專利名稱：一種篩選耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特定種質(zhì)的篩選方法，特別涉及一種篩選耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的方法。屬于作物遺傳育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
土壤鹽堿化已經(jīng)成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素。據(jù)統(tǒng)計全世界鹽堿地的面積為 9. 5438億hm2，其中我國為9913萬hm2 (郭慶法，2004)。玉米既是重要的飼料和糧食作物，也是極其重要的工業(yè)原料，所以大力提高玉米綜合生產(chǎn)能力已經(jīng)成為目前一項緊迫的任務(wù)。 玉米是對鹽堿中度敏感的作物，只能在氯化鈉含量0. 3%以下的土壤上生長，這就極大的限制了玉米在鹽堿灘地上的生長(江春梅等，2001)。由于玉米的耐鹽性屬于數(shù)量性狀、現(xiàn)有可利用的耐鹽種質(zhì)資源匱乏，想要通過常規(guī)育種的方式大幅度的提高玉米的耐鹽堿性耗時費力、難度較大。近年來，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，其已經(jīng)廣泛應(yīng)用于玉米的抗逆育種中。 目前利用生物技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因玉米，是解決當(dāng)前土壤鹽堿化的一條行之有效的途徑之一。
利用基因工程技術(shù)培育玉米耐鹽新種質(zhì)已成為玉米耐鹽新技術(shù)育種的重要途徑。 劉巖等(1998)將大腸桿菌6-磷酸山梨醉脫氫酶基因gutD轉(zhuǎn)入玉米，使玉米耐鹽性明顯高于對照。何銘潔等(1999)利用基因槍法成功將甜菜堿醛脫氫酶基因?qū)胗衩?。通過對外源基因的分子檢測和耐鹽性分析，表明目的基因已整合入玉米基因組并正常表達，轉(zhuǎn)基因玉米耐鹽脅迫性明顯提高。Yin等Q004)將分離于擬南芥的液泡膜Na' /H"反向轉(zhuǎn)運蛋白基因NXtll導(dǎo)入玉米，提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽脅迫能力。劉祥久等Q005)利用花粉管通道法將抗旱基因和耐鹽種質(zhì)DNA導(dǎo)入玉米自交系。趙磊Q006)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米， 將膽堿單加氧酶基因(CMO)和甜菜堿醛脫氫酶基(BADH)成功轉(zhuǎn)入玉米自交系。通過對測定玉米愈傷組織、幼苗有關(guān)耐鹽堿性生理指標的試驗表明其抗鹽性有一定的提高。付光明等Q006)利用花粉管通通技術(shù)將BADH基因?qū)胗衩?，并且提高玉米的耐鹽性。轉(zhuǎn)基因玉米在鹽脅迫條件下所受傷害明顯低于非轉(zhuǎn)基因植株。程艷松等O008)將來自于擬南芥的 3個耐鹽基因S0S1、S0S2和S0S3導(dǎo)入玉米，抗性愈傷的耐鹽堿能力明顯高于非轉(zhuǎn)基因愈傷的耐鹽堿能力。
對轉(zhuǎn)基因玉米進行耐鹽性鑒定，是選育耐鹽性轉(zhuǎn)基因新種質(zhì)的關(guān)鍵步驟。現(xiàn)在小麥、水稻、番茄等作物在這方面的研究比較深入，可以作為玉米耐鹽性篩選和鑒定方法研究的參考。目前，國內(nèi)外對玉米耐鹽性篩選和鑒定方法的研究還少有報道，采用的具體方法主要有鹽水發(fā)芽鑒定法、盆栽鑒定法、海水灌溉和大田自然鑒定法，沒有較為理想的對于作物的耐鹽堿性的鑒定方法及篩選方法，因此，亟需加強這方面的研究。發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于篩選耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的方法。
本發(fā)明方法以玉米幼苗為檢測對象，采用特定濃度氯化鈉處理一定時間后，通過檢測與耐鹽性顯著相關(guān)的生理生化指標，進行數(shù)據(jù)處理后與受體對照相比較，根據(jù)數(shù)值來評價轉(zhuǎn)基因玉米耐鹽能力，以達到建立一個客觀準確的轉(zhuǎn)基因玉米耐鹽性評價方法的目的，并可進一步作為玉米耐鹽性篩選和鑒定方法研究的參考。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的
