一種納塔櫟體細胞胚胎發(fā)生的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種納塔櫟體細胞胚胎發(fā)生的方法，包括選材、消毒處理、試管芽苗誘導培養(yǎng)、體胚誘導、增殖培養(yǎng)、成熟培養(yǎng)、體胚的萌發(fā)一系列操作；在體胚誘導、增殖、成熟、萌發(fā)培養(yǎng)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。本發(fā)明具有繁殖系數(shù)高，繁殖時間不受季節(jié)限制，取材對母體傷害小，無病蟲害困擾，能夠保持原植株優(yōu)良性狀，在納塔櫟苗木生產(chǎn)及科研中均具有重要的應用價值。
【專利說明】一種納塔櫟體細胞胚胎發(fā)生的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及納塔櫟的組織培養(yǎng)方法，具體的說是納塔櫟的體細胞胚胎發(fā)生方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]納塔櫟Wuercus nuttalli)為殼斗科櫟屬落葉喬木,主干直立,大枝平展略有下垂，塔狀樹冠。葉橢圓，長l(T20cm，寬5~13cm，正面深綠色，背面暗綠色，有叢生毛，秋葉亮紅色或紅棕色。樹皮灰色或棕色，光滑。納塔櫟原產(chǎn)美國，分布區(qū)從美國德州東部到佛羅里達西部，包括阿肯色，密蘇里，俄克拉何馬和田納西的南部。引種實踐表明，納塔櫟生長速度快，五年生平均樹高可達5m，十年生胸徑15~20cm。每年11月初葉色開始變紅，第二年2月落葉，冠形優(yōu)美，葉色紅艷，是良好的速生觀賞樹種。[0003]但納塔櫟開花結(jié)實遲、較難建立種子園、結(jié)實量大小年現(xiàn)象明顯、扦插生根困難、嫁接繁殖存在不親和現(xiàn)象，因此大規(guī)模生產(chǎn)納塔櫟種苗十分困難。特別對于經(jīng)過優(yōu)選的樹姿挺秀、葉色亮紅的優(yōu)良單株，急需新型繁殖技術(shù)，滿足市場的潛在需求。
[0004]體細胞胚胎發(fā)生及其再生技術(shù)是20世紀90年代形成的林業(yè)繁育技術(shù)的重要內(nèi)容之一，已經(jīng)成為許多樹種大規(guī)模繁殖的有效手段。體細胞胚胎，由體細胞發(fā)育而來，進而再生為完整植株。體細胞胚胎發(fā)生途徑優(yōu)點明顯:繁殖系數(shù)高，操作可重復，遺傳相對穩(wěn)定。特別是近年來，隨著其技術(shù)體系的逐漸成熟，已成為改良櫟樹生長速率和抗病性的可靠途徑，是優(yōu)良基因型的最佳繁殖系統(tǒng)，而且在種質(zhì)創(chuàng)新中具有很大的應用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:建立納塔櫟體胚發(fā)生技術(shù)體系，實現(xiàn)納塔櫟優(yōu)選單株規(guī)?；咝a(chǎn)。
[0006]技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一種納塔櫟體細胞胚胎的發(fā)生方法，包括以下步驟:
(1)選材:9年生納塔櫟優(yōu)選單株當年生萌條為材料，將其剪成約4Cm的帶芽小段；
(2)對采集到的莖段進行消毒處理；
(3)芽苗誘導培養(yǎng):將步驟(2)中的莖段用剪刀去除頭尾氧化變黑部分，分清形態(tài)學上、下端，剪成長1.5~3cm的Y字型，下端切口呈斜型，豎直接種于芽誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15^20d后分化長成試管芽苗；
(4)體胚誘導:將芽誘導產(chǎn)生的嫩葉接種到體胚誘導培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為(25±2)°C，光照強度為I 600-2 500 Ix的培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d后體胚誘導率為97%。
[0007](5)增殖培養(yǎng):將步驟(4)中誘導產(chǎn)生的體胚，轉(zhuǎn)接于含有增殖培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)瓶中，然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，在光照強度為1600-25001χ，光照時間為16h/d，溫度為(25±2)°C，2(T25d后體胚迅速增殖呈白色或黃色透明狀顆粒。
