專(zhuān)利名稱(chēng)：三倍體高甜苷羅漢果培育技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明結(jié)合植物組織培養(yǎng)、多倍體誘導(dǎo)和遺傳育種雜交技術(shù)，培育獲得三倍體高甜苷羅漢果，屬現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羅漢果果實(shí)性涼味甘，有清熱潤(rùn)肺、涼血、潤(rùn)腸通便的功效，特別是其中羅漢果甜苷V甜度約為蔗糖的300倍，是肥胖病人、糖尿病病人、高血壓病人理想的食品添加剤，它集天然甜味劑與保健品于一體，被國(guó)際公認(rèn)為綜合性狀最佳的天然甜味劑。羅漢果被認(rèn)為是ー種非常有潛力的甜味植物品種。長(zhǎng)期以來(lái)，由于羅漢果落后栽培技術(shù)，病毒病害嚴(yán)重，品種退化，導(dǎo)致羅漢果資源稀缺。近十年，經(jīng)過(guò)脫毒技木，羅漢果組培繁殖快速發(fā)展起來(lái)，但發(fā)現(xiàn)組培苗果實(shí)中籽粒多且大，不含甜苷成分的種子占整果的50%，整果利用率低，果實(shí)種子內(nèi)的油脂使提取液渾濁，増加了提取難度和成本，二倍體羅漢果甜苷的提取僅在1%左右。品種缺陷造成提取得率低的問(wèn)題很難通過(guò)改進(jìn)提取エ藝來(lái)得到解決，使得甜苷價(jià)格昂貴，僅能在高端產(chǎn)品中使用。這ー問(wèn)題制約了羅漢果種植業(yè)及其加工業(yè)的發(fā)展。 采用現(xiàn)代生物技術(shù)培育羅漢果苷含量高、果實(shí)結(jié)籽減少或無(wú)籽優(yōu)良羅漢果品種，對(duì)羅漢果產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大。通過(guò)人工誘導(dǎo)多倍體是現(xiàn)代育種工作的ー個(gè)重要手段。植物多倍體中含有較多的染色體組數(shù)，往往在體型上表現(xiàn)出巨大性和高抗逆境能力，而且多倍體植物在品質(zhì)和生物量上，都較二倍體優(yōu)越。特別是植物三倍體具有不結(jié)籽的特性，是解決羅漢果多籽缺陷的最有效途徑。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN101120653B公開(kāi)了無(wú)籽羅漢果及其培育方法，通過(guò)I)取二倍體羅漢果雌、雄株外植體繁育組培苗；2)取組培繼代苗，進(jìn)行染色體加倍的誘導(dǎo)；3)切取經(jīng)誘導(dǎo)處理后的雌、雄株的不同部位進(jìn)行分化培養(yǎng)；4)切取分化培養(yǎng)成的新芽莖尖和莖段進(jìn)行叢生芽培養(yǎng)；5)將培養(yǎng)成的完整植株進(jìn)行染色體數(shù)目檢測(cè)，篩選出四倍體植株進(jìn)行生根培養(yǎng)、煉苗；6)將四倍體植株和二倍體植株按常規(guī)技術(shù)種植，開(kāi)花時(shí)進(jìn)行人工授粉雜交，得到雜交種子；7)將雜交種子繁殖成完整植株，進(jìn)行染色體數(shù)目檢測(cè)；篩選出三倍體植株,生根培養(yǎng)、煉苗；8)將三倍體植株和二倍體植株種植，開(kāi)花時(shí)用二倍體雄株對(duì)三倍體的雌株人工授粉，雌株掛果后得到無(wú)籽羅漢果。本發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，上述技術(shù)存在獲得的四倍體和三倍體的不穩(wěn)定問(wèn)題，(能否進(jìn)ー步說(shuō)明ー下其不穩(wěn)定的表現(xiàn))，并且在其技術(shù)流程中經(jīng)秋水仙素處理，結(jié)合叢生芽誘導(dǎo)，獲得四倍體的周期長(zhǎng)，嵌合率高，重復(fù)性差，影響了該項(xiàng)技術(shù)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明采用幼胚獲得脫毒組培苗，嫩芽莖尖直接在秋水仙素