育方法。采用本發(fā)明方法獲得甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系能誘導(dǎo)母體植株在F1代發(fā)生孤雌生殖，在F2代形成穩(wěn)定的純合四倍體，該方法能快速、有效，只需2代(I年或2年)獲得穩(wěn)定純合系油菜，提高了油菜選育自交系或常規(guī)品種的周期。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣來實(shí)現(xiàn)的:
本發(fā)明甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系的選育方法，該方法包括以下步驟:
I)選育具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系:
(I)將兩個(gè)親本材料雜交F1代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍獲得加倍后的F1代植株；
(2 )加倍后的F1代植株進(jìn)行自交或強(qiáng)制自交獲得F2代，對(duì)F2代進(jìn)行田間種植觀察，并鑒定每個(gè)單株的育性，選擇四倍體可育后代自交獲得F3代，對(duì)F3代進(jìn)行純合度鑒定，通過形態(tài)、細(xì)胞學(xué)以及分子標(biāo)記鑒定，對(duì)后代DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，電泳觀察每個(gè)特異引物擴(kuò)增下單株的DNA帶型及條帶數(shù)目，顯示每個(gè)單株都是兩個(gè)親本的雜交后代，每個(gè)單株之間分子標(biāo)記圖譜一致，說明這些單株是純合系-四倍體早代穩(wěn)定系；
(3)獲得的四倍體早代穩(wěn)定系與至少10個(gè)常規(guī)純合穩(wěn)定系進(jìn)行正反交，F(xiàn)1代、F2代鑒定早代穩(wěn)定系的遺傳特性，即是否有孤雌生殖特性；上述正反交，如有F1分離，F(xiàn)2代出現(xiàn)部分穩(wěn)定株系，對(duì)應(yīng)的早代穩(wěn)定系是具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系；
2)選育攜帶顯性遺傳形狀且具有孤雌遺傳特性的八倍體油菜:
(1)具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交(如顯性矮桿、紫葉、花葉、黃葉等性狀)，得到雜交F1代種子。上述雜交F1種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍，得到加倍后的帶顯性性狀的F1值株；
(2)對(duì)加倍的帶顯性性狀的F1植株，通過顯微觀察或流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色體倍性鑒定，選擇帶顯性性狀的八倍體的植株，淘汰非正常加倍株、非整倍體植株、以及不帶顯性性狀加倍植株；
3)甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系鑒定及選育:選擇帶顯性性狀的上述八倍體植株與質(zhì)不育或核不育的純合不育性單株測交，并對(duì)測交后代進(jìn)行形態(tài)鑒定及育性鑒定:
(1)八倍體植株中的顯性性狀能去除測交后代中產(chǎn)生的雜交株，如果測交后代中出現(xiàn)顯性性狀植株、或非四倍體植株，說明該植株是八倍體植株和母本雜交產(chǎn)生的，去除該植株;
(2)上述單株測交后代如果出現(xiàn)全不育、為正常四倍體油菜、且不帶顯性性狀，說明該測交后代對(duì)應(yīng)的父本基因未進(jìn)入測交后代中，顯性八倍體植株為甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系。
[0006]上述的將兩個(gè)親本材料雜交F1代種子或具有孤雌生`殖遺傳特性的四倍體早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀四倍體油菜雜交得到的雜交F1代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍的具體方法如下:
1)用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25—40秒，用0.1%升汞消毒12 —17分鐘，然后用無菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng)基上；
2)讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度23—25°C，白天光照12—16小時(shí)，光照強(qiáng)度2000— 3000勒克斯，夜晚暗培養(yǎng)8 —12小時(shí)，待植株長到I一2片真葉時(shí)，從下胚軸處剪下植株繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長；
3)將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；