一種用于篩選耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的方法，其特征在于包括以下步驟
(1)玉米種子萌發(fā)
挑選供試發(fā)育良好的轉(zhuǎn)基因玉米種子和非轉(zhuǎn)基因受體對照種子，按照常規(guī)方法發(fā)芽；
(2)溫室內(nèi)玉米種子播種
取芽長一致的種子播種在裝有等量蛭石的花盆中，每天用適量的l/2H0agland營養(yǎng)液澆灌，溫室中培養(yǎng)；
(3)玉米幼苗鹽脅迫處理
幼苗長至三葉一心期時，每天用含有300mmol/L NaCl的l/2Hoagland營養(yǎng)液澆灌處理；
(4)玉米葉片生理生化指標的檢測
處理7d后，取玉米幼苗的第3片真葉的葉中部位0. Ig左右，測定幼苗的各項生理生化指標；
(5)玉米耐鹽能力評價
對生理生化指標檢測結(jié)果按照新復(fù)極差法進行方差分析和多重比較，依據(jù)生理生化指標的差異顯著性測驗結(jié)果進行賦值，a = l，b = 2，c = 3......以此類推，有字母重疊時只計第一個字母，并計算各項生理生化指標的平均值，依據(jù)轉(zhuǎn)基因后代株系的平均值與非轉(zhuǎn)基因受體對照值的差χ進行分級，分級標準為平均值與對照值之差χ < 0. 5，則轉(zhuǎn)基因玉米比對照耐鹽性提高0級，耐鹽性無提高；平均值與對照值之差0. 5 < χ < 1. 2，則轉(zhuǎn)基因玉米比對照耐鹽性提高1級，耐鹽性小幅提高；平均值與對照值之差1. 2 < χ < 1. 9， 轉(zhuǎn)基因玉米比對照耐鹽性提高2級，耐鹽性明顯提高；平均值與對照值之差1. 9 < X，轉(zhuǎn)基因玉米比對照耐鹽性提高3級，耐鹽性大幅提高；
(6)根據(jù)步驟( 所述的分級標準對供試玉米進行分級，根據(jù)需要選擇具有耐鹽性的轉(zhuǎn)基因玉米。
優(yōu)選的，為保持處理濃度的恒定，步驟(3)中所述的含有300mmol/L NaCl的 l/2H0agland營養(yǎng)液，其每澆灌一次的用量為蛭石持水量體積的二倍。
本發(fā)明所述的方法，其特征在于步驟中所述的生理生化指標包括超氧化物歧化酶SOD活性、過氧化物酶POD活性、過氧化氫酶CAT活性、相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量其中幾種或全部。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有的技術(shù)而言所具有的主要優(yōu)點和效果如下
1.適應(yīng)范圍廣。
本發(fā)明的一種用于篩選耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的方法除適用于篩選具有耐鹽性的轉(zhuǎn)基因玉米外，也適用于篩選具有耐鹽性的普通玉米種質(zhì)。
2.評價標準數(shù)值化，更客觀準確。
在篩選耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的過程中，由于玉米受體自身的耐鹽性級別較高，比受4體材料耐鹽性有明顯提高的材料無法進行準確評價。本發(fā)明利用玉米苗期鹽脅迫后與抗逆性相關(guān)的生理生化指標的變化，建立了新的耐鹽性評定體系，能夠更客觀的反應(yīng)轉(zhuǎn)基因材料比受體耐鹽性提高的程度。
3.本發(fā)明易于掌握，重復(fù)性高。
本發(fā)明使用轉(zhuǎn)基因玉米幼苗作為評價篩選對象，試驗材料容易獲得，一次可同時評價大量轉(zhuǎn)基因植株，操作方法易于掌握，重復(fù)性高。
本發(fā)明的主要創(chuàng)造點在于
(1)本發(fā)明對轉(zhuǎn)基因玉米苗期進行鹽脅迫處理，針對幼苗鹽脅迫后與抗逆性相關(guān)的生理生化指標的變化進行了詳細的研究，確立了耐鹽堿性評價的分級標準，建立了一種篩選耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的方法。
(2)本發(fā)明以轉(zhuǎn)基因玉米幼苗作為評價對象，試驗材料易于獲取，試驗周期短，效率高。
