專利名稱：杏黃兜蘭的繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體地,涉及一種5 蘭屬(Paphiopedilum)杏黃5 蘭(P. armeniacum S. C. Chen et F. Y. Liu)種子繁殖方法。
背景技術(shù)：
5 蘭屬(Paphiopedilum)隸屬于蘭科杓蘭亞科(Cypripedioideae),目前總共有79個野生種類記錄在案，其中約1/3產(chǎn)自中國。就種類而言，中國是世界上兜蘭屬植物最為豐富的國家，總種類達(dá)到27種(劉仲健等，2009)。兜蘭屬的顯著特征之一即為唇瓣特化成兜狀或拖鞋狀，故又稱“拖鞋蘭”或“仙履蘭”(羅毅波等，2005)。蘭科兜蘭屬植物(Paphiopedilum)以花形奇特，花色艷麗而享譽(yù)世界，豐富的花色和盛長的花期而廣受蘭花 愛好者及園藝學(xué)家的關(guān)注與喜愛，具有巨大的觀賞價值和市場價值。杏黃5 蘭(P.armeniacum S. C. Chen et F. Y. Liu)是產(chǎn)于我國的5 蘭原生種之一，主要生長于云南西部，如碧江、瀘水、保山等地海拔1400-2100米的石灰?guī)r壁積土處或多石而排水良好的北坡上。是兜蘭屬中罕見的黃花種類，其花色純黃，葉子具斑紋而被譽(yù)為“金兜”，是兜蘭中最引人注目的種類之一，與硬葉兜蘭(P.micranthum)并稱為“金童玉女”，一直受到人們的廣泛關(guān)注。80年代杏黃兜蘭在國際市場上的售價達(dá)到上百美元一株，到1992年為止，其已在美國蘭展會上70多次奪得大獎，是兜蘭中著名觀賞種。鑒于此種情況，杏黃兜蘭的野外種群被過度采集，受到嚴(yán)重破壞，再加上近年來生境破壞，其瀕危程度加劇，因此利用人工繁育方法提高杏黃兜蘭種苗繁殖率是解決杏黃兜蘭保護(hù)及商業(yè)化開發(fā)的重要技術(shù)。目前對于杏黃兜蘭常用的繁育方法是利用種子進(jìn)行無菌萌發(fā)，從而獲得實(shí)生苗。然而，杏黃3 蘭的種子在成熟后萌發(fā)通常十分困難(Arditti, 1982 ;Rasmussen, 1995)?，F(xiàn)有技術(shù)未解決杏黃兜蘭種子萌發(fā)最佳時期的技術(shù)問題，未提供一種杏黃兜蘭高效人工繁殖的方法和技術(shù)體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，提供了一種杏黃兜蘭種子繁殖的方法，利用形態(tài)解剖方法并結(jié)合種子無菌萌發(fā)技術(shù)，對杏黃兜蘭種子發(fā)育過程進(jìn)行觀察，分析萌發(fā)率較高時的種子形態(tài)特征，依賴確定杏黃兜蘭種子萌發(fā)率最高時的最佳時間，選擇此期間的種子進(jìn)行播種，從而克服種子萌發(fā)困難的技術(shù)難題，為建立杏黃兜蘭高效人工繁殖技術(shù)體系提供了技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的杏黃兜蘭的繁殖方法，包括定植、授粉、確定種子最佳萌發(fā)時間并播種，所述定植是將杏黃兜蘭成年植株定植，所述授粉是在杏黃兜蘭開花時將其唇瓣去除，將位于雄蕊上的花粉粒取下，涂抹到雌蕊柱頭上進(jìn)行人工授粉，所述確定種子最佳萌發(fā)時間并播種是在杏黃兜蘭授粉時標(biāo)記時間，將授粉50天后的杏黃兜蘭種子在顯微鏡下觀察，確定出杏黃兜蘭種子的最佳萌發(fā)時 間時進(jìn)行播種。上述的杏黃兜蘭的繁殖方法，所述定植是將杏黃兜蘭成年植株定植于實(shí)驗(yàn)溫室中，其栽培條件為日溫25°C，夜溫18°C，光照強(qiáng)度300 μ mo I JiT2s'光照時間12h，相對濕度為60%，每10天澆一次水，同時每30天施以自配的含有氮、磷、鉀I : I : I的營養(yǎng)液一次。上述的杏黃兜蘭的繁殖方法，所述確定杏黃兜蘭種子最佳萌發(fā)時間是將授粉50天后的杏黃兜蘭種子固定在改良的FAA固定液中，利用GMA混合液包埋聚合，通過切片，在顯微鏡下觀察，當(dāng)種子胚發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為原胚體積增大，幾乎充滿整個胚囊，形成橢球形胚，胚柄由呈直線型排列的2-3個細(xì)胞組成時為杏黃兜蘭最佳萌發(fā)時間。上述的杏黃兜蘭的繁殖方法，所述改良FAA固定液其配方是38%的甲醛即福爾馬林5ml，冰醋酸5ml，50 %的酒精90ml。