專利名稱：一種基于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦雜交棉花的化學殺雄制種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種基于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦雜交棉花的新型化學殺雄制種方法，具體涉及到雜交棉親本、化學殺雄劑、化學殺雄劑處理的濃度、化學殺雄時間和方法、棉花化學殺雄制種技術(shù)等方法。
背景技術(shù)：
棉花是我國最重要的經(jīng)濟作物，是出口創(chuàng)匯的主要農(nóng)作物之一。隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，高科技、高產(chǎn)出、高效益的新型農(nóng)業(yè)勢必將取代傳統(tǒng)的種植業(yè)。如何提高進一步提高我國的棉花產(chǎn)量和品質(zhì)，增加植棉的經(jīng)濟效益是棉花科技界最緊迫的任務(wù)。雜種優(yōu)勢利用是提高棉花單位面積產(chǎn)量、改善原棉品質(zhì)的最有效途徑之一，也是控制棉花種子質(zhì)，實現(xiàn)種子產(chǎn)業(yè)化的主要途徑。近年來，我國的雜交棉生產(chǎn)獲得了飛躍的發(fā)展，雜交棉種植面積逐年增加。然而，目前我國棉花雜交種子的制種手段還較落后，主要采用的是人工去雄授粉法制種。很明顯，這種原始的高成本的制種手段與現(xiàn)代的雜種優(yōu)勢利用是十分不相稱的，而這種不相稱性在勞力緊缺的地區(qū)更顯突出，并直接制約著雜交棉生產(chǎn)的進一步發(fā)展。因此，提高雜交棉的制種效率，降低雜交棉制種成本已成為棉花雜種優(yōu)勢利用的關(guān)鍵問題。利用細胞質(zhì)雄性育系配制“三系”雜交棉是棉花雜種優(yōu)勢利用的有效途徑。 Meyer (1975)、Thomber 等(1979)、賈占昌(1979)、周世象(1992)和 Stewart (1992)分別從哈克尼西棉(G. harknessii)、陸地棉(G. hirsutum)、海島棉(G. barbadense)和三裂棉 (G. trilobum)中得到棉花細胞質(zhì)雄性不育系，并將其細胞質(zhì)不育基因通過核置換法轉(zhuǎn)育到陸地棉。該細胞質(zhì)雄性不育系的保持系非常普遍，一般陸地棉品種(系)均是其保持系，但能恢復該不育基因的恢復基因資源極少，只有在哈克尼西棉等少數(shù)棉種中發(fā)現(xiàn)有恢復基因。 通過棉花遺傳育種家的努力，已將哈克尼西棉的恢復基因轉(zhuǎn)育到陸地棉品種，實現(xiàn)了“三系”配套。遺憾的是，由于不育基因和恢復均來源于哈克尼西野生棉種，均存在著難于克服的不利性狀的連鎖。此外，恢復基因?qū)Σ挥档挠曰謴土Σ粔驈姡渲瞥傻碾s種F1因花粉生活力偏低而導致大量棉鈴脫落，以及帶有“裂根”及“矮生扭曲頂葉”等不良性狀，因此， 三系雜交棉的優(yōu)勢不明顯而很難在生產(chǎn)上利用?；瘜W殺雄是作物雜種優(yōu)勢利用的有效途徑之一。但由于棉花花期長(2個月)，殺雄劑效果穩(wěn)定性等問題，棉花化學殺雄技術(shù)仍未在生產(chǎn)上應用。轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花品種最早由美國孟山都公司于1997年商業(yè)化。浙江大學農(nóng)學院從抗草甘膦的假單胞桿菌中克隆了抗草甘膦的基因(GenBank: EU169459. 1)。通過花粉管通道技術(shù)，將該基因?qū)朊藁ㄆ贩N-中棉所49，創(chuàng)造了轉(zhuǎn)基因的抗草甘膦棉花種質(zhì)，為培育和推廣具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦棉花品種奠定了基礎(chǔ)。在對轉(zhuǎn)基因抗除草劑種質(zhì)進行除草劑抗性鑒定時發(fā)現(xiàn)，花蕾期噴灑除草劑會造成該轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花材料雄性不育。我們圍繞轉(zhuǎn)基因花蕾期噴施草甘膦導致雄性不育的特點，開展了利用該特性進行雜交棉化學殺雄制種方法的研究，建立一種棉花雜種優(yōu)勢利用的新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對當前棉花雜種優(yōu)勢利用中的問題，提供一種基于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦雜交棉花的化學殺雄制種方法?；谵D(zhuǎn)基因抗草甘膦雜交棉花的化學殺雄制種方法的步驟如下