4)生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?—7天，取出植株將植株上的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15 — 30分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度16°C — 25°C，相對(duì)濕度60— 80%，能保證移栽成活率在95%以上；
上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成:
MS培養(yǎng)基IL
6—芐基腺嘌呤0.5— 1.5mg
染色體加倍誘導(dǎo)劑30— 70mg
蔗糖20— 30g
瓊脂8 一IOg,第一培養(yǎng)基的pH=5.8—6.0，
上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成:
MS培養(yǎng)基IL
6—芐基腺嘌呤0.5 — Img
染色體加倍誘導(dǎo)劑20— 40mg
蔗糖20— 30g
瓊脂8 一IOg,
第二培養(yǎng)基的pH=5.8—6.0，
上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成:
MS培養(yǎng)基IL
α—蔡乙酸0.03—0.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑5 — 20mg
蔗糖20— 30g
瓊脂8 一IOg,
第三培養(yǎng)基的pH=5.8—6.0，
上述的浸泡緩沖液由以及下配比的組分組成:
水IL
易?；蚩寺?.6—1.2g
α一萘乙酸0.5—Img。
[0007]上述的染色體加倍誘導(dǎo)劑采用秋水仙素、氟樂靈、氨磺樂靈中的至少一種。
[0008]上述誘導(dǎo)系(八倍體植株)的基本原理是:誘導(dǎo)系具有孤雌生殖誘導(dǎo)基因，誘導(dǎo)系作父本時(shí)，誘導(dǎo)系染色體(或基因)沒有與母體植株染色體融合，而是誘導(dǎo)母體植株(即卵細(xì)胞，二倍體)產(chǎn)生孤雌生殖效應(yīng)，且母體植株卵細(xì)胞染色體自身加倍形成四倍體純合系。
[0009]上述選育成功的純合四倍體誘導(dǎo)系(顯性八倍體植株)，可以快速用于常規(guī)品種選育，雜交油菜親本(恢復(fù)系、保持系)選育，同時(shí)可以快速培育DH系?？梢栽贗年或2代的時(shí)間內(nèi)獲得上述材料，大大節(jié)約油菜的育種時(shí)間，提高育種效率。
[0010]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
1、獲得的誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率高，最高誘導(dǎo)效率可達(dá)100%。
[0011]2、誘導(dǎo)系作為父本與正常植株去雄雜交，結(jié)實(shí)率在10—20%，誘導(dǎo)產(chǎn)生的后代不需要人工染色體加倍，可直接產(chǎn)生純合四倍體。
[0012]3、誘導(dǎo)系可誘導(dǎo)母本植株孤雌生殖，可在2代(I一2年)獲得穩(wěn)定純合的四倍體油菜新材料或品種。
[0013]4、本發(fā)明可以用在油菜保持系、恢復(fù)系、DH群體構(gòu)建以及常規(guī)油菜品種的選育上，可以在I年或2代的時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定的油菜新品系或新品種。對(duì)于油菜品質(zhì)育種、抗性育種、高油分育種、常規(guī)育種及雜交育種具有明顯的優(yōu)勢，提高育種效率，降低育種成本和風(fēng)險(xiǎn)。
[0014]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為甘藍(lán)型油菜純合體四倍體誘導(dǎo)系選育過程圖。
[0015]圖2為誘導(dǎo)系3380選育流程圖。圖3為獲得油菜早代穩(wěn)定系的流程圖。
[0016]圖4為獲得早代穩(wěn)定系P3—2的流程圖。
[0017]圖5為P3—2四倍體油菜倍性鑒定圖。
[0018]圖6為P3—2流式細(xì)胞儀倍性鑒定圖。
[0019]圖7為3380流式細(xì)胞儀倍性鑒定圖。
[0020]【具體實(shí)施方式】:
參見圖1、圖2，由本 申請(qǐng)人:獲得的甘藍(lán)型油菜四倍體早代穩(wěn)定系P3—2，與20個(gè)純合甘藍(lán)型四倍體油菜正反交，3個(gè)正反交F1代出現(xiàn)分離，且這3個(gè)組合F2代出現(xiàn)穩(wěn)定株系，說明P3 — 2具有孤雌生殖遺傳特性。用P3 — 2與四倍體甘藍(lán)型矮桿油菜D3 — 5正反交(矮桿為顯性性狀)，然后將雜交F1代種子進(jìn)行染色體加倍，加倍后代用流式細(xì)胞儀鑒定或根尖顯微鏡觀察鑒定為顯示矮桿八倍體植株，該植株定名為3380。
[0021]參見圖3~圖6，獲得四倍體早代穩(wěn)定系P3 — 2方法如下:
甘藍(lán)型油菜H)09 (四倍體，染色體2n=38)與白菜型油菜YH (二倍體，雅安黃油菜，染色體2n=20)剝蕾進(jìn)行人工去雄雜交獲得F1代雜交種子。F1代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進(jìn)行人工染色體加倍。對(duì)加倍后的F1代植株進(jìn)行自交(或強(qiáng)制自交)獲得F2代，對(duì)F2代進(jìn)行田間種植觀 察、育性鑒定即通過醋酸洋紅對(duì)花粉染色，判斷花粉育性，出現(xiàn)三種情況(1、單倍體植株，花粉極少，且育性極低；2、多倍體植株完全不育，花器官發(fā)育受阻，不能正常的開花，無花粉；3、正?？捎闹仓?，花粉量多，花粉育性95%以上)。對(duì)F2代正?？捎龁沃赀M(jìn)行自交獲得F3代。對(duì)F3代進(jìn)行純合度鑒定，種植F3代單株株系，32%的可育株系單株植株整齊一致，開花結(jié)實(shí)正常。對(duì)整齊一致株系進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定，染色體條數(shù)一致(38條)，染色體形態(tài)未出現(xiàn)異常。SSR分子標(biāo)記，通過DNA聚合酶鏈反應(yīng)，電泳觀察每個(gè)特異引物擴(kuò)增下單株DNA帶型，顯示每個(gè)單株都是H)09與YH的雜交后代，且每個(gè)單株DNA擴(kuò)增條帶數(shù)目及帶型一致，可以判斷這些株系為純合系，即早代穩(wěn)定系。將其中I個(gè)葉片較大、無裂葉、葉片著生緊湊、含油率55%的甘藍(lán)型(染色體38條)油菜早代穩(wěn)定系定名為P3— 2。
[0022]本實(shí)施例中將F1代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進(jìn)行人工染色體加倍的具體方法如下:
1)用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分鐘，然后用無菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng)基(染色體加倍誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上；
2)讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度25°C，白天光照16小時(shí)，光照強(qiáng)度2000勒克斯，晚上暗培養(yǎng)8小時(shí)，待長到I一2片真葉時(shí)，將植株從下胚軸剪下繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長；
3)將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基)中進(jìn)行生根培養(yǎng)；
4)生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?天后，取出植株將植株上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度25°C，相對(duì)濕度60%，能保證移栽成活率在95%以上；
上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成:
—MS培養(yǎng)基IL6—芐基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素30mg
鹿糖20g
瓊脂8g。
[0023]第一培養(yǎng)基的ρΗ=5.8—6.0。
[0024]MS培養(yǎng)基由Murashige和Skoog發(fā)明，簡寫為MS，其配方參見附表1。
[0025]上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成:
MS培養(yǎng)基IL
6—芐基腺嘌呤(6ΒΑ) 0.5mg 秋水仙素20mg
鹿糖30g
瓊脂8g。
[0026]第二培養(yǎng)基的ρΗ=5.8—6.0。
[0027]上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成:` MS培養(yǎng)基IL
α 一萘乙酸0.03mg
秋水仙素5mg
鹿糖20g
瓊脂8g。
[0028]第三培養(yǎng)基的ρΗ=5.8—6.0。
[0029]上述的浸泡緩沖液由以下配比的組分組成:
水IL
易?；蚩寺?.6g
α —萘乙酸0.5mg。
[0030]參見圖2、圖7，獲得矮桿顯性八倍體油菜3380的方法如下:
P3-2與甘藍(lán)型矮桿油菜D3 — 5 (矮桿為顯性性狀)剝蕾進(jìn)行人工去雄雜交獲得F1代雜交種子。然后將雜交F1代種子在MS培養(yǎng)基上用秋水仙素進(jìn)行人工染色體加倍。加倍后代用流式細(xì)胞儀鑒定倍性，倍性鑒定以P3 — 2為對(duì)照。
[0031]本實(shí)施例中將F1代雜交種子在培養(yǎng)基上用秋水仙素進(jìn)行人工染色體加倍的具體方法如下:
1)用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25秒，用0.1%升汞消毒12分鐘，然后用無菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng)基(染色體加倍誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上；
2)讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度25°C，白天光照16小時(shí)，光照強(qiáng)度2000勒克斯，晚上暗培養(yǎng)8小時(shí)，待長到I一2片真葉時(shí)，將植株從下胚軸剪下繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長；
