專(zhuān)利名稱(chēng):一種雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于食用菌培植技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法。
背景技術(shù):
雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)是一種廣泛栽培的食用菌,在現(xiàn)有的技術(shù)中,雙孢蘑菇的生產(chǎn)一般采用固體菌種,但固體菌種具有明顯的缺陷,主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、菌齡不一致、發(fā)菌速度慢、栽培種需用量大、生產(chǎn)成本高等方面,顯然不能滿足大規(guī)模的雙孢蘑菇栽培需求。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足,本發(fā)明的目的是提供一種雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,以滿足高效培育雙孢蘑菇的使用需求。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,包括以下步驟(1)取活化的0. 5cm2斜面母種接種到裝有60 120mL液體培養(yǎng)基的250mL培養(yǎng)瓶中,控溫21 27°C,90 180rpm振蕩培養(yǎng)5 7d得一級(jí)搖瓶菌種,按接種量為5 10%轉(zhuǎn)接一級(jí)種子到二級(jí)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),再將培養(yǎng)好的二級(jí)搖瓶液體菌種轉(zhuǎn)接到三級(jí)液體培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),相同方法依次進(jìn)行各級(jí)培養(yǎng)得種子液;其中,各級(jí)搖瓶培養(yǎng)條件相同,液體培養(yǎng)基配方為碳源,氮源 10 20g,KH2PO4 1 3g,MgSO4 0. 5 1. Sg5VB1 IOmg,/K IOOOmL, PH5 7 ;碳源為20 30g的麩皮、玉米粉、葡萄糖、果糖、甘露糖或蔗糖,或20 30mL麥芽汁;氮源為蛋白胨、酵母粉、玉米粉、硫酸銨或硝酸鉀;(2)將步驟(1)所得的種子液按5%的接種量接種至裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的IOL 發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),25°C培養(yǎng)5 6d,即可;其中,發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麥麩30g,玉米粉 10g,蛋白胨 lg,磷酸二氫鉀 0. 5g、硫酸鎂 IgJB1 10mg/L,水 IOOOmL, ρΗ6· 5。步驟(1)中,碳氮比(g/g或mL/g)優(yōu)選為3 1或2. 5 1. 5 ;步驟(1)中,碳源優(yōu)選為麩皮、玉米粉或麥芽汁;一級(jí)培養(yǎng)最優(yōu)選使用麥芽汁,二級(jí)培養(yǎng)最優(yōu)選使用玉米粉。步驟(1)中,氮源優(yōu)選為蛋白胨、酵母粉或玉米粉,最優(yōu)選為玉米粉。步驟(1)中,一級(jí)培養(yǎng)時(shí),液體培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為麥芽汁30mL,玉米粉10g, KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g, VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。步驟(1)中,二級(jí)培養(yǎng)時(shí),液體培養(yǎng)基的優(yōu)選配方為玉米粉10g,蛋白胨20g, KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g, VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。步驟(1)中,培養(yǎng)條件優(yōu)選為裝液量為90mL,控溫25°C,150rpm振蕩培養(yǎng)5 6d,