G壊EPSPS-G6轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系及其衍生品種為母本配制的陸地棉品種間雜交組合，其中儲基因是浙江大學從抗草甘膦的假單胞桿菌中克隆的高抗草甘膦基因，轉(zhuǎn)儲轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系是浙江大學通過花粉管通道技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)，以陸地棉種質(zhì)系為父本；
2)選擇有良好隔離條件、地勢較高、排泄方便，并適合于棉花生長的地塊，父本與母本植株相鄰種植，父本與母本植株種植比例為1 :6 ；
3)采用20mM的草甘膦溶液作為轉(zhuǎn)儲轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花的化學殺雄劑，草甘膦選自“農(nóng)達”或95%草甘膦原藥，市售10%草甘膦水溶液對轉(zhuǎn)基因棉花的生長發(fā)育有顯著的影響，不能用于化學殺雄?！稗r(nóng)達”用水稀釋至化學殺雄濃度，95%草甘膦原藥先用IM NaOH 溶液溶解，再用水稀釋至化學殺雄濃度；
4)選擇無風或微風天氣進行化學殺雄，避免將化學殺雄劑噴到父本上，母本植株見蕾后進行第一次化學殺雄，第一次化學殺雄后每隔15天化學殺雄1次，整個生長期共化學殺雄4次；每次化學殺雄時，將草甘膦溶液均勻地噴到母本的每株棉花，確保母本棉花植株 100%花粉敗育；
5)第一化學殺雄20天后，母本棉花植株100%的花朵和100%的花粉敗育，摘除之前開放的花朵和所結(jié)的棉鈴，田間鑒定母本100%的花朵和100%的花粉敗育時即可進行雜交制種；
6)雜交制種方法是取父本棉花植株上的花粉對母本花朵直接授粉，不需對母本進行剝花去雄；
7)收取母本植株的棉花，軋出種子即為雜交棉種子。本發(fā)明使用方便、安全可靠。與人工去雄制種相比，該方法可節(jié)省雜交棉制種的人工去雄步驟，大幅減輕雜交棉制種的用工50%以上，降低雜交棉種子生產(chǎn)成本50%以上。


圖1是草甘膦處理后的雄蕊示意圖，未處理的雄蕊；B.草甘膦處理后20天的雄蕊不散粉；
圖2 (a)是草甘膦未處理的花粉粒示意圖； 圖2 (b)是草甘膦處理后20天的花粉粒示意圖3是草甘膦處理間隔期為15天對轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花粉育性的影響示意圖； 圖4是草甘膦處理間隔期為25天對轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花粉育性的影響示意圖； 圖5是整個生育期只進行一次草甘膦處理對轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花粉育性的影響示意圖。
具體實施例方式基于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦雜交棉花的化學殺雄制種方法的步驟如下
G壊EPSPS-G6轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系及其衍生品種為母本配制的陸地棉品種間雜交組合，其中儲基因是浙江大學從抗草甘膦的假單胞桿菌中克隆的高抗草甘膦基因，轉(zhuǎn)儲轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系是浙江大學通過花粉管通道技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)，以陸地棉種質(zhì)系為父本；