具體地，杏黃兜蘭的繁殖方法中，定植是將杏黃兜蘭成年植株定植于實(shí)驗(yàn)溫室中，其栽培條件為日溫25°c，夜溫18°C，光照強(qiáng)度300 μ mo I JiT2iT1,光照時間12h，相對濕度為60%，每10天澆一次水，同時每30天施以自配的含有氮、磷、鉀I : I : I的營養(yǎng)液一次；所述確定杏黃兜蘭種子最佳萌發(fā)時間并播種是將授粉50天后的杏黃兜蘭種子固定在配方為38 %的甲醛即福爾馬林5ml，冰醋酸5ml，50 %的酒精90ml的改良的FAA固定液中，利用GMA混合液包埋聚合，通過切片，在顯微鏡下觀察，當(dāng)種子胚發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為原胚體積增大，幾乎充滿整個胚囊，形成橢球形胚，胚柄由呈直線型排列的2-3個細(xì)胞組成時也就是授粉后90-110天為杏黃兜蘭最佳萌發(fā)時間時播種。


圖I 杏黃兜蘭種子胚發(fā)育過程，圖中 a 50DAP, b 70DAP, c 90DAP, d 110DAP, e 130DAP, f 140DAP, g 160DAP, h 180DAP ；em :胚細(xì)胞，fs :胚柄；圖2杏黃兜蘭授粉后天數(shù)與萌發(fā)率的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合本發(fā)明的附圖，通過本發(fā)明的具體實(shí)施例子進(jìn)一步來說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容,但并不以此來限定本發(fā)明。實(shí)施例I :確定杏黃兜蘭種子的最佳萌發(fā)時間的方法,杏黃兜蘭的繁殖方法I.材料和方法I. I研究材料杏黃覽蘭(P. armeniacum S. C. Chen et F. Y. Liu):分布在云南西部，生于海拔1400-2100米的石灰?guī)r壁積土處或多石而排水良好的草坡上。具細(xì)長而橫走的地下根狀莖，直徑2-3_，5-7枚葉，花純黃色，花葶15-28cm，唇瓣深囊狀，近橢圓狀球形或?qū)挋E圓形，花期2 4月，果實(shí)成熟期為8-9月。其種植于中國科學(xué)院昆明植物所蘭花溫室內(nèi)。溫室內(nèi)栽培條件為日溫25°C，夜溫18°C，光照強(qiáng)度300 μ molmpisp—1，光照時間12h，相對濕度為60%。每10天澆一次水，同時每30天施以自配的含有氮、磷、鉀(1:1: I)的營養(yǎng)液一次。
I. 2果莢采集2011年3月-5月期間，對開花的杏黃兜蘭進(jìn)行授粉，先將其唇瓣去除，用尖頭鑷子將位于雄蕊上的花粉粒取下，涂抹到雌蕊柱頭上，分別于授粉后50天、70天、90天、110天、130天、140天、160天、180天，隨機(jī)摘取果莢(每種2_3個)作為實(shí)驗(yàn)材料，且分別記為50DAP (授粉后的天數(shù))、70DAP、90DAP、11ODAP、130DAP、140DAP、160DAP、180DAP。I. 3胚發(fā)育過程的形態(tài)觀察
從杏黃兜蘭授粉后各個時期的果莢中取部分種子，浸泡于改良的FAA固定液，其配方是38%的甲醛(福爾馬林)5ml，冰醋酸5ml，50%的酒精90ml中24h以上，將種子按以下濃度順序置于50%、70%、80%、90%酒精溶液中各浸泡30min，在100%的無水乙醇溶液中浸泡lh，其后再換一次無水乙醇，繼續(xù)浸泡Ih ;之后在GMA(乙二醇甲基丙烯酸酯)混合液中浸透并包埋，該混合液含GMA90毫升，過氧化苯甲酰O. 18克，PEG-400(聚乙二醇-400)，置于60°C溫箱中聚合10h。用LEICARM2126RT轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)切片，切片厚度為5 μ m0I. 4無菌播種用肥皂水刷洗果莢，其后用75%酒精溶液浸泡I分鐘，無菌水沖洗3次，用O. 1%升汞溶液處理8分鐘后，無菌水沖洗5次，用滅菌手術(shù)刀將果莢小心地劃開，將種子播種于基本培養(yǎng)基為改良的Harvais培養(yǎng)基(見表一)(黃家林等，2000)，再加入2%的葡萄糖，5%的土豆提取物，O. 8%的瓊脂粉及l(fā)mg/L的激動素(KT)組成的播種培養(yǎng)基上，于25°C暗中培養(yǎng)。每個時期的果莢播種5瓶。播種80天后，從培養(yǎng)基上隨機(jī)取出2個IcmX Icm的瓊脂塊，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，用SPSS16.0軟件(SPSS Inc.，Chicago, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用sigmaplotlO. O (Systat SoftwareInc.，city, USA)軟件作圖。表一改良Harvais培養(yǎng)基組成