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)染色體加倍，結(jié)合流式細(xì)胞重復(fù)鑒定分析，獲得穩(wěn)定四倍體，進(jìn)而與二倍體雜交獲得穩(wěn)定三倍體，大大縮短了四倍體誘導(dǎo)周期，使該項(xiàng)技術(shù)的生產(chǎn)應(yīng)用成為可能，本技術(shù)將通過(guò)大幅提高甜苷含量和整果利用率，迅速解決甜苷價(jià)格昂貴的瓶頸問(wèn)題，促進(jìn)羅漢果甜苷售價(jià)大幅降低和廣泛應(yīng)用于飲料、食品、保健品、藥品等行業(yè)(取代有副作用的其他甜味劑)，經(jīng)濟(jì)效益可觀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種適用于三倍體高甜苷羅漢果培育的生產(chǎn)技木。本發(fā)明三倍體高甜苷羅漢果的培育方法，具體步驟如下
I、取田間表型好的羅漢果鮮果，在超凈臺(tái)中進(jìn)行整果消毒先用75%こ醇消毒5-8分鐘，再用20%次氯酸鈉消毒15-20分鐘，最后無(wú)菌水沖洗3-5次。2、消毒完畢的整果在超凈臺(tái)中破殼，取出羅漢果種籽，于培養(yǎng)皿中剝出種仁，并將種仁放置于MS培養(yǎng)基中光照培養(yǎng),誘導(dǎo)出芽。3、待芽長(zhǎng)至15-20天左右，切取2-3片嫩葉提取DNA，RFLP分析進(jìn)行雌雄株鑒定。鑒定為雌株(見(jiàn)附圖I)的株系切取嫩芽莖尖，O. 2%秋水仙素誘導(dǎo)48-52小時(shí)，誘導(dǎo)后于MS 培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。CTAB法提取羅漢果基因組DNA方法如下
A.1//2U/3片葉在液氮中研成粉末(或用打樣機(jī))；
B.將樣品放入液氮凍過(guò)的EP管中，加65°C預(yù)熱2XCTABIml ；
C.65°C 水浴 Ih ；
D.カロ入等體積的酌·:氯仿:異戍醇(2524 :1)抽提,離心IOOOOrpm, IOmin,取上清；
E.加入等體積異丙醇，_2(TC沉淀20-30min；
F.IOOOOrpm離心IOmin,倒掉上清,70%こ醇，IOOOOrpm, IOmin,倒掉上清,晾干；
G.加30-50ul dd H2O 水溶解，-20°C 保存；
RFLP分析PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20ul)如下
水13. 2ul
IOXbuffer 2 ul dNTP0.4ul
引物Iul
TaqO. 4ul
DNA3ul
RFLP分析PCR擴(kuò)增程序
950C 3min,94°C 30sec, 32-36°C 60sec,72°C 90sec，30 個(gè)循環(huán)，72で 10min，4°C。
4、切取秋水仙素誘導(dǎo)30-40天左右的嫩芽葉片1-2片，進(jìn)行細(xì)胞流式分析并且重復(fù)3次以上均鑒定為四倍體(見(jiàn)附圖2)的株系繼續(xù)培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法如下
(I)配制緩沖液
A.緩沖液I (配制后室溫保存)45mmol/L MgCl2 ;30mmol/L朽1檬酸三鈉；20mmol/LMOPS ；0.1% (w/v) TritonX-100 ；pH 7. 0。100ml 緩沖液 I :
MgCl2 0. 915g
ニ水檸檬酸三鈉(λ 882g
MOPS 0.419g