2)選擇有良好隔離條件、地勢較高、排泄方便，并適合于棉花生長的地塊，父本與母本植株相鄰種植，父本與母本植株種植比例為1 :6 ；
3)采用20mM的草甘膦溶液作為轉(zhuǎn)儲轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花的化學殺雄劑，草甘膦選自“農(nóng)達”或95%草甘膦原藥，市售10%草甘膦水溶液對轉(zhuǎn)基因棉花的生長發(fā)育有顯著的影響，不能用于化學殺雄?！稗r(nóng)達”用水稀釋至化學殺雄濃度，95%草甘膦原藥先用IM NaOH 溶液溶解，再用水稀釋至化學殺雄濃度；
4)選擇無風或微風天氣進行化學殺雄，避免將化學殺雄劑噴到父本上，母本植株見蕾后進行第一次化學殺雄，第一次化學殺雄后每隔15天化學殺雄1次，整個生長期共化學殺雄4次；每次化學殺雄時，將草甘膦溶液均勻地噴到母本的每株棉花，確保母本棉花植株 100%花粉敗育；
5)第一化學殺雄20天后，母本棉花植株100%的花朵和100%的花粉敗育，摘除之前開放的花朵和所結(jié)的棉鈴，田間鑒定母本100%的花朵和100%的花粉敗育時即可進行雜交制種；
6)雜交制種方法是取父本棉花植株上的花粉對母本花朵直接授粉，不需對母本進行剝花去雄；
7)收取母本植株的棉花，軋出種子即為雜交棉種子。 實施例為了驗證本發(fā)明化學殺雄的效果，以及化學殺雄劑對雌配子的影響，在實驗室前期試驗工作的基礎(chǔ)上，我們于2009年對本發(fā)明進行了再次驗證試驗在浙江大學試驗農(nóng)場進行，以本實驗室培育的轉(zhuǎn)EPSPS-G6基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系為母本，以本實驗室常年自交保存的雞腳葉(顯性性狀)棉花為父本，相鄰種植于浙江大學華家池校區(qū)棉花試驗地中， 父母本種植比例1:6，種植前試驗地安裝了防蟲網(wǎng)，隔離條件良好，且排水方便?，F(xiàn)蕾后，我們在2009年7月M日對母本進行了第一次化學殺雄，所用草甘膦溶液為浙江新安化工生產(chǎn)的95%草甘膦原藥粉劑用濃度為IM的NaOH溶解后稀釋至20mM。我們在化學殺雄處理后20-40天內(nèi)，進行花粉育性鑒定，結(jié)果表明，雄蕊不散粉 (圖1)，100%的花粉為不育(圖2);20mM草甘膦溶液化學殺雄后20-40天采用強迫自交和用帶雞腳葉性狀(顯性性狀)棉花作父本對未去雄的母本花朵進行授粉，并統(tǒng)計結(jié)鈴率。結(jié)果表明，自交結(jié)鈴率為0，而雜交結(jié)鈴率達80%以上，證明經(jīng)草甘膦化學殺雄后，雄配子高度不育而雌配子發(fā)育正常。所結(jié)種子(F1)，同年前往海南南繁基地種植。觀察Fl植株的葉型分離結(jié)果表明，所有統(tǒng)計的Fl植株的葉片均為雙親的中間型(半雞腳葉)，說明用草甘膦化學殺雄后，雄配子完全不育。研究結(jié)果表明本發(fā)明的化學殺雄效果和制種效果優(yōu)良。與此同時，我們對不同濃度和不同化學殺雄間隔時間進行了試驗。結(jié)果表明，間隔15天，IOmM以上濃度100%的花粉粒敗育(圖3)，而間隔25天，20mM以下濃度個別時間仍有少量的花粉可育(圖4)，而只進行1次化學殺雄，30mM以下濃度在噴施后40天恢復育性(圖 5)。對不同濃度化學殺雄進行授粉雜交，20mM以及以下濃度的結(jié)鈴率與未處理對照無差異， 而30mM及其以上濃度的草甘膦化學殺雄，其雜交結(jié)鈴率隨濃度增加而顯著降低?？紤]到材料、藥劑、使用濃度，以及氣候因素等可能出現(xiàn)的差異，20mM的草甘膦濃度，間隔15天(可延5天)為本發(fā)明的最佳化學殺雄濃度和化學殺雄間隔時間?；瘜W殺雄劑為草甘膦除草劑，英文名為glyphosate，學名為N-膦?；谆拾彼?，N-膦?；谆被宜幔肿邮綖?H0)2P(0)CH2NHCH2C00H，作為殺雄劑的草甘膦除草劑包括但不限于以下兩種“農(nóng)達”或95%草甘膦原藥。其中“農(nóng)達”根據(jù)商品的濃度直接用水稀釋至化學殺雄濃度，95%草甘膦原藥難溶于水，需用IM NaOH溶液溶解，再用水稀釋至化學殺雄濃度。不用市售的10%草甘膦水溶液；
