專利名稱：一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法。
背景技術(shù)：
就目前的各種研究結(jié)果而言，對(duì)魚類洄游路線的研究較常用的方法主要有是標(biāo)志放流法。一般是利用特制的標(biāo)牌或標(biāo)簽結(jié)附在人工培育的幼魚或捕獲的魚體上，放流到自然水域中。當(dāng)標(biāo)志魚重捕時(shí)，將放流和重捕時(shí)的各項(xiàng)資料加以對(duì)比，以分析魚類洄游的變動(dòng)規(guī)律。其方法主要有以下幾種1.切斷標(biāo)志法切斷部分鰭條；2.外部標(biāo)志法將標(biāo)牌或標(biāo)簽掛夾在尾柄、背鰭或鰓蓋上；3.內(nèi)部標(biāo)志法將可探測(cè)芯片植入魚體內(nèi)部，用電磁設(shè)備進(jìn)行檢驗(yàn)；4.同位素標(biāo)志法用同位素進(jìn)行標(biāo)志，重捕時(shí)用示蹤原子探測(cè)器檢出標(biāo)志魚；5.藥品浸泡法用一定有效比例的四環(huán)素或者茜素絡(luò)合物對(duì)標(biāo)志魚進(jìn)行一定時(shí)間的浸泡或食物喂養(yǎng)，待重捕后挑出其耳石在熒光顯微鏡下觀察有無熒光環(huán)。雖然這些方法均可以檢測(cè)出魚類的洄游路線，但是必須實(shí)現(xiàn)捕到標(biāo)本，標(biāo)志后放流才能得以實(shí)現(xiàn)，并且放流后的標(biāo)本的成活率不能保證，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長，回捕率較低，這些均對(duì)研究魚類洄游路線造成不便，更不能對(duì)不同種群類型的魚類的洄游路線進(jìn)行區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法， 該方法操作簡單，快速，而且準(zhǔn)確率較高。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法，包括如下步驟
1)在某一洄游魚類各生境設(shè)采樣點(diǎn)，采集樣本；
2)提取樣本基因組DNA，利用COI基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序， 將測(cè)得的正反向序列進(jìn)行比對(duì)后，通過軟件進(jìn)行聚類和單倍型分析，確定每個(gè)樣本的單倍型類型；
3)把每個(gè)樣本的單倍體型標(biāo)示在采樣點(diǎn)上，根據(jù)不同采樣點(diǎn)所含有的種群類型，確定該洄游魚類的種群分布和洄游路線。優(yōu)選的，步驟2)所述CO I基因通用引物序列如下
CO I F，:5，-TTCTCCACCAACCACA ARGAYATYGG-3，(SEQ ID NO 1)； CO I R，5，-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3‘ (SEQ ID NO :2)。優(yōu)選的，步驟2)的具體操作為
(1)采用酚-氯仿法提取樣本基因組DNA；
(2)利用COI基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為50μ1，含有5μ1 buffer(200mM Tris-HCl,pH8. 4 ；200mM KCl ； 100mM(NH4)2S04 ； 15Mm MgC12)，4ul dNTP Mixture (2. 5mM), 0.6μ1引物(上游引物0. 3 μ ，下游引物0.3 μ )，4μ1模板DNA，0. 5μ1 Taq酶，其余用無菌水補(bǔ)足；PCR反應(yīng)的條件94°C預(yù)變性:3min，40個(gè)循環(huán)(94°C變性30s，51.4°C退火45s，72°C延伸 lmin)，最后 72°C延伸 7min ；
(3)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；
(4)將測(cè)得的正反向序列進(jìn)行比對(duì)后，通過軟件進(jìn)行聚類和單倍型分析，確定每個(gè)樣本的單倍型類型。優(yōu)選的，所述洄游魚類為廣東魴。本發(fā)明的有益效果在于
與標(biāo)志放流法的幾種方法相比，本方法不僅能夠準(zhǔn)確快速的監(jiān)測(cè)魚類的洄游路線，并且能夠區(qū)分同種魚類的不同種群類型的洄游路線，其實(shí)驗(yàn)方法簡單快速，具有準(zhǔn)確性。根據(jù)不同采樣點(diǎn)的單倍型種類和同種單倍型在不同采樣點(diǎn)的分布，可以尋找出不同單倍型種群類型的分布范圍，和根據(jù)水域的范圍及流向確定不同單倍型種群類型的洄游路線，對(duì)研究河網(wǎng)中同種魚類不同種群類型的活動(dòng)范圍及走向具有重要意義。


圖1 每個(gè)采樣點(diǎn)特有的廣東魴單倍型類型；
圖2 每個(gè)采樣點(diǎn)共有的單倍型類型的活動(dòng)范圍或洄游路線圖； 圖3 廣東魴H10、H11、H19、H20單倍型類型的活動(dòng)范圍或洄游路線圖； 圖4 :「*·Η3、Η5、Η8、Η14、Η17、Η21單倍型類型的活動(dòng)范圍或洄游路線圖。