TritonX-100 94ulB. PI 染液50 ug/ml PI 和 50 ug/ml Rnase (RNA 酶)的緩沖液 I。(2)取半片或者I片嫩葉，加入Iml冰冷緩沖液于培養(yǎng)皿，用刀片迅速快速切碎，過(guò)40um細(xì)胞過(guò)濾器到I. 5ml離心管,放置冰上,500rpm離心5min,棄上清至O. Iml刻度(即留少量液體)，加入500ulPI染液，放置冰上，避光。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。5、將獲得的四倍體雌株與商品性質(zhì)優(yōu)良的二倍體雄株雜交，秋季收獲果實(shí)并將果實(shí)內(nèi)種籽播種于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，45-60天左右，采集幼葉進(jìn)行流式細(xì)胞儀和RFLP分析。6、流式細(xì)胞儀和RFLP分析為三倍體雌株(見(jiàn)附圖3)的脫毒苗于次年春天種植后，與商品性質(zhì)優(yōu)良的二倍體雄株雜交，掛果后即得到三倍體無(wú)籽羅漢果(見(jiàn)附圖4)。三倍體無(wú)籽羅漢果果實(shí)表型普遍偏小，果型正常。果實(shí)與對(duì)照相比表現(xiàn)為高度不育，果實(shí)內(nèi)結(jié)幾顆種籽至無(wú)籽。7、三倍體高甜苷羅漢果總甜苷含量測(cè)定 (I)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制精密稱(chēng)取羅漢果甜苷VI 10. Omg于5ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至5ml,即標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為2. Omg/mlo(2)樣品溶液配制精密稱(chēng)取干燥的羅漢果粉末lg，置索氏提取器中，加入甲醇50ml，浸泡過(guò)夜，再加入甲醇40ml，提取6h，溶劑回收至干。以甲醇溶解，定容至25ml，精密吸取上清液10ml，置蒸發(fā)皿中水浴蒸干。以20ml蒸餾水分次溶解(15ml溶解，5ml洗滌)，并全部轉(zhuǎn)移至IOgAB-S吸附樹(shù)脂內(nèi)(こ醇浸泡，用時(shí)抽濾，稱(chēng)重)，控制流速，使緩慢流下，先用50ml蒸餾水慢慢洗去雜質(zhì)，然后用90%こ醇溶液30ml洗脫，收集醇液，水浴蒸干，殘?jiān)约状既芙?，定容至IOml,備用。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)精確吸取羅漢果甜苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液30、60、90、120、15(^1，分別加AlOml的容量瓶中，水浴揮盡溶劑，加新配制的香草醛_5 %冰醋酸溶液O. 2 ml，高氯酸
0.8ml，于60で水溶加熱15 min后取出，立即以冰水冷卻，加冰醋酸5 ml，并搖勻，靜置10 min后，于5 9 O n m處測(cè)定吸光度，并以標(biāo)準(zhǔn)品羅漢果甜苷濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為Y=0. 0137Χ-0. 0163 (R2=O. 9991)
(4)羅漢果中總甜苷含量測(cè)定精密吸取樣品液150μ 1，置容量瓶中，揮干溶劑，加入5%香草醛-冰醋酸溶液O. 2ml，高氯酸O. 8ml，60°C水浴加熱15min，立即以冰水浴冷卻，カロ入5ml冰醋酸，搖勻，IOmin后測(cè)定，其測(cè)定波長(zhǎng)λ =590nm，以隨行樹(shù)脂柱為空白，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出總甜苷含量。8、三倍體無(wú)籽羅漢果成熟果實(shí)中羅漢果苷含量3-5%之間，羅漢果的整果利用率增加45%以上，羅漢果苷含量增加80%以上。


圖I為羅漢果雌雄株的鑒定圖。
圖2為流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)羅漢果多倍體的倍性鑒定結(jié)果圖。
圖3為流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)羅漢果三倍體的鑒定圖。
圖4為無(wú)籽羅漢果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
