一種黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的一種黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法，包括以下步驟：精液低溫冷藏儲(chǔ)存：將采集到的黃金鱸魚的精液與儲(chǔ)存液混勻，得精子儲(chǔ)藏液，2-6℃冷藏儲(chǔ)存；精液超低溫冷凍貯藏：將精子儲(chǔ)藏液與冷凍保護(hù)劑混勻，分次降溫，再置于液氮中貯藏。本發(fā)明提供的黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法工藝簡(jiǎn)單、成本低廉，能有效延長(zhǎng)黃金鱸魚精子的體外存活時(shí)間，保護(hù)了精子的完整性，顯著提高了黃金鱸魚精子的生存指數(shù)，保持其受精活力。
【專利說明】一種黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物繁殖【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃金自盧魚(Perea fIavescens),分布較廣，是分布在北美五大湖的一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的淡水魚類，曾經(jīng)是 北美歷史上最大的漁業(yè)產(chǎn)業(yè)。近年來，由于過度捕撈、水體污染等原因，黃金鱸魚捕撈量銳減，造成了野生捕撈量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需求量。為彌補(bǔ)這種缺失，黃金鱸魚的人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，然而，和其他養(yǎng)殖魚類相比，黃金鱸魚生長(zhǎng)速度較慢，雌雄魚生長(zhǎng)差異顯著，發(fā)育不同步，并且性成熟過早(一齡成熟)，多數(shù)雄魚很難達(dá)到商品規(guī)格，極大地限制了黃金鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0003]通過遺傳改良措施，提高其生長(zhǎng)性能，成為黃金鱸產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要措施之一。然而，由于黃金鱸具有雌雄魚個(gè)體差異較大，性腺發(fā)育不同步等生理缺陷，往往難于同時(shí)得到成熟的精子和成熟的卵子，無法進(jìn)行人工授精，使得遺傳選育和雜交組合難以實(shí)施。因此，必須開展對(duì)黃金鱸魚的精子貯藏研究，以便于進(jìn)行人工繁殖，進(jìn)而實(shí)施遺傳選育和改良，對(duì)物種資源加以開發(fā)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種能夠有效延長(zhǎng)黃金鱸魚精子的體外存活時(shí)間的超低溫冷凍貯藏方法。
[0005]技術(shù)方案:本發(fā)明提供的一種黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法，包括以下步驟:
[0006](I)精液低溫冷藏儲(chǔ)存:將采集到的黃金鱸魚的精液與儲(chǔ)存液混勻，得精子儲(chǔ)藏液，2-6 °C冷藏儲(chǔ)存；
[0007](2)精液超低溫冷凍貯藏:將精子儲(chǔ)藏液與冷凍保護(hù)劑混勻，分次降溫，依次為:在-15°C環(huán)境中靜置l_3min，在-15°C環(huán)境中靜置l_3min，在_40°C環(huán)境中靜置l_3min，在_80°C環(huán)境中靜置l_3min，在-110°C環(huán)境中靜置l_3min，在_160°C環(huán)境中靜置4_6min ；再置于液氮中貯藏。
[0008]其中，步驟(1)中，黃金鱸魚的精液與儲(chǔ)存液的體積比為1: (10-20)，冷藏儲(chǔ)存時(shí)間為3-24h。
[0009]其中，步驟(1)中，儲(chǔ)存液配方為:
[0010]NaCIB.0Og/丨,；
KCl0.40g/1.;
?:--Ι:1,.2!!4)0.16β/L；
MgSO^THlOO, 20g/L；
Na^fIPOl0.06g/L；
KHsFOiCl 06g/L；
NaHCO30.35 g/L；
C6IL2Ofi (glucoso)1.00g/L?