[0008](6)成熟培養(yǎng):將步驟(5)中增殖獲得的體胚，轉(zhuǎn)接于成熟培養(yǎng)基中，在光照強度為1600-25001χ，光照時間16h/d，溫度為(25±2) °C的培養(yǎng)條件下，進行成熟培養(yǎng)，50天后成熟率在80% ；
(7)體胚的萌發(fā):將步驟(6)中獲得的成熟體胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，在光照強度為1600-25001χ，光照時間16h/d，溫度為(25±2) °C的培養(yǎng)條件下，進行萌發(fā)培養(yǎng)60d。
[0009]進一步，所述步驟(2)中的消毒處理過程包括:將采集的嫩梢去除2/3葉片后修剪成約4cm長的帶腋芽莖段，洗滌劑浸泡30 min，流水沖洗10次，蒸餾水清洗外植體后，用無菌水沖洗3~4次，置于無菌燒杯中，在超凈工作臺內(nèi)用70%的酒精浸泡30s，無菌水沖洗2^3次,再用0.1%升汞溶液消毒3 min，最后用無菌水沖洗6次；
進一步，所述步驟(3)中芽誘導培養(yǎng)基的配方為:WPM基本培養(yǎng)基+0.0Smg.1^e-BA+
0.05mg.L^NAA+SOg.L-1蔗糖+6.5 g.L-1卡拉膠，培養(yǎng)基pH值控制在5.7~5.8。
[0010]進一步，所述步驟(4)中體胚誘導培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基+0.16 mg.L_16-BA+0.3mg.L_1NAA+0.1 mg.U12, 4_D+30g.171 鹿糖 +6.5 g.171 卡拉膠；pH 值控制在
5.7~5.8ο
[0011]進一步，所述步驟(5)中的增殖培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基+2.0 mg.L_16-BA+0.02 mg.L_1NAA+30g.L-1 鹿糖 +6.5 g.L-1 卡拉膠；pH 值控制在 5.7~5.8。
[0012]進一步，所述步驟(6)的成熟培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基+50g.1蔗糖+6.5g.L—1卡拉膠；pH值控制在5.7~5.8。
[0013]進一步，所述步驟(7)中的萌發(fā)培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基+10 g.L—1山梨醇+30g.L-1蔗糖+6.5 g.L-1卡拉膠，所述萌發(fā)培養(yǎng)基的pH值為5.7~5.8。
[0014]進一步，所述WPM基本培養(yǎng)基即木本植物組織培養(yǎng)基的具體配方如下:
硝酸銨 NH4N03400 mg/L
硝酸鈣 Ca (NO3) 2.4H20556 mg/L
氯化鈣 CaCl2.2H2096 mg/L
硫酸鎂 MgSO4.7H20370 mg/L
磷酸二氫鉀 KH2PO4170 mg/L
硫酸鉀 K2S04990 mg/L
乙二胺四乙酸二鈉Na2.EDTA 37.3 mg/L 硫酸亞鐵 FeSO4.7H2027.8 mg/L
硫酸錳 MnSO4.H2O22.3 mg/L
硫酸鋅 ZnSO4.7H208.6 mg/L
硼酸 H3BO36.2 mg/L
鑰酸鈉 Na2MoO4.2H200.25 mg/L
硫酸銅 CuSO4.5H200.025 mg/L
氯化鈷 CoCl2.6 H2O0.025 mg/L
肌醇 C6H12O6.2H20100 mg/L
甘氨酸 NH2.CH2.COOH 2 mg/L
鹽酸硫胺素 C12H17ClOS.2HC1 I mg/L
鹽酸吡唆醇 C8HltlNO5P0.5 mg/L
煙酸 NC5H4COOH0.5 mg/L。
[0015]所述MS基本培養(yǎng)基的具體配方如下:
硝酸鉀 KN031900 mg/L
硝酸銨 NH4N031650 mg/L磷酸二氫 KH2P04 170 mg/L 硫酸鎂 MgS04.7H20 370 mg/L 氯化鈣 CaCl2.2Η20 440 mg/L 碘化鉀 KI0.83 mg/L
硼酸 H3B036.2 mg/L
硫酸錳 MnS04.4H20 22.3 mg/L 硫酸鋅 ZnS04.7 H208.6 mg/L
鑰酸鈉 Na2Mo04.2 H20 0.25 mg/L 硫酸銅 CuS04.5 H20 0.025 mg/L 氯化鈷 CoC12.6 H200.025 mg/L
乙二胺四乙酸二鈉Na2.EDTA 37.3 mg/L 硫酸亞鐵 FeS024.7H2027.8 mg/L
肌醇100 mg/L
甘氨酸2 mg/L
鹽酸硫胺素VBl0.1 mg/L
鹽酸吡哆醇VB60.5 mg/L
煙酸 VPP0.5 mg/L ο
[0016]有益效果:本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)而言具有以下優(yōu)點:
1.以無菌瓶苗葉片作為外植體進行體胚誘導，克服了離體培養(yǎng)外植體取材受季節(jié)限制的缺點。
[0017]2.本發(fā)明建立的再生體系，通過各個生長階段植株生長需求不同調(diào)配適當?shù)呐囵B(yǎng)基，所得體胚誘導率為97%，與其它無性繁殖相比較(從f 2年幼樹上采嫩枝進行夏插，成活率為20%左右；以I年生麻櫟做砧木，春季枝接活率為12~15%)，繁殖系數(shù)大大增加。
[0018]3.本發(fā)明建立的再生體系，植株發(fā)育正常，穩(wěn)定保存了新葉亮紅的優(yōu)良性狀。
[0019]本發(fā)明提供的繁殖方法很大程度上提高了納塔櫟的再生效率和繁殖系數(shù)，為產(chǎn)業(yè)化快速繁殖納塔櫟優(yōu)選單株提供了一種新方法。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0021]以下實例所用的基本培養(yǎng)基的配方如下:
芽誘導基本培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基，其中，常量元素的組分和其對應的使用濃度如下:硝酸銨(NH4NO3) 400 mg/L、硝酸鈣(Ca(NO3)2.4Η20) 556 mg/L、氯化鈣(CaCl2.2Η20) 96 mg/L、硫酸鎂(MgSO4.7H20) 370 mg/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170 mg/L、硫酸鉀(K2SO4) 990 mg/L ；微量元素的組分和其對應的使用濃度如下:硫酸錳(MnSO4.H2O )22.3 mg/L、硫酸鋅(ZnSO4.7H20) 8.6 mg/L、硼酸(H3BO3) 6.2 mg/L、鑰酸鈉(Na2MoO4.2H20) 0.25 mg/L、硫酸銅(CuSO4.5Η20)0.025 mg/L、硫酸銅(CuSO4.5Η20)0.025 mg/L、氯化鈷(CoCl2.62 )0.025 mg/L ；
鐵鹽的組分和其對應的使用濃度如下:乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA) 37.3 mg/L、硫酸亞鐵(FeSO4.7H20) 27.8 mg/L ；有機成分的組分和其對應的濃度如下:肌醇100 mg/L、甘氨酸(Gly) 2 mg/L、鹽酸硫胺素(VB1) I mg/L、鹽酸吡哆醇(VB6) 0.5 mg/L、煙酸(VPP) 0.5 mg/L。
[0022]體胚誘導、增殖、成熟、萌發(fā)培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中，常量元素的組分和其對應的使用濃度如下:硝酸銨(NH4NO3) 1650 mg/L、硝酸鉀(KNO3) 1900 mg/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 170 mg/L、硫酸鎂(MgSO4.7H20) 370 mg/L、氯化鈣(CaCl2.2H20) 440 mg/L ；
微量元素的組分和其對應的使用濃度如下:碘化鉀(ΚΙ) 0.83 mg/L，硫酸錳(MnSO4.H2O) 22.3 mg/L、硫酸鋅(ZnSO4.7H20) 8.6 mg/L、硼酸(H3BO3) 6.2 mg/L、鑰酸鈉(Na2MoO4.2Η20)0.25 mg/L、硫酸銅(CuSO4.5Η20)0.025 mg/L、氯化鈷(CoCl2.62 )0.025 mg/L ；
鐵鹽的組分和其對應的使用濃度如下:乙二胺四乙酸二鈉(Na2.EDTA) 37.3 mg/L、硫酸亞鐵(FeSO4.7H20) 27.8 mg/L ；
有機成分的組分和其對應的濃度如下:肌醇100 mg/L、甘氨酸(Gly) 2 mg/L、鹽酸硫胺素(VB1) I mg/L、鹽酸吡哆醇(VB6) 0.5 mg/L、煙酸(VPP) 0.5 mg/L。
[0023]一種納塔櫟體細胞胚胎的發(fā)生方法，包括以下步驟:
(1)選材:2012年4飛月，以江蘇省林科院自主選育的納塔櫟為研究材料(樹齡9年，胸徑12cm，具有春季新葉鮮紅，秋季葉色亮紅，樹形優(yōu)美等優(yōu)良性狀)，采集當年生萌條，將其剪成約4飛cm的帶芽小段進行芽的誘導，30d后取芽誘導獲得的嫩葉作為外植體進行體胚誘導；
(2)消毒處理:將采集的萌條去除2/3葉片后，洗滌劑浸泡30min，流水沖洗10次，蒸餾水清洗外植體后，用無菌水沖洗3~4 次，置于無菌燒杯中，在超凈工作臺內(nèi)用70%的酒精浸泡30s，無菌水沖洗2~3次，再用0.1%升汞溶液消毒3分鐘，最后用無菌水沖洗6次；
