專(zhuān)利名稱(chēng)：一株印楝內(nèi)生炭角菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有廣譜抗菌活性的微生物菌株。
背景技術(shù)：
印楝indica A. Juss)屬楝科植物,為熱帶樹(shù)種,具有較高的生物農(nóng)藥和醫(yī)藥價(jià)值。印度研究人員曾經(jīng)從生長(zhǎng)在印度的印楝植物中分離和鑒定了內(nèi)生真菌(Rajagopal K et al, Current Science, 2000, 78, 1375; Mahesh B et al, CurrentScience, 2005, 88, 218; Verma VC et al, Microbial Ecology, 2007, 54, 119)。我們從生長(zhǎng)在云南省元江縣的印楝植物中分離獲得了內(nèi)生真菌，并研究了其種類(lèi)組成和抗菌活性的篩選(邵士成，吳少華等，天rJf產(chǎn)參級(jí)貧與·萬(wàn)發(fā)，2007，19, 761 ;邵士成，吳少華等，生物多樣性，2008，16, 63)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分離自中國(guó)云南省元江縣印楝indicaA. Juss)植物活體中具有廣譜抗菌活性的微生物菌株一印楝內(nèi)生炭角菌。本發(fā)明所述的印楝內(nèi)生炭角菌系從中國(guó)云南省元江縣印楝植物活體中分離獲得?，F(xiàn)在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局認(rèn)可的保藏單位保藏，保藏單位名稱(chēng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，保藏單位地址中國(guó)，武漢大學(xué)，郵政編碼430072。保藏日期為2012年9月19日，保藏編號(hào)為CCTCC No: M 2012365。本發(fā)明所述的印楝內(nèi)生炭角菌命名為炭角菌YM311647U>7aria sp. YM311647)，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局認(rèn)可的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCC No: M 2012365。菌株YM311647的固體培養(yǎng)特征
I、PDA培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)5d，菌落直徑達(dá)5. 2cm,菌落平展，初為白色，短絨狀，氣生菌絲呈輻射狀生長(zhǎng)，邊緣逐漸開(kāi)始變黑。15d后在菌落邊緣處出現(xiàn)黑色棍棒狀子座組織，形成一明顯的輪紋，邊緣呈平緩圓弧狀。2、麥芽汁培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)5d，菌落直徑達(dá)6. 4cm，菌絲呈輻射狀生長(zhǎng)，中央部分白色有突起，邊緣菌絲逐漸變老，呈絨毛狀。3、查氏培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)，菌落生長(zhǎng)緩慢，菌落初為白色，短絨狀，菌絲輻射狀生長(zhǎng)，培養(yǎng)7d，菌落直徑達(dá)4. 2cm，菌落中心維持白色，邊緣開(kāi)始慢慢變黑。菌株YM311647的子座形態(tài)特征(見(jiàn)圖I)
子座環(huán)生，長(zhǎng)I. 5cm-4. 5cm,粗I. 5 mm _2mm,大量分枝,柄長(zhǎng)約1cm。頂端有白色不孕小尖，長(zhǎng)約2mm。子座外部碳化為黑色，表面黑色痂質(zhì)，有小孔。內(nèi)部仍為白色。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，子座變長(zhǎng)變細(xì)，白色尖端消失。生長(zhǎng)過(guò)程中未見(jiàn)子囊孢子產(chǎn)生。菌株YM311647的分子生物學(xué)特征
采用分子生物學(xué)PCR技術(shù)，DNA序列測(cè)定分析，YM 311647菌株ITS rDNA基因組由539個(gè)堿基(bp)組成。以ITS rDNA序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，該菌與炭角菌屬具有較高的親緣關(guān)系，與已知種辦venosula的ITS rDNA序列同源性達(dá)98. 7%,有I個(gè)堿基的差異(圖2)。菌株YM311647的發(fā)酵培養(yǎng)特征