(3)本發(fā)明的一種篩選耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的方法具有適用范圍廣的特點，將評價標準數(shù)值化，更客觀準確，適用于篩選轉(zhuǎn)基因玉米與受體相比耐鹽性提高程度不同的玉米種質(zhì)。


圖1是發(fā)明的流程示意圖。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1
1試驗材料
7份玉米非轉(zhuǎn)基因受體常規(guī)自交系及32份轉(zhuǎn)BcWRKYI基因的玉米T2代株系均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所提供，見表1。
表132份供試玉米轉(zhuǎn)基因材料
權(quán)利要求
1.一種篩選耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的方法，其特征在于包括以下步驟(1)玉米種子萌發(fā)挑選供試發(fā)育良好的轉(zhuǎn)基因玉米種子和非轉(zhuǎn)基因受體對照種子，按照常規(guī)方法發(fā)芽；(2)溫室內(nèi)玉米種子播種取芽長一致的種子播種在裝有等量蛭石的花盆中，每天用適量的l/2H0agland營養(yǎng)液澆灌，溫室中培養(yǎng)；(3)玉米幼苗鹽脅迫處理幼苗長至三葉一心期時，每天用含有300mmol/L NaCl的l/2Hoagland營養(yǎng)液澆灌處理；(4)玉米葉片生理生化指標的檢測處理7d后，取玉米幼苗的第3片真葉的葉中部位0. Ig左右，測定幼苗的各項生理生化指標；(5)玉米耐鹽能力評價對生理生化指標檢測結(jié)果按照新復(fù)極差法進行方差分析和多重比較，依據(jù)生理生化指標的差異顯著性測驗結(jié)果進行賦值，a = l，b = 2，c = 3......以此類推，有字母重疊時只計第一個字母，并計算各項生理生化指標的平均值，依據(jù)轉(zhuǎn)基因后代株系的平均值與非轉(zhuǎn)基因受體對照值的差χ進行分級，分級標準為平均值與對照值之差χ ^ 0. 5，則轉(zhuǎn)基因玉米比對照耐鹽性提高0級，耐鹽性無提高；平均值與對照值之差0. 5 < χ < 1. 2，則轉(zhuǎn)基因玉米比對照耐鹽性提高1級，耐鹽性小幅提高；平均值與對照值之差1. 2 < χ < 1. 9，轉(zhuǎn)基因玉米比對照耐鹽性提高2級，耐鹽性明顯提高；平均值與對照值之差1. 9 < X，轉(zhuǎn)基因玉米比對照耐鹽性提高3級，耐鹽性大幅提高；(6)根據(jù)步驟( 所述的分級標準對供試玉米進行分級，根據(jù)需要選擇具有耐鹽性的轉(zhuǎn)基因玉米。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的含有300mmOl/LNaCl的 l/2H0agland營養(yǎng)液，其每澆灌一次的用量為蛭石持水量體積的二倍。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中所述的生理生化指標包括超氧化物歧化酶SOD活性、過氧化物酶POD活性、過氧化氫酶CAT活性、相對電導(dǎo)率、葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量其中幾種或全部。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的方法，它包括以下步驟(1)玉米種子萌發(fā)、(2)溫室內(nèi)玉米種子播種、(3)玉米植株鹽脅迫處理、(4)玉米葉片生理生化指標的檢測、(5)玉米耐鹽能力評價和(6)選擇具有耐鹽性的轉(zhuǎn)基因玉米。本發(fā)明的方法建立了一個適合玉米苗期耐鹽性評價的方法，該體系以玉米幼苗為檢測對象，用氯化鈉溶液灌澆處理后，通過對植株生理生化指標的檢測，達到建立一個客觀準確的轉(zhuǎn)基因玉米耐鹽性評價方法的目的，從而為耐鹽性轉(zhuǎn)基因玉米的篩選提供可靠的依據(jù)。
文檔編號A01H1/04GK102524054SQ20111043015
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者劉顯君, 單長建, 張 林, 曾興, 李新海, 王振華, 翁建峰, 蘆翠華, 邸宏 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)