3)將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基)中進(jìn)行生根培養(yǎng)；
4)生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?天后，取出植株將植株上的培養(yǎng)基沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度25°C，相對(duì)濕度60%，能保證移栽成活率在95%以上；
上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成:
MS培養(yǎng)基IL
6—芐基腺嘌呤(6BA) 0.5mg 秋水仙素50mg
鹿糖20g
瓊脂8g。
[0032]第一培養(yǎng)基的ρΗ=5.8—6.0,
MS培養(yǎng)基由Murashige和Skoog發(fā)明，簡寫為MS，其配方參見附表1，
上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成:
MS培養(yǎng)基IL
6—芐基腺嘌呤(6ΒΑ) 0.5mg 秋水仙素30mg
鹿糖30g
瓊脂8g 。
[0033]第二培養(yǎng)基的ρΗ=5.8 — 6.0。
[0034]上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成:
MS培養(yǎng)基IL
α 一萘乙酸0.03mg
秋水仙素20mg
鹿糖20g
瓊脂8g
第三培養(yǎng)基的pH=5.8—6.0，
上述的浸泡緩沖液由以下配比的組分組成:
水1L
易?；蚩寺?.6g
α —萘乙酸0.5mg。
[0035]參見圖2，用3380作父本，與甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系(0464A)測交，測交后代50株，全為高桿，且全為四倍體油菜，其中49株為全不育，I株半不育，且形態(tài)特征與0464A完全相同。同時(shí)用P3 — 2與矮桿油菜D3 — 5雜交F1 (非加倍株)做父本與0464A測交作為對(duì)照驗(yàn)證，測交后代102株，出現(xiàn)矮桿62株、高桿40株、且育性分離較大，出現(xiàn)全可育73株、半不育20株、全不育9株。說明3380中的基因并未進(jìn)入測交株，測交后代為0464A孤雌生殖而來，誘導(dǎo)率98%。用3380做父本與甘藍(lán)型油菜3954去雄聚合雜交(3954為F1，由中雙11與CAX雜交而來)，聚合雜交后代F1分離，每個(gè)F1自交，收獲F1自交株45個(gè)。種植F2代株系45個(gè)，出現(xiàn)穩(wěn)定株系45個(gè)，穩(wěn)定株系出現(xiàn)比列100%，誘導(dǎo)率100%。
[0036]用3380做父本與甘藍(lán)型油菜3968去雄聚合雜交(3968為F1，由中雙11與1365雜交而來)，聚合雜交后代F1分離，每個(gè)F1自交，收獲F1自交株52個(gè)。種植F2代株系52個(gè)，出現(xiàn)穩(wěn)定株系28個(gè)，穩(wěn)定株系出現(xiàn)比例53.85%，誘導(dǎo)率53.85%。[0037]同樣用3380做父本與甘藍(lán)型油菜中雙11 (常規(guī)品種，純合系)去雄雜交，獲得雜交F1植株70株，70株F1形態(tài)與中雙11完全相同，且每個(gè)單株自交后F2代未發(fā)生分離，為穩(wěn)定株系，與中雙11形態(tài)也完全相同，說明F1代就為純系。即3380與中雙11雜交過程，誘導(dǎo)中雙11發(fā)生了孤雌生殖，所產(chǎn)生的F1為孤雌生殖自交，是純合系，因此F1穩(wěn)定、F2也穩(wěn)定，且與中雙11形態(tài)完全相同，該誘導(dǎo)率100%。
[0038]最終，顯性矮桿八倍體植株3380確定為甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系。
[0039]附表1 MS培養(yǎng)基成分配`方`
【權(quán)利要求】
1.甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系的選育方法，該方法包括以下步驟: 1)選育具有孤雌生殖遺傳特性的四倍體早代穩(wěn)定系: (I)將兩個(gè)親本材料雜交F1代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍獲得加倍后的F1代植株； (2 )加倍后的F1代植株進(jìn)行自交或強(qiáng)制自交獲得F2代，對(duì)F2代進(jìn)行田間種植觀察，并鑒定每個(gè)單株的育性，選擇四倍體可育后代自交獲得F3代，對(duì)F3代進(jìn)行純合度鑒定，通過形態(tài)、細(xì)胞學(xué)以及分子標(biāo)記鑒定，對(duì)后代DNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，電泳觀察每個(gè)特異引物擴(kuò)增下單株的DNA帶型及條帶數(shù)目，顯示每個(gè)單株都是兩個(gè)親本的雜交后代，每個(gè)單株之間分子標(biāo)記圖譜一致，說明這些單株是純合系-四倍體早代穩(wěn)定系； (3)獲得的四倍體早代穩(wěn)定系與至少10個(gè)四倍體常規(guī)純合穩(wěn)定系進(jìn)行正反交，F(xiàn)1代、F2代鑒定早代穩(wěn)定系的遺傳特性，即是否有孤雌生殖特性；上述正反交，如有F1分離，F(xiàn)2代出現(xiàn)部分穩(wěn)定株系，對(duì)應(yīng)的早代穩(wěn)定系是具有孤雌生殖遺傳特性的四倍體早代穩(wěn)定系； 