I、培養(yǎng)基PDB培養(yǎng)基。2、培養(yǎng)溫度28±21。3、發(fā)酵時(shí)間7天。4、發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第I天，有零星的白色菌絲點(diǎn)出現(xiàn)；培養(yǎng)第3天，發(fā)酵液中出現(xiàn)少量白色菌絲；培養(yǎng)第5天，白色菌絲逐漸增多，有少量菌絲帖壁；培養(yǎng)第7天，長(zhǎng)滿(mǎn)灰白色菌絲體，發(fā)酵液粘稠。菌株YM311647的發(fā)酵工藝如下
菌種——活化——一級(jí)種子(PDA培養(yǎng)基)——培養(yǎng)(28±2°C，5-7天)——接種——二級(jí)種子(PDB培養(yǎng)基，搖床200 r/min，28±2°C，3-4天)——接種(按5%接種量)——發(fā)酵(PDB培養(yǎng)基，搖床200 r/min，28±2°C，7天)——發(fā)酵物。上述發(fā)酵工藝中的發(fā)酵條件如下
I、發(fā)酵方式液體發(fā)酵。2、種子培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水I升煮沸30分鐘，過(guò)濾，濾液加水補(bǔ)足至I升，加入葡萄糖20克，pH自然。上述培養(yǎng)基中加入15克瓊脂，即為PDA培養(yǎng)基。3、發(fā)酵培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)。4、培養(yǎng)時(shí)間菌種活化培養(yǎng)5-7天，種子搖床培養(yǎng)3-4天，發(fā)酵搖床培養(yǎng)7天。5、培養(yǎng)溫度種子和發(fā)酵培養(yǎng)溫度均為28 ± 2 °C。6、發(fā)酵完畢，加入等體積95%乙醇浸提48小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮至干，加入無(wú)菌水制得抗菌發(fā)酵液制品。本發(fā)明所述的菌株YM311647的抗菌活性試驗(yàn)
I、病原指示菌共9株人體致病真菌包括白色念珠菌{Candida albicans)、星^形石膏樣毛癬菌、Trichophyton gypseum);植物病原真菌包括稻痕霉iPyriculariaoryzae ) >trytis ciflerea )、禾谷鍵刀菌 QFusarium《raffiifleara )、燕麥鍵抱
iFusarium;細(xì)菌包括金黃色葡萄球菌{Staphylococcus atfreus)、大腸桿菌
iBscherichia coli)(fseudomonas aeruginosa) ο2.病原指示菌培養(yǎng)基細(xì)菌類(lèi)指示菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；皮膚致病真菌類(lèi)指示菌采用沙氏培養(yǎng)基；植物病原真菌類(lèi)指示菌采用PDA培養(yǎng)基。3.內(nèi)生真菌的培養(yǎng)
將印楝內(nèi)生炭角菌菌株YM311647接入含7 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶，置于28±2 ° C搖床(200 r/ min)培養(yǎng)7d，加入等體積95 %乙醇浸提48小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮至干，得發(fā)酵液提取物樣品備用。4.抗菌活性的測(cè)定
在長(zhǎng)有指示菌的固體斜面培養(yǎng)基中加入ImL無(wú)菌水，震蕩片刻制成指示菌懸液。將發(fā)酵液提取物樣品用無(wú)菌水溶解，配制成濃度為lmg/mL的溶液，用PDB液體培養(yǎng)基將樣品分別倍比稀釋為 6 個(gè)濃度lmg/mL、500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62. 5mg/mL、31. 25mg/mL。按每孔50μ 將樣品分別加入到96孔板中，再向每孔中加入50μ 活性指示菌菌懸液，以不加菌液的孔為空白對(duì)照，設(shè)置3個(gè)平行處理。將96孔板置于28 ±1°C(真菌)或37±1°C(細(xì)菌)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，肉眼觀測(cè)活性指示菌的生長(zhǎng)狀況，以沒(méi)有指示菌生長(zhǎng)的樣品最低濃度為最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果顯示，菌株YM311647的發(fā)酵液提取物樣品對(duì)9種病原指示菌白色念珠菌、星形石膏樣毛癬菌、稻瘟霉、灰葡萄孢、禾谷鐮刀菌、燕麥鐮孢、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠色假單孢菌的MIC值分別為62. 5、125、250、125、125、250、62. 5、31. 25、250mg/mL。本發(fā)明首次從印楝植物(Azadirach ta indi ca)中分離獲得內(nèi)生真菌菌株YM311647，確定為炭角菌)，發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)2種人體致病真菌、4種植物病原真菌和3種細(xì)菌，共9種病原微生物具有比較明顯的抑制生長(zhǎng)作用。本發(fā)明利用植物內(nèi)生真菌資源，通過(guò)發(fā)酵獲得農(nóng)用或醫(yī)用新型天然抗菌藥物活性成分。