培養(yǎng)基組成成分用量Ca(NO3)2 · 4H20 4 00mg/LKH2PO4200mg/L
MgSO4· 7H20200mg/L
KNO3200mg/L
KCllOOmg/L
豐寧檬酸鐵銨25mg/L
MnSO4· 4H202.03mg/L
H3BO30. 5mg/L
ZnSO4 · 7H200. 5mg/L
權(quán)利要求
1.杏黃兜蘭的繁殖方法，包括定植、授粉、確定種子最佳萌發(fā)時間并播種，所述定植是將杏黃兜蘭成年植株定植，所述授粉是在杏黃兜蘭開花時將其唇瓣去除，將位于雄蕊上的花粉粒取下，涂抹到雌蕊柱頭上進(jìn)行人工授粉，所述確定種子最佳萌發(fā)時間并播種是在杏黃兜蘭授粉時標(biāo)記時間，將授粉50天后的杏黃兜蘭種子在顯微鏡下觀察，確定出杏黃兜蘭種子處于最佳萌發(fā)時間時進(jìn)行播種。
2.如權(quán)利要求I所述的杏黃兜蘭的繁殖方法，其特征在于所述定植是將杏黃兜蘭成年植株定植于實(shí)驗(yàn)溫室中，其栽培條件為日溫25°C，夜溫18°C，光照強(qiáng)度300iimol JiT2S'光照時間12h，相對濕度為60%，每10天澆一次水，同時每30天施以自配的含有氮、磷、鉀1:1:1的營養(yǎng)液一次。
3.如權(quán)利要求I所述的杏黃兜蘭的繁殖方法，其特征在于所述確定杏黃兜蘭種子最佳萌發(fā)時間是將授粉50天后的杏黃兜蘭種子固定在改良的FAA固定液中，利用GMA混合液包埋聚合，通過切片，在顯微鏡下觀察，當(dāng)種子胚發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為原胚體積增大，幾乎充滿整個胚囊，形成橢球形胚，胚柄由呈直線型排列的2-3個細(xì)胞組成時為杏黃兜蘭最佳萌發(fā)時間。
4.如權(quán)利要求I所述的杏黃兜蘭的繁殖方法，其特征在于所述的改良FAA固定液其配方是38 %的甲醛即福爾馬林5ml，冰醋酸5ml，50 %的酒精90ml。
5.如權(quán)利要求I所述的杏黃兜蘭的繁殖方法，其特征在于所述定植是將杏黃兜蘭成年植株定植于實(shí)驗(yàn)溫室中，其栽培條件為日溫25°C，夜溫18°C，光照強(qiáng)度300iimol JiT2S'光照時間12h，相對濕度為60%，每10天澆一次水，同時每30天施以自配的含有氮、磷、鉀1:1: I的營養(yǎng)液一次；所述確定杏黃兜蘭種子最佳萌發(fā)時間并播種是將授粉50天后的杏黃兜蘭種子固定在配方為38 %的甲醛即福爾馬林5ml，冰醋酸5ml，50 %的酒精90ml的改良的FAA固定液中，利用GMA混合液包埋聚合，通過切片，在顯微鏡下觀察，當(dāng)種子胚發(fā)育的形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為原胚體積增大，幾乎充滿整個胚囊，形成橢球形胚，胚柄由呈直線型排列的2-3個細(xì)胞組成時也就是授粉后90-110天為杏黃兜蘭最佳萌發(fā)時間時播種。
全文摘要
杏黃兜蘭的繁殖方法，先將杏黃兜蘭成年植株定植，在杏黃兜蘭開花時進(jìn)行人工授粉，授粉時標(biāo)記時間，取授粉90天-110天的杏黃兜蘭蒴果種子進(jìn)行播種。近年，杏黃兜蘭的野外種群被過度采集，受到嚴(yán)重破壞，瀕臨滅絕，需要通過人工繁育方法解決其保護(hù)及商業(yè)化開發(fā)的間題。杏黃兜蘭種子成熟后萌發(fā)較困難，本發(fā)明利用種子形態(tài)特征觀察及無菌萌發(fā)方法，確定杏黃兜蘭種子在授粉90天后，種子胚細(xì)胞形態(tài)特征表現(xiàn)為橢球形胚形成，胚柄呈現(xiàn)出由2-3個直線排列的細(xì)胞組成的性狀時，其種子萌發(fā)率最高，此方法可以確定杏黃兜蘭種子最佳萌發(fā)時間，為杏黃兜蘭高效人工繁殖技術(shù)體系的建立奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號A01G1/00GK102630464SQ20121011894
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月23日
發(fā)明者嚴(yán)寧, 張娟娟, 胡虹 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所