(3)試管芽苗誘導培養(yǎng):在超凈的工作臺上及無菌條件下，將步驟(2)中消毒后的外植體用剪刀去除莖段頭尾氧化變黑部分，分清形態(tài)學上、下端，將莖段剪成長約2cm的Y字型，下端切口呈斜型，豎直接種于芽誘導培養(yǎng)基中。然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，其中光照強度為1600-25001X，每日光照時間為16小時，溫度為(25±2) °C，培養(yǎng)20天，分化長成試管芽苗；
(4)體胚誘導:將芽誘導后產(chǎn)生的嫩葉接種到體胚誘導培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為(25±2) °C，光照強度為I 600~2 500 Ix的培養(yǎng)室中培養(yǎng)30d后體胚誘導率為97%。
[0024](5)增殖培養(yǎng):將步驟(4)中誘導產(chǎn)生的體胚，在超凈的工作臺上及無菌條件下，轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中，然后將其置于普通日光燈為光源的環(huán)境下，在光照強度為1600-25001χ，光照時間為16h/d，溫度為(25±2) °C的條件下培養(yǎng)25d，體胚迅速增殖呈白色或黃色透明狀顆粒。
[0025](6)成熟培養(yǎng):將步驟(5)中增殖獲得的體胚，轉(zhuǎn)接于成熟培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16小時，溫度為(25±2) °C的條件下，進行成熟培養(yǎng)，50天后成熟率在80% ；
(7)體胚的萌發(fā):將步驟(6)中獲得的成熟體胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，在光照強度為1600-25001χ，光照時間為16h/d，溫度為(25±2) °C的條件下，進行萌發(fā)培養(yǎng)60天。
[0026]實施例1:
本實施例中所選用的各個階段的培養(yǎng)基配方如下:(1)芽誘導培養(yǎng)基的配方為:WPM基本培養(yǎng)基，附加0.05mg.Ll-BA、 0.06mg.L^1NAA,40g.L-1鹿糖、7.0 g.L-1卡拉膠，調(diào)pH值為5.7 ；
(2)體胚誘導培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加0.20mg.L-^-ΒΑ,Ο.2mg.L^1NAA,0.08mg.U12, 4_D、25g.L-1 鹿糖、6.5g.L-1 卡拉膠,調(diào) pH 值為 5.7。
[0027](3)體胚增殖培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加2.0 mg.Ι^β-ΒΑ,Ο.01 mg.L^1NAA,25g.L-1 蔗糖、6.5g.L-1 卡拉膠，調(diào) pH 值為 5.7。
[0028](4)體胚成熟培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基,附加60g.L—1鹿糖、6.5 g.L—1卡拉膠，調(diào)pH值為5.7。
[0029](5)體胚萌發(fā)培養(yǎng)基配方為:MS培養(yǎng)基，附加12 g.L-1山梨醇、20g.L-1蔗糖、6.5g.卡拉膠，調(diào)pH值為5.7
實施例2:
本實施例中所選用的各個階段的培養(yǎng)基配方如下:
(1)芽誘導培養(yǎng)基的配方為:WPM基本培養(yǎng)基，附加0.08mg.Ι^β-ΒΑ, 0.05mg.L^1NAA,25g.L-1蔗糖、6.5 g.1/1卡拉膠，調(diào)pH值為5.7 ;
(2)體胚誘導培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加0.16mg.L_1NAA>0.12 mg.U12, 4_D、40g.L—1 鹿糖、7.0g.L—1 卡拉膠,調(diào) pH 值為 5.7。
[0030](3)體胚增殖培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加1.8 mg.Ι^β-ΒΑ,Ο.03 mg.L-1NAAdOg.L-1 蔗糖、7.0 g.L-1 卡拉膠，調(diào) pH 值為 5.7。
[0031](4)體胚成熟培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加40g.L-1蔗糖、7.0 g.L-1卡拉膠，調(diào)pH值為5.7。
[0032](5)體胚萌發(fā)培養(yǎng)基配方為:MS培養(yǎng)基，附加8 g.L-1山梨醇、30g.L-1蔗糖、7.0g.卡拉膠，調(diào)pH值為5.7。