I、取田間表型好的羅漢果鮮果，在超凈臺(tái)中進(jìn)行整果消毒先用75%こ醇消毒5分鐘，再用20%次氯酸鈉消毒15分鐘,最后無(wú)菌水沖洗3次。2、消毒完畢的整果在超凈臺(tái)中破殼，取出羅漢果種籽，于培養(yǎng)皿中剝出種仁，并將種仁放置于MS培養(yǎng)基中光照培養(yǎng),誘導(dǎo)出芽。3、待芽長(zhǎng)至15天，切取2片嫩葉提取DNA，RFLP分析進(jìn)行雌雄株鑒定。鑒定為雌株的株系切取嫩芽莖尖，O. 2%秋水仙素誘導(dǎo)48小時(shí)，誘導(dǎo)后于MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。4、切取秋水仙素誘導(dǎo)30天左右的嫩芽葉片2片，進(jìn)行細(xì)胞流式分析并且重復(fù)3次以上均鑒定為四倍體的株系繼續(xù)培養(yǎng)。5、將獲得的四倍體雌株與商品性質(zhì)優(yōu)良的二倍體雄株雜交，秋季收獲果實(shí)并將果實(shí)內(nèi)種籽播種于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，45天時(shí)，采集幼葉進(jìn)行流式細(xì)胞儀和RFLP分析。6、流式細(xì)胞儀和RFLP分析為三倍體雌株的脫毒苗于次年春天種植后，與商品性 質(zhì)優(yōu)良的二倍體雄株雜交，掛果后即得到三倍體高甜苷無(wú)籽羅漢果。7、羅漢果中總甜苷含量測(cè)定精密吸取樣品液150μ 1，置容量瓶中，揮干溶劑，カロ入5%香草醛-冰醋酸溶液O. 2ml，高氯酸O. 8ml，60°C水浴加熱15min，立即以冰水浴冷卻，加入5ml冰醋酸，搖勻，IOmin后測(cè)定，其測(cè)定波長(zhǎng)λ =590nm，以隨行樹(shù)脂柱為空白，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出總皂苷含量。三倍體無(wú)籽羅漢果中平均總甜苷含量為3. 69%，二倍體商品果中平均總甜苷含量為2. 01%，甜苷含量提高83. 6%。實(shí)施例2
I、取田間表型好的羅漢果鮮果，在超凈臺(tái)中進(jìn)行整果消毒先用75%こ醇消毒8分鐘，再用20%次氯酸鈉消毒20分鐘，最后無(wú)菌水沖洗5次。2、消毒完畢的整果在超凈臺(tái)中破殼，取出羅漢果種籽，于培養(yǎng)皿中剝出種仁，并將種仁放置于MS培養(yǎng)基中光照培養(yǎng),誘導(dǎo)出芽。3、待芽長(zhǎng)至20天，切取3片嫩葉提取DNA，RFLP分析進(jìn)行雌雄株鑒定。鑒定為雌株的株系切取嫩芽莖尖，O. 2%秋水仙素誘導(dǎo)52小時(shí)，誘導(dǎo)后于MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。4、切取秋水仙素誘導(dǎo)40天左右的嫩芽葉片2片，進(jìn)行細(xì)胞流式分析并且重復(fù)3次以上均鑒定為四倍體的株系繼續(xù)培養(yǎng)。5、將獲得的四倍體雌株與商品性質(zhì)優(yōu)良的二倍體雄株雜交，秋季收獲果實(shí)并將果實(shí)內(nèi)種籽播種于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，60天時(shí)，采集幼葉進(jìn)行流式細(xì)胞儀和RFLP分析。6、流式細(xì)胞儀和RFLP分析為三倍體雌株的脫毒苗于次年春天種植后，與商品性質(zhì)優(yōu)良的二倍體雄株雜交，掛果后即得到三倍體高甜苷無(wú)籽羅漢果。7、羅漢果中總甜苷含量測(cè)定精密吸取樣品液150μ 1，置容量瓶中，揮干溶劑，カロ入5%香草醛-冰醋酸溶液O. 2ml，高氯酸O. 8ml，60°C水浴加熱15min，立即以冰水浴冷卻，加入5ml冰醋酸，搖勻，IOmin后測(cè)定，其測(cè)定波長(zhǎng)λ =590nm，以隨行樹(shù)脂柱為空白，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出總甜苷含量。三倍體無(wú)籽羅漢果中平均總甜苷含量為3. 63%，二倍體商品果中平均總甜苷含量為I. 92%，甜苷含量提高89. 1%。
