一種山參發(fā)根及其培育方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種山參發(fā)根及其培育方法，以山參根、莖及葉片等為外植體，用活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的T-DNA上的致發(fā)根基因整合到山參外植體細(xì)胞核DNA中，表達(dá)形成毛狀根，每一個(gè)發(fā)根即為一個(gè)單克隆。經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)及反復(fù)篩選，逐步建立起山參發(fā)根懸浮培養(yǎng)無性系。提供了一種新的山參資源，能夠工業(yè)集約化生產(chǎn)，不需要占用耕地，不受天氣、病蟲害等自然界條件的影響，實(shí)現(xiàn)了山參有效藥用成分生產(chǎn)化室內(nèi)。
【專利說明】一種山參發(fā)根及其培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了一種山參發(fā)根及其培育方法，開辟了一個(gè)山參開發(fā)利用的新途徑， 為山參發(fā)根生產(chǎn)天然藥物提供了可能，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]發(fā)根農(nóng)桿菌A4具有轉(zhuǎn)移其Ri質(zhì)粒上的基因，能誘導(dǎo)藥用植物產(chǎn)生發(fā)狀根， 該發(fā)根能在液體培養(yǎng)基內(nèi)快速生長，并表達(dá)藥用植物的有效藥用成分。山參(Mountain PanaxGinseng C.A.Meyer)根內(nèi)含有人參皂苷較多，有些特殊人參皂苷僅在山參中存在，具抗癌作用，用量極微就有很好的療效。
[0003]目前，國內(nèi)主要是從山參參根內(nèi)提取人參皂苷供藥用。但天然資源受氣候的影響，季節(jié)性強(qiáng)，病蟲害等也會(huì)嚴(yán)重影響山參的產(chǎn)量和質(zhì)量；擴(kuò)大山參的種植，必定與糧爭地， 而我國的土地資源十分有限；而且，山參入藥需15年以上的時(shí)間，其根頭小，單產(chǎn)低，嚴(yán)重制約山參在生產(chǎn)上的應(yīng)用。近30年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)藥用植物產(chǎn)生發(fā)根，并利用發(fā)根來生產(chǎn)藥用植物有效成分研究得越來越深入，這是因?yàn)槠溆幸韵聝?yōu)點(diǎn):第一，天然山參資源有限；第二，山參中有無法替代的、特效的、高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥用成分，第三，可以實(shí)現(xiàn)山參中有效藥用成分的室內(nèi)可控生產(chǎn)。
[0004]目前國內(nèi)外均未見轉(zhuǎn)化山參發(fā)根成功的報(bào)道。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明提供一種山參發(fā)根，解決了人工種植山參生長周期長、繁殖速度慢，遺傳上不夠穩(wěn)定等不利因素，實(shí)現(xiàn)了室內(nèi)生產(chǎn)山參。
[0006]本發(fā)明還公開了上述山參發(fā)根的培育方法，以山參根、莖及葉片等為外植體，用活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的T-DNA上的致發(fā)根基因整合到山參外植體細(xì)胞核DNA中，表達(dá)形成毛狀根。
[0007]本發(fā)明提供的山參發(fā)根，又稱之為發(fā)根(hairy root);其特征在于:
以山參根、莖及葉片等為外植體，用活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使發(fā)根農(nóng)桿菌Ri 質(zhì)粒上的T-DNA上的致發(fā)根基因整合到山參外植體細(xì)胞核DNA中，表達(dá)形成毛狀根，每一個(gè)發(fā)根即為一個(gè)單克隆。經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)及反復(fù)篩選，逐步建立起山參發(fā)根懸浮培養(yǎng)無性系。
[0008]本發(fā)明公開的山參發(fā)根的制備方法，其技術(shù)解決方案如下:
以山參根、莖及葉片等為外植體，用活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使發(fā)根農(nóng)桿菌Ri 質(zhì)粒上的T-DNA上的致發(fā)根基因整合到山參外植體細(xì)胞核DNA中，表達(dá)形成毛狀根。每一根山參發(fā)根即為一個(gè)單克隆，經(jīng)過繼代培養(yǎng)和多次篩選，逐步建立起山參懸浮培養(yǎng)無性系。
[0009]具體步驟如下:
1、外植體的預(yù)培養(yǎng):
取山參新鮮、健康的根或莖或葉片，洗凈；用0.1%的升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗4次， 每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超凈臺上將外植體切成0.5cmX 1.0cm大小,轉(zhuǎn)移到已滅菌的1/2MS固體培養(yǎng)基上(每瓶5片)；于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2~7d。
[0010]2、發(fā)根農(nóng)桿菌的制備:
挑取發(fā)根農(nóng)桿菌單菌落，接種于5mL液體YEB內(nèi)，28°C黑暗條件下振蕩培養(yǎng)過夜，于次日接種到50ml液體YEB中繼培養(yǎng)4~6h后備用。