[0033]實施例3:
本實施例中所選用的各個階段的培養(yǎng)基配方如下:
(1)芽誘導培養(yǎng)基的配方為:WPM基本培養(yǎng)基，附加0.06mg.Ll-BA、 0.05mg.L^1NAA,30g.L-1鹿糖、6.8 g.L-1卡拉膠，調(diào)pH值為5.8 ;
(2)體胚誘導培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加0.18 mg.L-1^-ΒΑ,Ο.25mg.L^1NAA,0.1 mg.U12, 4_D、30g.L—1 鹿糖、6.8g.L—1 卡拉膠,調(diào) pH 值為 5.8。
[0034](3)體胚增殖培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加1.9 mg.Ι^β-ΒΑ,Ο.02 mg.L^1NAA,32g.L-1 蔗糖、6.8 g.L-1 卡拉膠，調(diào) pH 值為 5.8。
[0035](4)體胚成熟培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加45g.L-1鹿糖、6.8g.L-1卡拉膠，調(diào)pH值為5.8。
[0036](5)體胚萌發(fā)培養(yǎng)基配方為:MS培養(yǎng)基，附加10g.L-1山梨醇、28g.L-1鹿糖、6.8g.L—1卡拉膠，調(diào)pH值為5.8。
[0037]實施例4:
本實施例中所選用的各個階段的培養(yǎng)基配方如下:
(1)芽誘導培養(yǎng)基的配方為:WPM基本培養(yǎng)基，附加0.07mg.Ι^β-ΒΑ, 0.06mg.L^1NAA,38g.L-1蔗糖、6.5 g.1/1卡拉膠，調(diào)pH值為5.8 ;
(2)體胚誘導培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加0.19 mg.Ι^β-ΒΑ,Ο.28mg.L^1NAA,0.09 mg.U12, 4_D、35g.171 鹿糖、6.6g.Ι71 卡拉膠,調(diào) pH 值為 5.8。
[0038](3)體胚增殖培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加1.8~2.0 mg.Ι^β-ΒΑ,Ο.03 mg.L^1NAA,28g.1 蔗糖、6.9g.1 卡拉膠，調(diào) pH 值為 5.8。
[0039](4)體胚成熟培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加48g.L-1鹿糖、6.9 g.L-1卡拉膠，調(diào)pH值為5.8。
[0040](5)體胚萌發(fā)培養(yǎng)基配方為:MS培養(yǎng)基，附加11 g.1山梨醇、22g.1蔗糖、6.6g.L—1卡拉膠，調(diào)pH值為5.8。
[0041]以下是本發(fā)明與傳統(tǒng)方法性能對比表:
【權(quán)利要求】
1.一種納塔櫟體細胞胚胎的發(fā)生方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)選材:選取9年生納塔櫟優(yōu)選單株的當年生萌條，將其剪成recm的帶芽小段； (2)對帶芽小段外植體進行消毒處理； (3)芽誘導培養(yǎng):在無菌條件下，將步驟(2)中的外植體用剪刀去除莖段頭尾氧化變黑部分，分清形態(tài)學上、下端，剪成長1.5~3cm的Y字型，下端切口呈斜型，豎直接種于芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)15~20d，分化長成無菌芽苗；所述芽誘導培養(yǎng)基的配方為:WPM基本培養(yǎng)基，附加 0.05~0.08mg.L h-BA、0.05~0.06mg.L 1NAA^25^40g.L 1 鹿糖、6.5~7.0 g.L 1 卡拉膠，調(diào)pH值為5.7~5.8 ; (4)體胚誘導:將步驟(3)中長成的無菌苗嫩葉接種到體胚誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)15~30d；MS基本培養(yǎng)基，附加 0.16~0.20 mg.L_16-BA,0.2^0.3mg.L^1NAA,0.08^0.12 mg.L^2, 4-D,25~40g.L-1蔗糖、6.5~7.0g.L-1卡拉膠，調(diào)pH值為5.7~5.8 ； (5)體胚增殖培養(yǎng):將步驟(4)中誘導產(chǎn)生的體胚，進行增殖培養(yǎng)，2(T25d后，體胚迅速增殖呈白色或黃色透明顆粒狀；體胚增殖培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加1.8~2.0mg.L 