制種地雙親的種植方式包括但不限于父母本分開種植，母本與父本種植比例為6 :1。第一次化學殺雄時間包括但不限于見蕾期。噴施20天后母本株上開的花雄均為雄性不育。考慮到操作者首次確定噴施時間的差異和棉株間的生育進程的差異，如首次噴施草甘膦后20天內(nèi)母本植株有開放花朵則必須摘除，以確保制種的純度。噴施間隔時間和次數(shù)包括但不限于每15天噴一次，連續(xù)噴4次。殺雄用草甘膦噴施濃度包括但不限于20mM。噴施方法和藥量包括但不限于噴霧法，大多葉片噴濕即可。選擇晴天或微風天氣噴施，避免將草甘膦到父本上，如遇連續(xù)陰雨等特殊天氣可在規(guī)定時間5天內(nèi)，即前次噴后 20天內(nèi)搶晴天噴施，噴施后2小時內(nèi)下雨則需補噴；如前次噴后20天仍未噴藥，應在最后一次有效化學殺雄后40天內(nèi)停止采用該方法制種。如確仍需在該制種地制種，可采用人工去雄方法去雄補救。
權(quán)利要求
1. 一種基于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦雜交棉花的化學殺雄制種方法，其特征它的步驟如下G壊EPSPS-G6轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系及其衍生品種為母本配制的陸地棉品種間雜交組合，其中儲基因是浙江大學從抗草甘膦的假單胞桿菌中克隆的高抗草甘膦基因，轉(zhuǎn)儲轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)系是浙江大學通過花粉管通道技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花種質(zhì)，以陸地棉種質(zhì)系為父本；2)選擇有良好隔離條件、地勢較高、排泄方便，并適合于棉花生長的地塊，父本與母本植株相鄰種植，父本與母本植株種植比例為1 :6 ；3)采用20mM的草甘膦溶液作為轉(zhuǎn)儲轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花的化學殺雄劑，草甘膦選自“農(nóng)達”或95%草甘膦原藥，市售10%草甘膦水溶液對轉(zhuǎn)基因棉花的生長發(fā)育有顯著的影響，不能用于化學殺雄，“農(nóng)達”用水稀釋至化學殺雄濃度，95%草甘膦原藥先用IM NaOH 溶液溶解，再用水稀釋至化學殺雄濃度；4)選擇無風或微風天氣進行化學殺雄，避免將化學殺雄劑噴到父本上，母本植株見蕾后進行第一次化學殺雄，第一次化學殺雄后每隔15天化學殺雄1次，整個生長期共化學殺雄4次；每次化學殺雄時，將草甘膦溶液均勻地噴到母本的每株棉花，確保母本棉花植株 100%花粉敗育；5)第一化學殺雄20天后，母本棉花植株100%的花朵和100%的花粉敗育，摘除之前開放的花朵和所結(jié)的棉鈴，田間鑒定母本100%的花朵和100%的花粉敗育時即可進行雜交制種；6)雜交制種方法是取父本棉花植株上的花粉對母本花朵直接授粉，不需對母本進行剝花去雄；7)收取母本植株的棉花，軋出種子即為雜交棉種子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦雜交棉花的新型化學殺雄制種方法。本方法適合于以轉(zhuǎn)EPSPS-G6基因的轉(zhuǎn)基因抗甘膦除草劑陸地棉種質(zhì)系為母本，另一陸地棉品種或種質(zhì)系為父本配制的雜交棉組合。選擇隔離條件良好的適合于棉花生長的制種地，將制種的雜交雙親在相鄰地塊種植(父母本種植比例1:6)。母本植株見蕾后用20mM的草甘膦溶液對母本棉花植株進行第一次化學殺雄，之后每隔15天化學殺雄1次，整個生長期共化學殺雄4次。第一次化學殺雄20天后，母本棉花植株開出的花朵均為不育，表現(xiàn)為雄蕊不散粉、散粉推遲和花粉不正常，鏡檢花粉粒100%不育時，可開始進行雜交制種。本發(fā)明化學殺雄效果穩(wěn)定，持續(xù)時間長，安全可靠。
文檔編號A01H1/02GK102511374SQ201110359138
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者何秋伶, 劉天雄, 葉春燕, 梅磊, 祝水金, 陳進紅 申請人:浙江大學