與植物耐冷性相關(guān)的ltp蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與植物耐冷性相關(guān)的LTP蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在如下a1）或a2）中的應(yīng)用：a1）調(diào)控植物耐冷性；a2）選育耐冷植物品種。實(shí)驗(yàn)證明，利用由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因培育耐冷植物，該方法具有操作簡(jiǎn)單、周期短的特點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用。本發(fā)明所獲得的轉(zhuǎn)LTP基因水稻經(jīng)低溫處理后存活率仍可達(dá)100%。該方法對(duì)于植物耐冷性分子機(jī)制的研究、耐冷品種的選育以及植物耐冷性分子育種具有重要的理論及實(shí)際意義，為提高植物的耐冷性提供了一條經(jīng)濟(jì)、快速、有效的途徑。
【專利說(shuō)明】與植物耐冷性相關(guān)的LTP蛋白及其編碼基因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種與植物耐冷性相關(guān)的LTP蛋白及其編碼基因 與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是重要的糧食作物，冷害是影響我國(guó)長(zhǎng)江中下游早稻種植區(qū)和東北、西北稻 區(qū)及云貴高原一季稻區(qū)水稻生產(chǎn)的重要因子之一。水稻芽期、苗期如遭遇冷害，將導(dǎo)致水 稻幼苗生長(zhǎng)遲緩、分蘗減少，嚴(yán)重者甚至還會(huì)出現(xiàn)大面積的僵苗、死苗現(xiàn)象，最終造成水稻 產(chǎn)量的大幅度降低，因此迫切需要培育出耐冷的水稻品種。普通野生稻是亞洲栽培稻的祖 先種，野生稻在演化成栽培稻的過(guò)程中，經(jīng)過(guò)自然選擇和人工選擇，基因多樣性降低、等位 基因數(shù)減少。據(jù)統(tǒng)計(jì)，栽培稻的等位基因數(shù)約為野生稻的60% (Sun C Q，Wang X K，Li Z C, Yoshimura A. Comparison of the genetic diversity of common wild rice (Oryza rufipogon Griff. )and cultivated rice(0. sativa L.)using RFLP markers. Theor Appl Genet, 2001,102:157-162),從而導(dǎo)致當(dāng)前水稻品種選育所面臨的遺傳瓶頸問(wèn)題。因此從水 稻近緣野生種的（普通野生稻Oryza rufipogon Griff.)基因組中發(fā)掘和利用在栽培稻中 已丟失或削弱的優(yōu)異基因，并把它們應(yīng)用于水稻育種生產(chǎn)中具有十分重要的理論意義和實(shí) 踐價(jià)值，也是解決當(dāng)前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。
[0003] 江西東鄉(xiāng)普通野生稻是目前世界上分布生境最北的野生稻之一，具有極強(qiáng)的耐冷 性，它的地下莖能耐-12.8° C的低溫并可安全越冬（Chen D Z，Xiao Y Q，Zhao S X，Xiong H J, Pi Y H, Luo L J. Studies on cold tolerance of seedling and heading stage in Dongxiang wild rice. Acta Agric Jiangxi,1996,8:1-6(in Chinese) ；Chen D Z, Xiao Y Q, Zhao S X, Pi Y H, Xiong H J, Luo L J. Genetic study on the cold tolerance of Dongxiang wild rice at the seedling stage. Acta Agric Jiangxi,1997,9:56-59 (in Chinese))，而當(dāng)前栽培稻無(wú)一具此抗性，因此江西東鄉(xiāng)普通野生稻是水稻耐冷性研究的理 想材料。Liu et al. (Liu F X，Sun C Q，Tan L B，Li D J，F(xiàn)u Y C，Wang X K. Identification and mapping of quantitative trait loci controlling cold-tolerance of Chinese common wild rice (0. rufipogon Griff. ) at booting to flowering stages. Chinese Science Bulletin，2003,48:2068-2071)報(bào)道了 3個(gè)來(lái)自江西東鄉(xiāng)普通野生稻的數(shù)量性狀 位點(diǎn)（QTL)能提高栽培稻受體親本(桂朝2號(hào)）孕穗開花期的耐冷性，進(jìn)一步證實(shí)了從江西 東鄉(xiāng)普通野生稻中發(fā)掘耐冷基因的可行性。
[0004] 我國(guó)野生稻資源豐富，從野生稻中發(fā)掘、定位和克隆耐冷相關(guān)基因不僅為培育超 耐冷新品種提供新基因和新技術(shù)，而且對(duì)加強(qiáng)我國(guó)野生稻基因資源的保護(hù)、將資源優(yōu)勢(shì)變 成經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)具有重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與植物耐冷性相關(guān)的LTP蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所提供的應(yīng)用，具體為如下A或B :
[0007] A :由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(命名為L(zhǎng)TP)在如下al)或 a2)中的應(yīng)用：
[0008] al)調(diào)控植物耐冷性；
[0009] a2)選育耐冷植物品種。
[0010] B :由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因(命名為L(zhǎng)TP)在 如下al)或a2)中的應(yīng)用：
[0011] al)調(diào)控植物耐冷性；
[0012] a2)選育耐冷植物品種。
[0013] 本發(fā)明還提供一種培育耐冷轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0014] 本發(fā)明所提供的培育耐冷轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟：
[0015] a)向目的植物中導(dǎo)入由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼 基因，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物；
[0016] b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比耐冷性提高的轉(zhuǎn)基因植 物。
[0017] 在上述應(yīng)用或方法中，所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的 編碼基因（即LTP基因）是如下1)至4)中任一所述的DNA分子：