[0011]3、山參葉片與發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化:將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的山參外植體浸入已培養(yǎng)好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，感染5~10 min，然后，用無菌濾紙將菌液吸凈；再接種于含抗生素 1/2MS固體培養(yǎng)基上，約經(jīng)過30cT50d培養(yǎng)生出發(fā)根。
[0012]4、發(fā)根培養(yǎng):
去菌培養(yǎng):切割下由外植體上長出的發(fā)根，置于含抗生素(頭孢噻吩30(T500mg/L) 1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行去菌培養(yǎng)，每:T5d轉(zhuǎn)繼代I次，進(jìn)行3飛次；
擴(kuò)大培養(yǎng):將無菌的發(fā)根1.0g移入盛有50mL 1/2MS液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶內(nèi)，于黑暗條件下，室溫22°C~25°C，llOrpm，懸浮培養(yǎng)。
[0013]山參發(fā)根無性系的建立:經(jīng):T5代的懸浮培養(yǎng)，按發(fā)根克隆的來源分別建立不同的無性系。
[0014]此外，利用本發(fā)明的山參發(fā)根產(chǎn)生的愈傷組織，還可篩選出細(xì)胞懸浮培養(yǎng)無性系。
[0015]本發(fā)明與山參栽培根相比的積極效果在于:
提供了一種新的山參資源，能夠工業(yè)集約化生產(chǎn)，不需要占用耕地，不受天氣、病蟲害等自然界條件的影響，實(shí)現(xiàn)了山參有效藥用成分生產(chǎn)化室內(nèi)；解決了人工種植山參的生長周期長，需15年以上才能采收I次，并且受氣候及病蟲害影響大導(dǎo)致質(zhì)量不穩(wěn)定的問題；同時(shí)也克服山參繁殖速度慢，遺傳上不夠穩(wěn)定等不利因素。山參發(fā)根可以周年不斷地提供山參資源，并能保證質(zhì)量的穩(wěn)定，由于山參發(fā)根是在人工控制下的無菌培養(yǎng)，生長周期短(約 40d)，因此處理工藝成本較低。
[0016]本發(fā)明山參發(fā)根具有生物學(xué)特征如下:
1、發(fā)根生長形態(tài)和農(nóng)桿堿的鑒定:轉(zhuǎn)化的山參發(fā)根無向地性，隨機(jī)交叉‘無序’生長，多 ‘根毛’，多分枝，生長快，具有典型的轉(zhuǎn)化發(fā)根特征。農(nóng)桿堿的鑒定表明Ri質(zhì)粒的T-DNA的確整合到山參細(xì)胞核DNA上，因?yàn)榘l(fā)根農(nóng)桿菌所含冠癭堿合成酶基因只能在真核生物中表達(dá)。
[0017]2、生長曲線:為一典型的S形曲線。培養(yǎng)30d可增殖20倍(參見圖4)。
[0018]3、山參發(fā)根培養(yǎng)基的篩選:對常用的多種培養(yǎng)基進(jìn)行比較的基礎(chǔ)上，對基培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化篩選。認(rèn)為:1/2MS液體培養(yǎng)基對其生長有利。pH5.(T6.0。
[0019]4、pH對山參發(fā)根生長的影響:在pH5.(T6.0的范圍內(nèi)，山參發(fā)根生長良好。
[0020]5、蔗糖濃度對山參發(fā)根生長的影響:在發(fā)根培養(yǎng)中，蔗糖是作為碳源和能源，還可調(diào)節(jié)培養(yǎng)液滲透壓，以蔗糖含量為2.(T4.0%為宜。
[0021]6、外源激素對山參發(fā)根生長的影響:本山參發(fā)根在無激素培養(yǎng)液內(nèi)可自行生長。
[0022]7、山參發(fā)根次生代謝物質(zhì):HPLC分析表明，發(fā)根中人參皂苷與原植物中所含人參阜苷相同，含量相近。
[0023]8、光對山參發(fā)根生長的影響:在室內(nèi)自然光下，光對山參發(fā)根生長表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用，其生物量僅為黑暗培養(yǎng)條件下的1/3?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0024]圖1是實(shí)施例1轉(zhuǎn)化山參發(fā)根培養(yǎng)的實(shí)物照片。
[0025]圖2是實(shí)施例2轉(zhuǎn)化山參發(fā)根培養(yǎng)的實(shí)物照片。
[0026]圖3是實(shí)施例3轉(zhuǎn)化山參發(fā)根培養(yǎng)的實(shí)物照片。
[0027]圖4為山參發(fā)根生長曲線。
[0028]【具體實(shí)施方式】 實(shí)施例1
取山參新鮮健康的根洗凈；用0.1%的升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗4次，每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超凈臺上將葉片切成0.5cmX 1.0cm大小，于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)疒7d。將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的山參外植體浸入已培養(yǎng)好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，感染5~10 min0再接種于含抗生素1/2MS固體培養(yǎng)基上(蔗糖含量為2%)，22°C~25°C下，約經(jīng)過30d至50d培養(yǎng)生出發(fā)根。切割下長出的發(fā)根，置于含抗生素頭孢噻吩300mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行去菌培養(yǎng)。在黑暗條件下，室溫22~25°C，IlOrpm，將無菌的發(fā)根經(jīng)3飛代的懸浮培養(yǎng)，可獲得不同的發(fā)根無性系(參見圖1轉(zhuǎn)化山參發(fā)根培養(yǎng)的實(shí)物照片)。