接種量為5%。有益效果與現(xiàn)有的固體培養(yǎng)雙孢蘑菇菌種方法相比,本發(fā)明的雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法具有的明顯優(yōu)勢(shì)包括生產(chǎn)周期短、菌齡一致、生產(chǎn)成本低、接種簡(jiǎn)便,一支試管種通過(guò)五級(jí)種培養(yǎng)就可以放大200000倍,液體二級(jí)菌種生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于固體傳統(tǒng)栽培種,速度提高了 33%,同時(shí),液體種各級(jí)之間的生長(zhǎng)速度并沒(méi)有太大差異,平均滿瓶時(shí)間是27. 5d,完全可以在工廠生產(chǎn)中實(shí)際應(yīng)用,具有很好的實(shí)用性,能夠產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)。
圖1是碳源對(duì)菌絲球生長(zhǎng)量結(jié)果圖;圖2是碳源對(duì)菌絲球數(shù)量影響結(jié)果圖;圖3是碳源對(duì)菌絲球直徑影響結(jié)果圖;圖4是氮源對(duì)菌絲球生長(zhǎng)量結(jié)果圖;圖5是不同碳氮比對(duì)菌絲球生長(zhǎng)量結(jié)果圖;圖6是pH值對(duì)生物量的影響結(jié)果圖;圖7是培養(yǎng)過(guò)程中pH值變化曲線圖;圖8是接種液體菌種與固體菌種生長(zhǎng)速度比較圖;圖9是不同濃度的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。以下實(shí)施例所使用的材料和方法為試驗(yàn)材料菌種為雙孢蘑菇。按照有機(jī)肥料中國(guó)人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY525-2002測(cè)定各種原料含碳量和
含氮量。菌絲體生物量測(cè)定將生長(zhǎng)良好、無(wú)污染的搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵液,經(jīng)4層紗布過(guò)濾,菌絲球生物量濕重為浙干后取固體物在電子天平上稱(chēng)重,菌絲球生物量干重則是直接過(guò)濾烘干稱(chēng)重。菌球直徑測(cè)定取ImL發(fā)酵液用水稀釋10倍,隨機(jī)取20個(gè)菌球在培養(yǎng)皿中沿固定的直線排成一行,用卡尺測(cè)定總長(zhǎng)度,重復(fù)3次,求其平均值。菌球密度測(cè)定取ImL均勻的發(fā)酵液用水稀釋10倍,于培養(yǎng)皿下墊置黑色方格紙計(jì)數(shù)。pH值測(cè)定采用酸度計(jì)測(cè)定pH值。還原糖測(cè)定取發(fā)酵液上清液按3,5- 二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖。菌絲生長(zhǎng)速度固體栽培種或是液體菌種相同接種量接種后,觀察菌絲在菌種瓶中萌發(fā),向下生長(zhǎng),直至生長(zhǎng)至瓶底的時(shí)間,即滿瓶時(shí)間。發(fā)酵罐參數(shù)測(cè)定IOL全自動(dòng)氣升式攪拌玻璃發(fā)酵罐裝液量為6L,以搖瓶試驗(yàn)得出的最佳液體培養(yǎng)基配方配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基,在發(fā)酵罐中經(jīng)過(guò)空消和發(fā)酵罐自身蒸汽 121°C下滅菌20min,待罐內(nèi)培養(yǎng)基溫度下降至25°C左右,按照5%接種量接種已經(jīng)活化好的液體菌種種子液,通入無(wú)菌空氣開(kāi)始控制培養(yǎng)發(fā)酵。按1 為間隔定時(shí)無(wú)菌取樣,其菌絲球生物量、菌絲球密度、菌絲球直徑,溶氧濃度和pH值以電極測(cè)量。