[0011]其中，步驟(2)中，精子儲(chǔ)藏液與冷凍保護(hù)劑的體積比為1: (1-5)。
[0012]其中，步驟(2)中，冷凍保護(hù)劑為甲醇、二甲亞砜或甘油。
`[0013]有益效果:本發(fā)明提供的黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法工藝簡(jiǎn)單、成本低廉，能有效延長(zhǎng)黃金鱸魚精子的體外存活時(shí)間，保護(hù)了精子的完整性，顯著提高了黃金鱸魚精子的生存指數(shù)，保持其受精活力；從而從根本上解決了黃金鱸雄魚精液少、雌雄魚發(fā)育不同步等技術(shù)問，使其可用于黃金鱸魚親本的人工授精題，實(shí)現(xiàn)黃金鱸魚的人工授精，進(jìn)而實(shí)施遺傳選育，實(shí)現(xiàn)黃金鱸魚的遺傳選育和人工雜交組合技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為采用本發(fā)明貯藏方法超低溫冷凍黃金鱸魚的精液解凍后，檢測(cè)精子活力的顯微圖譜(目鏡IOX物鏡20)。
【具體實(shí)施方式】
[0015]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0016]實(shí)施例1
[0017]黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法，包括以下步驟:
[0018]1、精液采集
[0019]抓取雄魚放入干毛巾中，吸干體表水后，用手指擠壓其腹部?jī)蓚?cè)，待精液流出后，用經(jīng)75%酒精消毒的膠頭滴管吸取精液；
[0020]精子能動(dòng)性檢測(cè):取2μ L精液，加入20μ L去離子水混勻置于載玻片上，蓋上玻片，用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)，只有能向前運(yùn)動(dòng)的精子被認(rèn)為有活力(靜止在同一地方運(yùn)動(dòng)的則視為無活力)，以百分比來計(jì)算其能動(dòng)性，測(cè)得精子能動(dòng)性為85.33%。
[0021]2、精液冷凍儲(chǔ)存:
[0022]( I)冷凍儲(chǔ)存液
[0023]配方:
[0024]NaCl8.0O g/?.；
KCl0.40 g/L；
CaC 1L>*21 tf)0.16 g/L;
MgSO1.7Ii,00.20 g/L；
NaJlPO10.06 g/L；
Kll1PO10,06 g/1.；
Na!ICO,0.35 g/L；
CbISA (glucose)LOO g/L,,
[0025]其制備方法，包括以下步驟:
[0026]a.將600mL去離子水和一個(gè)磁力攪拌子放入I升燒杯中；
[0027]b.加入配方量的組份，并用磁力攪拌器攪拌，直至溶解；
[0028]c.用滲透壓摩爾測(cè)定儀測(cè)定其摩爾濃度(單位:m0smol/kg);
[0029]d.用去離子水稀釋至配方濃度，溶液滲透壓濃度為300m0smol/kg ;
[0030]e.貼上標(biāo)簽 ，置于4°C冰箱保存；
[0031]f.若以上冷凍儲(chǔ)存液超過一個(gè)星期不使用，需用0.22 μ m濾膜過濾后再使用。
[0032](3)低溫儲(chǔ)存
[0033]將采集到的精液置于干凈的容器中，加入相對(duì)于精液體積15倍的儲(chǔ)存液中，4°C保藏；24h后，測(cè)得精子能動(dòng)性為78.02%。
[0034](4)超低溫冷凍貯藏
[0035]將精子儲(chǔ)存液分別以1:2(精液:甲醇)的比例稀釋后各取lml，置于2ml EP管中，做好標(biāo)記(并事先在小瓶上系好線)，放于液氮罐的小提桶口。在小提桶沿液氮罐(IOL) 口分幾步下降，分段降溫。每步大約降3cm，其間停留2分鐘(每步相應(yīng)的溫度分別為-15°C，-40°C, -80°C, _110°C，用低溫溫度計(jì)測(cè)得)，最后降至約_160°C (約在液氮面以上4cm處)再停留5分鐘，然后投入液氮中保存。
[0036](5)解凍并復(fù)蘇:
[0037]按-40°C 7分鐘，-30°C 14分鐘，_20°C 21分鐘進(jìn)行復(fù)蘇，分別在0、15、30min檢測(cè)
其能動(dòng)性。
[0038]解凍后，精子活力的顯微圖譜見圖1，載玻片中有活力的精子；精子能動(dòng)性檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0039]表1解凍后的精子能動(dòng)性檢測(cè)結(jié)果
[0040]

I活力精子I精子總數(shù)I能動(dòng)性％~

Omin~ 75TTl67.57
ISmin 549954.55
30min 57TTi50[0041]檢測(cè)結(jié)果表明，此方法獲得的解凍后的精子活力較大，能動(dòng)性比例較高。因此，本發(fā)明的方法可以作為長(zhǎng)期貯藏黃金鱸魚精子的有效方法。
[0042]實(shí)施例2
[0043]黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法，包括以下步驟:
[0044]1、精液采集
[0045]抓取雄魚放入干毛巾中，吸干體表水后，用手指擠壓其腹部?jī)蓚?cè)，待精液流出后，用經(jīng)75%酒精消毒的膠頭滴管吸取精液；
[0046]精子能動(dòng)性檢測(cè):取2μ L精液，加入20μ L去離子水混勻置于載玻片上，蓋上玻片，用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)，只有能向前運(yùn)動(dòng)的精子被認(rèn)為有活力(靜止在同一地方運(yùn)動(dòng)的則視為無活力)，以百分比來計(jì)算其能動(dòng)性，測(cè)得精子能動(dòng)性為70.21%。
[0047]2、精液冷凍儲(chǔ)存:
[0048]( I)冷凍儲(chǔ)存液
[0049]配方:
[0050]
膩18.00 g/L；
KCl0.40 g/L；
CaCI,.211,00.16 g/L；
MgSO4* TH2O0.20 g/L；
Na2HPO40.0S g/L;
KII1PO10.06 g/L；
Nali(X)i0.35 g/L?