權(quán)利要求
1.ー種三倍體羅漢果的培養(yǎng)方法，其步驟依次如下 a)取羅漢果鮮果進(jìn)行整果消毒，將其幼胚誘導(dǎo)出芽并制成脫毒苗； b)RFLP分析鑒定出脫毒苗的雌株，對(duì)其進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)及細(xì)胞流式分析； c)將獲得的穩(wěn)定四倍體雌株與二倍體雄株雜交，獲得果實(shí)； d)將果實(shí)內(nèi)的雜交種籽繁殖成植株，流式細(xì)胞儀和RFLP分析為三倍體雌株的脫毒苗種植后，與二倍體雄株雜交，掛果后即得到三倍體高甜苷無(wú)籽羅漢果。
2.權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)方法，其特征在干步驟a)中，整果的消毒先用75%こ醇消毒5-8分鐘，再用20%次氯酸鈉消毒15-20分鐘，最后無(wú)菌水沖洗3-5次。
3.權(quán)利要求I或2中所述的培養(yǎng)方法，其特征在干步驟a)中，消毒完畢的整果在超凈臺(tái)中破殼，取出羅漢果種籽，于培養(yǎng)皿中剝出種仁，并將種仁放置于MS培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)出芽。
4.權(quán)利要求I或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在干步驟b)中，多倍體的誘導(dǎo)是將雌株的株系切取嫩芽莖尖，用O. 2%秋水仙素誘導(dǎo)48-52小時(shí)，誘導(dǎo)后于MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。
5.權(quán)利要求I或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟c)中，穩(wěn)定四倍體是通過(guò)切取秋水仙素誘導(dǎo)30-40天左右的嫩芽葉片1-2片，進(jìn)行細(xì)胞流式分析鑒定獲得。
6.權(quán)利要求I或2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟d)中，種籽播種于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)后，45-60天左右，采集幼葉進(jìn)行流式細(xì)胞儀和RFLP分析。
7.ー種無(wú)籽羅漢果，由權(quán)利要求1-5任一所述的方法培育而成。
8.一種無(wú)籽羅漢果的組織器官，由權(quán)利要求1-5任一所述的方法培育而成。
9.一種無(wú)籽羅漢果的細(xì)胞，由權(quán)利要求1-5任一所述的方法培育而成。
全文摘要
本發(fā)明將公開(kāi)一種甜苷含量和整果利用率高的三倍體羅漢果的培育方法，其步驟如下1)取田間表型好的羅漢果鮮果，整果消毒，將其幼胚誘導(dǎo)出芽并制成脫毒苗；2)脫毒苗RFLP分析鑒定出的雌株進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)及細(xì)胞流式分析；3)將獲得的穩(wěn)定四倍體雌株與商品性質(zhì)優(yōu)良的二倍體雄株雜交；4)秋季收獲果實(shí)并將果實(shí)內(nèi)種籽播種于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，流式細(xì)胞儀和RFLP分析為三倍體雌株的脫毒苗種植后，與商品性質(zhì)優(yōu)良的二倍體雄株雜交，掛果后即得到三倍體高甜苷無(wú)籽羅漢果。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102812902SQ20111037522
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者劉敬梅, 夏勉, 游覽, 謝瑩 申請(qǐng)人:未名興旺系統(tǒng)作物設(shè)計(jì)前沿實(shí)驗(yàn)室(北京)有限公司