實(shí)施例1取活化的斜面母種約0. 5cm2的小塊接種到液體培養(yǎng)基中,于25°C恒溫振蕩培養(yǎng)得一級(jí)搖瓶菌種,再將培養(yǎng)好的一級(jí)搖瓶液體菌種轉(zhuǎn)接到各處理的二級(jí)液體菌種搖瓶中,依次進(jìn)行各級(jí)培養(yǎng),若無(wú)特殊說(shuō)明,各級(jí)搖瓶培養(yǎng)條件均為250mL三角瓶裝液量IOOmL,接種量5% (V/V),搖床轉(zhuǎn)速150r/min,25°C振蕩培養(yǎng)5 7d,同樣,其余各級(jí)液體菌種也是相同的培養(yǎng)方式。雙孢蘑菇液體菌種的液體培養(yǎng)基配方為氮源,碳源,KH2PO4 3g, MgSO4 1.5g, VB1 10mg,水1000mL,pH自然,121°C滅菌30min。用作雙孢蘑菇斜面培養(yǎng)的PDA通用培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g,蔗糖20g,水IOOOmL, pH自然,121°C滅菌20min,。(1)在液體培養(yǎng)基中,氮源為20g蛋白胨,碳源選擇麥芽汁、麩皮、玉米淀粉、果糖、 葡萄糖、甘露糖和蔗糖分別進(jìn)行培養(yǎng),其中,麥芽汁為30mL,麩皮、玉米淀粉、果糖、葡萄糖、 甘露糖和蔗糖均為30g。對(duì)雙孢蘑菇液體菌種菌絲球生物量進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1所示,在所測(cè)碳源中,雙孢蘑菇對(duì)麥芽汁的利用效果較好,雙孢蘑菇菌絲球生物量達(dá)15. 25g/100mL, 其次是麩皮、玉米淀粉,而對(duì)果糖的利用效果最差,生物量為3. 96g/100mL,利用率僅為麥芽汁的1/4。顯然,無(wú)論是從理論基礎(chǔ)還是生產(chǎn)實(shí)際出發(fā),麥芽汁來(lái)源廣泛,成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于化學(xué)試劑糖類(lèi)價(jià)格,從而用復(fù)合碳源麥芽汁的經(jīng)濟(jì)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于糖類(lèi)。不同碳源培養(yǎng)基對(duì)菌絲球數(shù)量、菌球直徑有重要影響,如圖2和圖3所示,菌球直徑最小的是麥芽汁培養(yǎng)基,菌球直徑平均為1. 7mm,單位體積發(fā)酵液中含有菌球數(shù)目465個(gè)/mL,其次是麩皮菌球直徑2. 1mm、 365個(gè)/mL,玉米淀粉菌球直徑2. 2mm,345個(gè)/mL。復(fù)合碳源的培養(yǎng)基能夠培養(yǎng)出大量的菌絲球,且菌球直徑較為均一,因此,在生產(chǎn)中復(fù)合碳源麥芽汁效果最佳。復(fù)合碳源營(yíng)養(yǎng)成分豐富,里面含有較多的固形物質(zhì),從而在菌絲利用時(shí)產(chǎn)生多種物質(zhì)使得黏度增大,在一定是黏度范圍內(nèi),黏度增大有利于菌絲的形成,有利于新的菌絲片段成長(zhǎng)為新的菌絲球萌發(fā)點(diǎn),過(guò)高或過(guò)低的黏度都對(duì)菌球的生長(zhǎng)和繁殖無(wú)益。而低分子碳源,由于其能直接被菌絲吸收利用,在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中提供充足的營(yíng)養(yǎng),使菌絲分枝、延伸, 菌絲生長(zhǎng)以變粗變大為特征,從而在后期出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不足,并引起菌絲內(nèi)部缺氧,形成較大的菌絲片段,以致影響了菌球的形成,致使菌球數(shù)目急劇降低,菌絲片段多,菌絲球較少,并且直徑不統(tǒng)一。(2)在液體培養(yǎng)基中,碳源為30mL麥芽汁,氮源選擇蛋白胨、酵母粉、玉米粉、牛肉膏、尿素、硫酸銨和硝酸鉀分別進(jìn)行培養(yǎng),其中,氮源各為20g。分別接種雙孢蘑菇,在25°C下?lián)u瓶培養(yǎng),測(cè)定雙孢蘑菇液體菌絲球生物量,結(jié)果如圖4所示,有機(jī)氮與無(wú)機(jī)氮相比,雙孢蘑菇對(duì)大多數(shù)有機(jī)氮的利用效率較高,生物量都較高,玉米粉和蛋白胨都是不錯(cuò)的氮源。對(duì)部分無(wú)機(jī)氮尿素等的利用效率最差,生物量為零。 在以上氮源中,玉米粉與其他氮源相比,產(chǎn)生的泡沫最少,泡沫增多會(huì)影響溶氧系數(shù),嚴(yán)重時(shí)造成大量逃液,增加污染幾率,所以最佳氮源是玉米粉或蛋白胨,由于玉米粉在增加粘性以及成本上的優(yōu)勢(shì),選擇玉米粉為氮源。