[0029]實(shí)施例2
取山參新鮮健康的莖洗凈；用0.1%的升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗4次，每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超凈臺上將葉片切成0.5cmX 1.0cm大小，于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)疒7d。將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的山參外植體浸入已培養(yǎng)好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，感染5~10 min0再接種于含抗生素1/2MS固體培養(yǎng)基上(蔗糖含量為3%)，22°C~25°C下，約經(jīng)過30d至50d培養(yǎng)生出發(fā)根。切割下長出的發(fā)根，置于含抗生素頭孢噻吩400mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行去菌培養(yǎng)。在黑暗條件下`，室溫22~25°C，IlOrpm，將無菌的發(fā)根經(jīng)3飛代的懸浮培養(yǎng)，可獲得不同的發(fā)根無性系(參見圖2)。
[0030]實(shí)施例3
取山參新鮮健康的葉片洗凈；用0.1%的升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗4次，每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超凈臺上將葉片切成0.5cmX 1.0cm大小，于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)疒7d。將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的山參外植體浸入已培養(yǎng)好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，感染5~10 min0再接種于含抗生素1/2MS固體培養(yǎng)基上(蔗糖含量為4%)，22°C~25°C下，約經(jīng)過30d至50d培養(yǎng)生出發(fā)根。切割下長出的發(fā)根，置于含抗生素頭孢噻吩500mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行去菌培養(yǎng)。在黑暗條件下，室溫22~25°C，IlOrpm，將無菌的發(fā)根經(jīng)3飛代的懸浮培養(yǎng)，可獲得不同的發(fā)根無性系(參見圖3)。
【權(quán)利要求】
1.一種山參發(fā)根的制備方法，其特征在于:以山參根、莖及葉片等為外植體，用活化了的發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使發(fā)根農(nóng)桿菌Ri 質(zhì)粒上的T-DNA上的致發(fā)根基因整合到山參外植體細(xì)胞核DNA中，表達(dá)形成毛狀根；每一根山參發(fā)根即為一個(gè)單克隆，經(jīng)過繼代培養(yǎng)和多次篩選，逐步建立起山參懸浮培養(yǎng)無性系。
2.—種山參發(fā)根的制備方法，包括以下步驟:1)外植體的預(yù)培養(yǎng):取山參新鮮、健康的根或莖或葉片，洗凈；用0.1%的升汞滅菌lOmin，無菌水漂洗4次， 每次不少于Imin,然后吸干表面水分；再于超凈臺上將外植體切成0.5cmXl.0cm大小,轉(zhuǎn)移到已滅菌的1/2MS固體培養(yǎng)基上；于黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2~7d ；2)發(fā)根農(nóng)桿菌的制備:挑取發(fā)根農(nóng)桿菌單菌落，接種于5mL液體YEB內(nèi)，28°C黑暗條件下振蕩培養(yǎng)過夜，于次日接種到50ml液體YEB中繼培養(yǎng)4~6h后備用；3)山參葉片與發(fā)根農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化:將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的山參外植體浸入已培養(yǎng)好的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，感染5~10 min，然后，用無菌濾紙將菌液吸凈；再接種于含抗生素1/2MS 固體培養(yǎng)基上，約經(jīng)過30cT50d培養(yǎng)生出發(fā)根；4)發(fā)根培養(yǎng):去菌培養(yǎng):切割下由外植體上長出的發(fā)根，置于含抗生素(頭孢噻吩30(T500mg/L)的 1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行去菌培養(yǎng)，每:T5d轉(zhuǎn)繼代I次，進(jìn)行3飛次；擴(kuò)大培養(yǎng):將無菌的發(fā)根1.(`^移入盛有501!^ 1/2MS液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶內(nèi)，于黑暗條件下，室溫22°C~25°C，llOrpm，懸浮培養(yǎng)；山參發(fā)根無性系的建立:經(jīng)3飛代的懸浮培養(yǎng)，按發(fā)根克隆的來源分別建立不同的無性系。
【文檔編號】A01H5/06GK103555758SQ201310498167
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】李昌禹, 王英平, 盧淑波, 艾軍, 鄭培和, 雷秀娟 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所