Celii2Oe (glucose)1.00 g/U
[0051]
[0052]其制備方法，包括以下步驟:
[0053]a.將600mL去離子水和一個(gè)磁力攪拌子放入I升燒杯中；
[0054]b.加入配方量的組份，并用磁力攪拌器攪拌，直至溶解；
[0055]c.用滲透壓摩爾測(cè) 定儀測(cè)定其摩爾濃度(單位:m0smol/kg);
[0056]d.用去離子水稀釋至配方濃度，溶液滲透壓濃度為300m0smol/kg ;
[0057]e.貼上標(biāo)簽，置于4°C冰箱保存；
[0058]f.若以上冷凍儲(chǔ)存液超過一個(gè)星期不使用，需用0.22 μ m濾膜過濾后再使用。
[0059](3)低溫儲(chǔ)存
[0060]將采集到的精液置于干凈的容器中，加入相對(duì)于精液體積10倍的儲(chǔ)存液中，6°C保藏；12h后，測(cè)得精子能動(dòng)性為63.97%。
[0061](4)超低溫冷凍貯藏
[0062]將精子儲(chǔ)存液分別以1:2(精液:二甲亞砜)的比例稀釋后各取lml，置于2ml EP管中，做好標(biāo)記(并事先在小瓶上系好線)，放于液氮罐的小提桶口。在小提桶沿液氮罐(IOL) 口分幾步下降，分段降溫。每步大約降3cm，其間停留3分鐘(每步相應(yīng)的溫度分別為-15°C，-40°C, -80°C, _110°C，用低溫溫度計(jì)測(cè)得)，最后降至約_160°C (約在液氮面以上4cm處)再停留4分鐘，然后投入液氮中保存。
[0063](5)解凍并復(fù)蘇:
[0064]按-40°C 7分鐘，-30°C 14分鐘，_20°C 21分鐘進(jìn)行復(fù)蘇，分別在0、15、30min檢測(cè)
其能動(dòng)性。
[0065]精子能動(dòng)性檢測(cè)結(jié)果見表2。
[0066]表2解凍后的精子能動(dòng)性檢測(cè)結(jié)果
[0067]
【權(quán)利要求】
1.一種黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)精液低溫冷藏儲(chǔ)存:將采集到的黃金鱸魚的精液與儲(chǔ)存液混勻，得精子儲(chǔ)藏液，2-6 °C冷藏儲(chǔ)存； (2)精液超低溫冷凍貯藏:將精子儲(chǔ)藏液與冷凍保護(hù)劑混勻，分次降溫，依次為:在_15°C環(huán)境中靜置l_3min，在-15°C環(huán)境中靜置l_3min，在_40°C環(huán)境中靜置l_3min，在_80°C環(huán)境中靜置l_3min，在-110°C環(huán)境中靜置l_3min，在_160°C環(huán)境中靜置4_6min ；再置于液氮中貯藏。
2.權(quán)利要求1所述的一種黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法，其特征在于:步驟(1)中，黃金鱸魚的精液與儲(chǔ)存液的體積比為1: (10-20)，冷藏儲(chǔ)存時(shí)間為3-24h。
3.權(quán)利要求1所述的一種黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法，其特征在于:步驟(1)中，儲(chǔ)存液配方為:NaCI8.00 g/LjKCIO, ,10 g/l.; CaCl3'2113O0.16 g/L; igSa,*?H200.20 g/L；Na2HP0.,0.06 g/L;KH2Pft10.06 g/L；NaHCO30.35 g/L; C6Hi2Oti (glycosc)LOO g/L?
4.權(quán)利要求1所述的一種黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法，其特征在于:步驟(2)中，精子儲(chǔ)藏液與冷凍保護(hù)劑的體積比為1: (1-5)。
5.權(quán)利要求1所述的一種黃金鱸魚的精子超低溫冷凍貯藏方法，其特征在于:步驟(2)中，冷凍保護(hù)劑為甲醇、二甲亞砜或甘油。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK103563886SQ201310479333
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】葉旭紅, 邱崇文, 林先貴, 劉青華 申請(qǐng)人:蘇州依科曼生物農(nóng)業(yè)科技有限公司