(3)在液體培養(yǎng)基中,碳源為30mL麥芽汁,氮源為20g蛋白胨,并添加玉米粉進(jìn)行培養(yǎng),觀察玉米粉對(duì)雙孢蘑菇液體菌種菌絲生長(zhǎng)的影響,結(jié)果如表1所示,當(dāng)不添加玉米粉的時(shí)候,雙孢蘑菇菌絲生物量最小,菌球直徑大、數(shù)量少;隨著玉米粉添加量的增大,菌絲生物量也隨之增大,當(dāng)添加量達(dá)到2% (質(zhì)量比,下同)時(shí),菌球生物量反而變小,可能液體黏性過(guò)大,液體搖動(dòng)振蕩速率降低,影響液體中溶氧性,菌絲大量生長(zhǎng)時(shí)由于沒(méi)有得到充分的氧氣而在后期生長(zhǎng)緩慢。而玉米粉添加量在1%、1. 5%時(shí),液體黏性較為合適,氧氣供應(yīng)充足,并且碳氮比均比較適合雙孢蘑菇菌絲生長(zhǎng),菌絲適應(yīng)強(qiáng),很快誘導(dǎo)菌絲萌發(fā)生長(zhǎng),得到大量直徑均一的菌絲球,并且生物量也處于最高點(diǎn),因此,玉米粉添加量?jī)?yōu)選為1 %。玉米粉不僅可以作為氮源,也作為增黏劑,同時(shí)玉米粉還能提供一定的有機(jī)質(zhì)營(yíng)養(yǎng),這樣玉米粉可以同時(shí)滿足幾個(gè)生長(zhǎng)因素,但這是相對(duì)最經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的,玉米粉在其中被徹底利用,是對(duì)資源的充分利用。表1玉米粉含量對(duì)雙孢蘑菇菌絲生物量影響
添加量(% )0 I 0. 5 IITo~175~2. 0
生物量(g/100mL)3TT2 9 95 15. 12 13.96 9. 16
菌球直徑(mm)279 Γθ h2 7 1.9
菌球數(shù)量(個(gè) /mL) 53 268 569 514 351(4)在液體培養(yǎng)基中,碳源為麥芽汁,氮源為玉米粉,進(jìn)行七個(gè)不同的配比方案培養(yǎng),觀察其對(duì)雙孢蘑菇液體培養(yǎng)的影響。分別比較了不同配比下,對(duì)菌絲生物量的影響,從而初步確認(rèn)最佳碳氮比,結(jié)果如圖5所示,在碳源充足的情況下,隨著氮源的增加,生物量也隨之逐漸增加,當(dāng)碳源比為3 1時(shí)(麥芽汁30mL,玉米粉IOg),生物量達(dá)到最大值;而當(dāng)?shù)闯渥悖荚粗饾u減少的時(shí)候,生物量隨著碳源的降低而減少。同時(shí)對(duì)培養(yǎng)液的PH值研究發(fā)現(xiàn),氮源過(guò)多時(shí),滅菌后PH值會(huì)偏高;碳源豐富時(shí),PH值會(huì)出現(xiàn)偏低,過(guò)高或者過(guò)低的PH值都不利于雙胞蘑菇菌絲的生長(zhǎng)。因此,碳源、氮源并非越多越好,而是要有一個(gè)適當(dāng)?shù)谋壤攀亲钸m合雙孢蘑菇液體菌種菌絲生長(zhǎng),優(yōu)選比例為3 1或2.5 2.5。(5)在液體培養(yǎng)基中,碳源為30mL麥芽汁,氮源為IOg玉米粉,分別對(duì)硫酸鎂和磷酸二氫鉀做了十個(gè)不同濃度的培養(yǎng)。結(jié)果如圖9所示,添加不同含量的硫酸鎂和磷酸二氫鉀對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,當(dāng)硫酸鎂添加量小于0. 05%時(shí),隨著其含量的增加,雙孢蘑菇生物量也成正比例增加,當(dāng)含量為0. 05時(shí),達(dá)到最大值;然后,生物量隨著硫酸鎂含量的增加成下降趨勢(shì)。當(dāng)磷酸二氫鉀含量在0. 10%之前,生物量隨著含量的增加而增大,當(dāng)含量為0. 10%時(shí),生物量達(dá)到最大值,這說(shuō)明低濃度的無(wú)機(jī)鹽對(duì)雙孢蘑菇有促進(jìn)作用,而高濃度反而不利于其生長(zhǎng)。所以,在雙孢蘑菇液體培養(yǎng)基中應(yīng)添加硫酸鎂0.05%,磷酸二氫鉀 0. 10%。(6)在液體培養(yǎng)基中,碳源為30mL麥芽汁,氮源為IOg玉米粉,硫酸鎂為0. 5g,磷酸二氫鉀為lg,改變培養(yǎng)基初始PH值以確定其液體培養(yǎng)最合適的初始pH值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖 6和7所示,pH值對(duì)液體菌種生物量的影響呈現(xiàn)鐘罩型的曲線,起始pH值不同導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)束時(shí)雙孢蘑菇菌絲生物量的不同,并觀察到雙孢蘑菇生長(zhǎng)PH值的上下臨界點(diǎn),當(dāng)pH值小于 4或者大于8. 