2)選育攜帶顯性遺傳性狀且具有孤雌遺傳特性的八倍體油菜； (1)具有孤雌生殖遺傳特性的四倍體早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀四倍體油菜雜交(如顯性矮桿、紫葉、花葉、黃葉等性狀)，得到雜交F1代種子；上述雜交F1種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍，得到加倍后的帶顯性性狀的F1值株； (2)對(duì)加倍的帶顯性性狀的F1植株，通過顯微觀察或流式細(xì)胞儀進(jìn)行染色體倍性鑒定，選擇帶顯性性狀的八倍體的植株 ，淘汰非正常加倍株、非整倍體植株、以及不帶顯性性狀加倍植株； 3)甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系鑒定及選育:選擇帶顯性性狀的上述八倍體植株與質(zhì)不育或核不育的純合不育系單株測交，并對(duì)測交后代進(jìn)行形態(tài)鑒定及育性鑒定: (1)八倍體植株中的顯性性狀能去除測交后代中產(chǎn)生的雜交株，如果測交后代中出現(xiàn)顯性性狀植株、或非四倍體植株，說明該植株是八倍體植株和母本雜交產(chǎn)生的，去除該植株; (2)上述單株測交后代如果出現(xiàn)全不育、為正常四倍體油菜、且不帶顯性性狀，說明該測交后代對(duì)應(yīng)的父本基因未進(jìn)入測交后代中，顯性八倍體植株為甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系。
2.如權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系的選育方法，其特征在于將兩個(gè)親本材料雜交F1代種子或具有孤雌生殖遺傳特性的早代穩(wěn)定系與具有顯性性狀油菜雜交得到的雜交F1代種子在培養(yǎng)基上用染色體加倍誘導(dǎo)劑進(jìn)行人工染色體加倍的具體方法如下: 1)用純度為75%酒精進(jìn)行種子表面消毒25—40秒，用0.1%升汞消毒12 —17分鐘，然后用無菌水將種子表面的升汞沖洗干凈，用無菌紙將種子表面的水分吸干，然后將種子接種在第一培養(yǎng)基上； 2)讓種子在第一培養(yǎng)基上生根發(fā)芽，培養(yǎng)條件:溫度23—25°C，白天光照12—16小時(shí)，光照強(qiáng)度2000— 3000勒克斯，夜晚暗培養(yǎng)8 —12小時(shí)，待植株長到I一2片真葉時(shí)，從下胚軸處剪下植株繼續(xù)在第二培養(yǎng)基上生長； 3)將剪下的植株繼續(xù)插入第二培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待有側(cè)芽分化后，將側(cè)芽及植株轉(zhuǎn)入第三培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；4)生根培養(yǎng)二周后，植株長出粗壯的根后，將植株在室溫?zé)捗?— 7天，取出植株將植株上的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，并在浸泡緩沖液中浸泡15 — 30分鐘后移栽到溫室中，溫室溫度16°C — 25°C，相對(duì)濕度60— 80%，能保證移栽成活率在95%以上； 上述的第一培養(yǎng)基由以下配比的組分組成: MS培養(yǎng)基1L 6—芐基腺嘌呤0.5— 1.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑30— 70mg 蔗糖20— 30g 瓊脂8 一IOg, 第一培養(yǎng)基的pH=5.8—6.0， 上述的第二培養(yǎng)基由以下配比的組分組成: MS培養(yǎng)基1L 6—芐基腺嘌呤0.5 — Img 染色體加倍誘導(dǎo)劑20— 40mg 蔗糖20— 30g 瓊脂8 一IOg, 第二培養(yǎng)基的pH=5.8—6.0， 上述的第三培養(yǎng)基由以下配比的組分組成: MS培養(yǎng)基1L α—蔡乙酸0.03—0.5mg 染色體加倍誘導(dǎo)劑5 — 20mg 蔗糖20— 30g 瓊脂8 一IOg, 第三培養(yǎng)基的pH=5.8—6.0， 上述的浸泡緩沖液由以及下配比的組分組成:水1L 易保或克露0.6—1.2g α一萘乙酸0.5—Img 。
3.如權(quán)利要求1或2所述的甘藍(lán)型油菜純合四倍體誘導(dǎo)系的選育方法，其特征在于染色體加倍誘導(dǎo)劑采用秋水仙素、氟樂靈、氨磺樂靈中的至少一種。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103858753SQ201410151678
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】付紹紅, 張汝全, 楊進(jìn), 李云, 王繼勝, 鄒瓊, 陶蘭蓉, 康澤明, 唐蓉 申請(qǐng)人:成都市農(nóng)林科學(xué)院