[0018] 1)編碼序列為序列表中序列2自5'末端第11至295位核苷酸所示的DNA分子；
[0019] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0020] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列1所示的 氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0021] 4)與1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列 1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0022] 上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS 和 1 X SSC，(λ 1%SDS 各洗膜一次。
[0023] 在上述方法中，所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基 因具體是通過(guò)含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中的。
[0024] 在上述應(yīng)用或方法中，所述植物即可為單子葉植物，也可為雙子葉植物。
[0025] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物為單子葉植物，具體為水稻，更加具體為水稻 品種中花17。
[0026] 本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱為L(zhǎng)TP,來(lái)源于稻屬普通野生稻（0. ruf ipogon Griff.)，是如下 a)或 b):
[0027] a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0028] b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且與植物抗鹽相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；
[0029] 序列表中序列1由94個(gè)氨基酸殘基組成。
[0030] 為了便于LTP蛋白的純化，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白 質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。
[0031] 表：標(biāo)簽的序列
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在如下al)或a2)中的應(yīng)用： al)調(diào)控植物耐冷性； a2)選育耐冷植物品種。
2. 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因在如下al)或a2)中 的應(yīng)用： al)調(diào)控植物耐冷性； a2)選育耐冷植物品種。
3. 培育耐冷轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟： a) 向目的植物中導(dǎo)入由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因， 得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物； b) 從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比耐冷性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述由序 列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是如下1)至4)中任一所述的 DNA分子： 1) 編碼序列為序列表中序列2自5'末端第11至295位核苷酸所示的DNA分子； 2) 序列表中序列2所示的DNA分子； 3) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列1所示的氨基 酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子； 4) 與1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列1所 示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列1所示的氨基 酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是通過(guò)含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入 所述目的植物中的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于：所述植物為單子葉植物 或雙子葉植物。
7. 下述任一生物材料： (I) 蛋白質(zhì)，是如下a)或b): a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且 與植物抗鹽相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)； (II) 編碼（I)中所述蛋白質(zhì)的核酸分子；所述核酸分子是如下1)至4)中任一所述的 DNA分子： 1) 編碼序列為序列表中序列2自5'末端第11至295位核苷酸所示的DNA分子； 2) 序列表中序列2所示的DNA分子； 3) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列1所示的氨基 酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子； 4) 與1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列1所 示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子； (II)含有（Π )中所述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的生物材料，其特征在于：所述重組載體為重組表達(dá)載體或重 組克隆載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，或權(quán)利要求8所述的生物材料，其特征在于：所述重組 表達(dá)載體中啟動(dòng)所述蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子是super啟動(dòng)子。
10. 權(quán)利要求7中所述的重組載體、所述的表達(dá)盒、所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或所述的重組 菌在如下al)或a2)中的應(yīng)用： al)調(diào)控植物耐冷性； a2)選育耐冷植物品種； 所述植物具體為單子葉植物或雙子葉植物。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104140461SQ201310163458
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月7日
【發(fā)明者】劉鳳霞, 付永彩, 譚祿賓, 朱作峰, 顧憑, 才宏偉, 孫傳清 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)