5的時(shí)候,雙孢蘑菇菌絲不能生長(zhǎng),在pH值在6. 5之前,隨著pH值的上升,菌絲生物量也隨之增大;當(dāng)PH值達(dá)到6. 5時(shí),菌絲生物量達(dá)到最大值;隨著pH值的逐步增大, 菌絲生物量也逐步降低。在PH6-7之間,pH值變化情況對(duì)菌絲生物量的影響尤為顯著,因?yàn)槌跏糚H值給微生物提供了一個(gè)適宜生長(zhǎng)的環(huán)境,生物酶處于最適狀態(tài),菌絲不需經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的適應(yīng)過(guò)程就直接開(kāi)始新陳代謝作用。初始PH值6. 5培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)過(guò)程中,pH
6值有一定逐漸變小的趨勢(shì),初始階段變化不太明顯,至培養(yǎng)3d后,pH值開(kāi)始明顯下降;培養(yǎng)末期,PH值大約比初始pH值6. 5降低1左右,pH值的降低,培養(yǎng)液酸性增強(qiáng),會(huì)對(duì)代謝過(guò)程產(chǎn)生一些反饋抑制,降低生物各種酶的活性,影響菌絲生長(zhǎng);同時(shí)使液體培養(yǎng)基更容易被其他細(xì)菌污染,影響整個(gè)發(fā)酵過(guò)程,所以應(yīng)該適當(dāng)縮短液體培養(yǎng)時(shí)間,降低污染率,因此選擇 PH值6. 5作為液體培養(yǎng)基的初始pH值。至此,得出雙孢蘑菇液體菌種的優(yōu)選培養(yǎng)基配方為麥芽汁30mL,玉米粉10g, KH2P043g MgSO4L 5g, VB1IOmg,水 IOOOmL, ρΗ6· 5。(7)在雙孢蘑菇液體菌種的優(yōu)選培養(yǎng)基(麥芽汁30mL,玉米粉10g,KH2P043g MgSO4L 5g,VB1IOmg,水lOOOmL,pH6. 5)中,選擇不同的培養(yǎng)溫度培養(yǎng)雙孢蘑菇液體菌種,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,從表中數(shù)據(jù)可以看出,25°C時(shí),除了菌球直徑并非最佳結(jié)果外,其余標(biāo)準(zhǔn)均處于最佳水平菌絲球生物量9. ^g/100mL,菌絲球密度421個(gè)/mL,同時(shí)還可以發(fā)現(xiàn),在 25°C上下波動(dòng)范圍之內(nèi),對(duì)菌絲生物量并沒(méi)有直接顯著的影響,因此,選擇25°C作為最適培養(yǎng)溫度。表2培養(yǎng)溫度對(duì)雙孢蘑菇菌絲生物量的影響
培養(yǎng)溫度菌絲球生物量菌絲球密度(個(gè)^菌絲球直徑~
(0C)(g/100mL)/mL)(mm)
219 3389L09
239 8382L20
25926421ΓΤθ
278^91393 Λ
29 2273L26(8)在雙孢蘑菇液體菌種的優(yōu)選培養(yǎng)基(麥芽汁30mL,玉米粉10g,KH2P043g MgS041. 5g,VBllOmgjjC lOOOmL,pH6. 5)中接種培養(yǎng)雙孢蘑菇,通過(guò)改變搖瓶的裝液量和搖床轉(zhuǎn)速,考察溶氧水平對(duì)雙孢蘑菇菌絲球生物量、菌絲球密度、菌絲球直徑等參數(shù)的影響, 結(jié)果如表3所示,搖床轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí),菌絲生物量處于最大值,而裝液量分別在90mL、 120mL、250mL時(shí),差別并不是特別明顯,考慮到裝液量過(guò)多會(huì)造成溢液從而容易導(dǎo)致培養(yǎng)液的污染,因此,最佳裝液量為90mL/250mL,搖床轉(zhuǎn)速為150r/min。表3裝液量和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)雙孢蘑菇生物量的影響生物量菌絲球密度(個(gè)菌絲球直徑
(g/100mL)/mL)(mm)
Γ^Ο 6^98258L22
~60 SM3ΠL23
裝液量 926386L09
(mL/250mL) 120 9Λ7389ΓΤΙ
"Τ50 8Λ7314U3
" δΟ 743297Γ 4
90 497151L59
二一、…士 1205Α4263L51
搖床轉(zhuǎn)速____
15010.263661.10