1-BA、。.01 ~0.03 mg.L 1NAAJS~40g.L 1 鹿糖、6.5~7.0 g.L 1 卡拉膠，調(diào) pH 值為5.7~5.8 ； (6)成熟培養(yǎng):將步驟(5)中增殖獲得的體胚，接種于含有成熟培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3(T50d ;體胚成熟培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加4(T60g.L—1蔗糖、6.5~7.0 g.L—1卡拉膠，調(diào)pH值為5.7~5.8 ; (7)體胚的萌發(fā):將步驟(6)中獲得的成熟體胚接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4(T60d進行植株再生；所述體胚萌發(fā)培養(yǎng)基配方為:MS基本培養(yǎng)基，附加8~12 g.L-1山梨醇、2(T30g.L—1蔗糖、6.5~7.0 g.L—1卡拉膠，調(diào)pH值為5.7~5.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納塔櫟體細胞胚胎的發(fā)生方法，其特征在于:所述步驟(2)中的消毒處理過程包括:將采集的枝條去除2/3葉片后修剪成約Teem長的帶腋芽莖段，洗滌劑浸泡30 min，流水沖洗10次，蒸餾水清洗外植體后，用無菌水沖洗3~4次，置于無菌燒杯中，在超凈工作臺內(nèi)用70%的酒精浸泡30s，無菌水沖洗2~3次，再用0.1%升汞溶液消毒3 min，最后用無菌水沖洗6次； 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納塔櫟體細胞胚胎的發(fā)生方法，其特征在于:所述步驟(3)、步驟(4)、步驟(5)、步驟(6)和步驟(7)中的培養(yǎng)條件為:光照強度為1600-25001χ，每日光照時間為16h，溫度為(25±2)°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納塔櫟體細胞胚胎的發(fā)生方法，其特征在于:所述的WPM基本培養(yǎng)基即木本植物培養(yǎng)基的具體配方如下: 硝酸銨 NH4N03400 mg/L 硝酸鈣 Ca (NO3) 2.4H20556 mg/L 氯化鈣 CaCl2.2H2096 mg/L 硫酸鎂 MgSO4.7H20370 mg/L 磷酸二氫鉀 KH2PO4170 mg/L 硫酸鉀 K2S04990 mg/L 乙二胺四乙酸二鈉Na2.EDTA 37.3 mg/L 硫酸亞鐵 FeSO4 .7H2027.8 mg/L硫酸錳 MnSO4.H2O22.3 mg/L 硫酸鋅 ZnSO4.7H208.6 mg/L 硼酸 H3BO36.2 mg/L 鑰酸鈉 Na2MoO4.2H200.25 mg/L 硫酸銅 CuSO4.5H200.025 mg/L 氯化鈷 CoCl2.6 H2O0.025 mg/L 肌醇 C6H12O6.2H20100 mg/L 甘氨酸 NH2.CH2.COOH 2 mg/L 鹽酸硫胺素 C12H17ClOS.2HC1 I mg/L 鹽酸吡唆醇 C8HltlNO5P0.5 mg/L 煙酸 NC5H4COOH0.5 mg/L 。
4.根據(jù)權(quán)利要求4中任一項所述的納塔櫟體細胞胚胎的發(fā)生方法，其特征在于:所述的MS基本培養(yǎng)基的具體配方如下: 硝酸鉀 KN031900 mg/L 硝酸銨 NH4N031650 mg/L 磷酸二氫 KH2P04 170 mg/L 硫酸鎂 MgS04.7H20 370 mg/`L 氯化鈣 CaCl2.2H20 440 mg/L 碘化鉀 KI0.83 mg/L 硼酸 H3B036.2 mg/L 硫酸錳 MnS04.4H20 22.3 mg/L 硫酸鋅 ZnS04.7 H208.6 mg/L 鑰酸鈉 Na2Mo04.2 H20 0.25 mg/L 硫酸銅 CuS04.50.025 mg/L 氯化鈷 CoC12.6 H200.025 mg/L 乙二胺四乙酸二鈉Na2.EDTA 37.3 mg/L 硫酸亞鐵 FeS024.7H2027.8 mg/L 肌醇100 mg/L 甘氨酸2 mg/L 鹽酸硫胺素VBl0.1 mg/L 鹽酸吡哆醇VB60.5 mg/L 煙酸 VPP0.5 mg/L ο
【文檔編號】C05G1/06GK103548679SQ201310519079
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】張敏, 黃利斌, 陳智敏, 方炎明, 蔣澤平, 蔣春 申請人:江蘇省林業(yè)科學研究院