圖I為本發(fā)明所述的炭角菌YM311647的子座形態(tài)特征。圖2為本發(fā)明所述的炭角菌YM311647同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一
炭角菌YM311647菌株是通過(guò)發(fā)酵獲得農(nóng)用或醫(yī)用新型天然抗菌藥物活性成分的微生物藥源。取YM311647菌種，在無(wú)菌條件下用接種針挑取少量菌絲，接種于裝有已滅菌的PDA培養(yǎng)基試管中，置培養(yǎng)箱內(nèi)于28±2° C活化培養(yǎng)5-7天，備用。在無(wú)菌條件下，將活化好的菌種以相同方法接入已滅菌的一級(jí)種子PDB培養(yǎng)基中，在28±2° C培養(yǎng)3-4天，即為YM311647菌株的一級(jí)種子。將配制好的PDB培養(yǎng)基IOOml裝入500ml三角瓶?jī)?nèi)，121°C滅菌30分鐘備用。取YM311647菌株的一級(jí)種子，在無(wú)菌條件下接種于裝有100ml PDB培養(yǎng)基的500ml三角瓶?jī)?nèi)，接種量按7-10% (v/v)計(jì)，置于28±2° C搖床(200 r/min)培養(yǎng)7天，期間注意檢查有無(wú)染菌現(xiàn)象。發(fā)酵完畢，向發(fā)酵液中加入等體積95 %乙醇浸提48小時(shí)，過(guò)濾，將濾液濃縮至干，加入無(wú)菌水即制成抗菌發(fā)酵液樣品。
權(quán)利要求
1.一種印楝內(nèi)生炭角菌，其特征在于命名為炭角菌YM311647 (Jylaria sp.YM311647)，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCC No M 2012365。
2.按照權(quán)利要求I所述的印楝內(nèi)生炭角菌，其特征是其ITSrDNA基因組由539個(gè)堿基組成，序列如下I taaccctgtg aacctacctt tgttgcctcg gcaggtctgc aacctaccct gagagtccct61 accctgtagg gaccttaccc ggtagttgcg ggcataacct gccggtggtc taccaaactc121tgtttactatgttattctgataaataagttacaacggatc181tcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcaga241attcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccattagtattctagtgggcat301gcctgttcgagcgtcatttcaacccttaagccctgttgcttagcgttgggagcctacaga361tacactctgtagttccttaaagttagtggcggagtcggtttcacactctagacgtagtaa421attttatctcgcctatagatgagccggtcccttgccgtaaaaccccctaatttctaaagg481ttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcgcggaggaao
3.--種印楝內(nèi)生炭角菌的用途，其特征在于用于制備抗菌藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種具有廣譜抗菌活性的微生物菌株。本發(fā)明所述的印楝內(nèi)生炭角菌命名為炭角菌YM311647(Xylariasp.YM311647)，現(xiàn)保藏在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位，保藏編號(hào)為CCTCCNoM2012365。該菌株為首次從印楝植物(Azadirachtaindica)中分離獲得,對(duì)2種人體致病真菌、4種植物病原真菌和3種細(xì)菌，共9種病原微生物具有比較明顯的抑制生長(zhǎng)作用。本發(fā)明利用植物內(nèi)生真菌資源，通過(guò)發(fā)酵獲得農(nóng)用或醫(yī)用的新型天然抗菌藥物活性成分。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102936570SQ20121039927
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者吳少華, 苗翠蘋(píng), 陳有為 申請(qǐng)人:云南大學(xué)