(r/min)----
1803.711391.00
Ο23 9103091實(shí)施例2試管種轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)液中,需要及時(shí)從培養(yǎng)液中獲取豐富的營(yíng)養(yǎng),才能迅速適應(yīng)液體而非先前生長(zhǎng)的固體斜面培養(yǎng)基環(huán)境,因此,需要一級(jí)液體培養(yǎng)液中能夠提供充分的營(yíng)養(yǎng),縮短菌絲生長(zhǎng)適應(yīng)過(guò)程,得到比較符合標(biāo)準(zhǔn)的液體菌種。當(dāng)以一級(jí)液體種作為種子繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí),需要考慮其生長(zhǎng)環(huán)境的改變,此時(shí)不同的碳源對(duì)其生長(zhǎng)的影響最為明顯。 按一定的接種量將實(shí)施例1最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的液體種接種到二級(jí)液體培養(yǎng)液中,在二級(jí)液體培養(yǎng)液中和選擇不同碳源進(jìn)行培養(yǎng),其結(jié)果如表4所示,一級(jí)液體種中最合適的碳源麥芽汁對(duì)二級(jí)種的作用并不十分顯著,相反倒是麩皮與葡萄糖對(duì)菌絲生物量影響明顯。在以上各種不同碳源培養(yǎng)時(shí),菌球生長(zhǎng)的形態(tài)都有各自的特點(diǎn),其中蔗糖、甘露醇、麥芽汁作為碳源時(shí),菌絲球大小不均,而麩皮和葡萄糖中的菌絲球大小一致,直徑大約是Imm左右,呈典型的圓形菌球。經(jīng)過(guò)比較分析可知,以麩皮作為碳源培養(yǎng)的菌絲球無(wú)論是生物量還是菌絲球密度、菌絲球直徑各個(gè)方面都適合液體菌種生產(chǎn)的要求,所以選擇麩皮作為二級(jí)液體種的碳源。二級(jí)液體培養(yǎng)其余的營(yíng)養(yǎng)成分及培養(yǎng)條件均與一級(jí)液體菌種各個(gè)條件一致,即玉米粉作為氮源(添加量為)、磷酸二氫鉀0. 05%、硫酸鎂0. 10%、VBl 少量。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25°C、初始pH值6. 5、裝液量90mL/250mL、搖床轉(zhuǎn)速150r/min。表4不同碳源對(duì)雙孢蘑菇二級(jí)液體菌種的影響
生物量(g/100mL) 菌絲球密度(個(gè)/mL) 菌絲球直徑(mm)~ 葡萄糖11.23395 ΓΟΟ
麥芽汁3 432940 8權(quán)利要求
1.一種雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于,包括以下步驟(1)取活化的0.5cm2斜面母種接種到裝有6(Tl20mL液體培養(yǎng)基的250mL培養(yǎng)瓶中, 控溫2廣27°C,9(Tl80rpm振蕩培養(yǎng)5 7d得一級(jí)搖瓶菌種,按接種量為5 10%轉(zhuǎn)接一級(jí)種子到二級(jí)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),再將培養(yǎng)好的二級(jí)搖瓶液體菌種轉(zhuǎn)接到三級(jí)液體培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),相同方法依次進(jìn)行各級(jí)培養(yǎng)得種子液;其中,各級(jí)搖瓶培養(yǎng)條件相同,液體培養(yǎng)基配方為碳源,氮源 10 20g,KH2PO4 廣3g,MgSO4 0. 5 1. 5g,VB1 10mg,水 IOOOmL, pH5 7 ;碳源為 2(T30g的麩皮、玉米粉、葡萄糖、果糖、甘露糖或蔗糖,或2(T30mL麥芽汁;氮源為蛋白胨、酵母粉、玉米粉、硫酸銨或硝酸鉀;(2)將步驟(1)所得的種子液按5%的接種量接種至裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的IOL發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),25°C培養(yǎng)5飛d,即可;其中,發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麥麩30g,玉米粉10g,蛋白胨 lg,磷酸二氫鉀 0. 5g、硫酸鎂 IgJB1 10mg/L,水 IOOOmL, ρΗ6· 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于步驟(1) 中,碳氮比為3:1或2.5:1.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于步驟(1) 中,碳源為麩皮、玉米粉或麥芽汁。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于步驟(1) 中,碳源為麥芽汁。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于步驟(1) 中,氮源為蛋白胨、酵母粉或玉米粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于步驟(1) 中,氮源為玉米粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于步驟(1) 中,一級(jí)培養(yǎng)時(shí)碳源為麥芽汁,二級(jí)培養(yǎng)時(shí)碳源為玉米粉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于步驟(1) 中,一級(jí)培養(yǎng)時(shí),液體培養(yǎng)基配方為麥芽汁30mL,玉米粉10g, KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g,VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于步驟(1) 中,二級(jí)培養(yǎng)時(shí),液體培養(yǎng)基配方為玉米粉10g,蛋白胨20g,KH2PO4 lg, MgSO4 0. 5g, VB1 10mg,7jC IOOOmL, pH6. 5。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,其特征在于步驟(1) 中,培養(yǎng)條件裝液量為90mL,控溫25°C,150rpm振蕩培養(yǎng)5飛d,接種量為5%。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雙孢蘑菇菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法,包括(1)取活化的0.5cm2斜面母種接種到裝有60~120mL液體培養(yǎng)基的250mL培養(yǎng)瓶中,控溫21~27℃,90~180rpm振蕩培養(yǎng)5~7d得一級(jí)搖瓶菌種,按接種量為5~10%轉(zhuǎn)接一級(jí)種子到二級(jí)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),再將培養(yǎng)好的二級(jí)搖瓶液體菌種轉(zhuǎn)接到三級(jí)液體培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),相同方法依次進(jìn)行各級(jí)培養(yǎng)得種子液;(2)將種子液按5%的接種量接種至裝有6L發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),25℃培養(yǎng)5~6d即可。該方法生產(chǎn)周期短、菌齡一致、生產(chǎn)成本低、接種簡(jiǎn)便,一支試管種通過(guò)五級(jí)種培養(yǎng)就可以放大200000倍,液體二級(jí)菌種生長(zhǎng)速度明顯優(yōu)于固體傳統(tǒng)栽培種,速度提高了33%,同時(shí),液體種各級(jí)之間的生長(zhǎng)速度并沒(méi)有太大差異,平均滿瓶時(shí)間是27.5d,完全可以在工廠生產(chǎn)中實(shí)際應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01G1/04GK102550293SQ201210023708
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月3日
發(fā)明者劉耀鴻, 劉輝, 華國(guó)棟, 孟德龍, 李冠喜, 溫以斌, 王多明 申請(qǐng)人:連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院