具體實(shí)施例方式下面以廣東魴為例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解范圍內(nèi)，該方法還可用于快速確定其他洄游魚類的種群分布和洄游路線。廣Mm (Megalobrania terffli/K^is)屬于鯉科，舶亞科，魴屬。廣東魴屬于江河距離洄游、有固定產(chǎn)卵場(chǎng)、聚群產(chǎn)卵的魚類，僅分布于廣東、廣西和海南省。珠江歷史調(diào)查，廣東魴產(chǎn)卵場(chǎng)分布于西江廣東段青皮塘和羅旁，以及珠江一級(jí)支流北江和賀江。西江廣東魴的生活范圍從錢江沿珠江至珠江口均有分布，廣東魴體型中等，是珠江水系重要的經(jīng)濟(jì)魚類。至上世紀(jì)八十年代，由于梯級(jí)開發(fā)，北江和賀江的產(chǎn)卵場(chǎng)功能逐漸消失，廣東魴的生存面臨威脅。目前廣東魴產(chǎn)卵場(chǎng)保存廣東段青皮塘和羅旁二地，相距約30公里。近年監(jiān)測(cè)表明，廣東魴在二個(gè)產(chǎn)卵場(chǎng)的產(chǎn)卵期不一致，產(chǎn)卵親魚個(gè)體也存在差異，早期補(bǔ)充資源在不斷下降。因此，了解野生廣東魴種群的遺傳多樣性，了解廣東魴不同群體在水域中的分布及洄游路線，對(duì)廣東魴的資源管理和保護(hù)具有重要意義。1、樣本采集
在西江(梧州、青皮塘、羅旁、肇慶)、東江、北江、東四口門(洪奇浙門、橫門)、西四口門 (磨刀門、崖門)等各個(gè)廣東魴分布水域采集樣本，每個(gè)采集點(diǎn)采集樣本分別為104 (14、33、 40、17)、68、24、55、27尾，共278尾樣本，分別做標(biāo)記。2、樣本單倍型類型分析
(1)樣品DNA的提取與分離基因組DNA提取采用傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取。將鰭條組織晾干，剪碎后加入460μ1 ΞΤΕ,δΟμΙ的10% SDS和10μ1 10mg/ml的蛋白酶K，充分混勻； 550C水浴消化2-3小時(shí)；加入水飽和酚600μ1，輕輕搖動(dòng)混勻lOmin，12000rmp離心IOmin ； 取上清液置于新的離心管中，加入酚氯仿異戊醇25:24:1 600μ1，抽提lOmin，12000rmp離心IOmin ；取上清液置于新的離心管中，加入氯仿異戊醇500μ1，輕輕搖晃混勻 5min, 12000rmp離心IOmin ；取上清液置于新的離心管中，加入冰無水乙醇，一 20°C保存 IOmin, 12000rmp離心lOmin，倒出無水乙醇；然后用70%的乙醇漂洗1次，倒出乙醇，室溫晾干，加入ΙΟΟμΙ的ddH20，通過瓊脂糖凝膠(含0. 5ug/mL的溴化乙錠)電泳來鑒定，一
20 0C保存?zhèn)溆谩?2) PCR擴(kuò)增引物為CO I通用引物，引物序列為，
CO I F，:5，-TTCTCCACCAACCACA ARGAYATYGG-3，(SEQ ID NO 1)； CO I R，5，-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3‘ (SEQ ID NO :2)。(3) PCR擴(kuò)增對(duì)反應(yīng)體系優(yōu)化后進(jìn)行PCR反應(yīng)。其反應(yīng)體系為50μ1 有5μ1 buffer (200mM Tris-HCl, pH8. 4 ；200mM KCl ； IOOmM (NH4) 2S04 ； 15mM MgCl2), 4ul dNTP Mixture (2. 5mM)，0. 6μ1 引物(上游引物 0. 3 μ ，下游引物 0.3 μ )，4μ1 模板 DNA，0. 5μ1 Taq酶，其余用無菌水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)的條件94°C預(yù)變性!Min，40個(gè)循環(huán)(94°C變性30s， 51.4°C退火45s，72°C延伸lmin)，最后72°C延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存，以待電泳。(4) PCR產(chǎn)物的檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物取4μ1在1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳(含0. 5g/mL溴化乙錠)上進(jìn)行電泳，以220V穩(wěn)定電壓電泳25min左右。電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并保存。(5)將剩余的擴(kuò)增產(chǎn)物送至測(cè)序公司測(cè)序。(6)將測(cè)得的正反向序列進(jìn)行比對(duì)后，用軟件MEGE4. 0和DNAsp進(jìn)行聚類和單倍型類型分析，確定每個(gè)樣本的單倍型數(shù)量和類型。具體步驟為MEGE4. 0中的cluster W比對(duì)后，存為*. meg文件，根據(jù)多重比對(duì)的結(jié)果，利NJ法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，節(jié)點(diǎn)的數(shù)值是Bootstrap 1000次抽樣檢驗(yàn)的結(jié)果。DNAsp軟件打開meg文件，進(jìn)行單倍型分析。綜合聚類分析結(jié)果和單倍型分析結(jié)果，確定所有廣東魴的樣本中，共有M種單倍型，如表1所
7J\ ο3、廣東魴種群分布和洄游路線的確定
將2分析得到的各個(gè)樣本的單倍型標(biāo)示在各個(gè)采樣點(diǎn)上，根據(jù)不同采樣點(diǎn)所含有的種群類型確定廣東魴不同種群的分別位點(diǎn)和洄游路線。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，珠江水系中下游的各個(gè)江段所采集廣東魴的樣本278尾，共有M個(gè)單倍型(ΗΓΗΜ)，每種單倍型的分布位點(diǎn)見表1。每個(gè)采集點(diǎn)所分布的單倍型數(shù)目見表2、圖 2。由表1、表2可見，所有的M種單倍型中，Η4、Η24是在研究水域所有地點(diǎn)均能采集到， Η19是除了東江外其他采樣點(diǎn)也均能采集到，而HI、Η22、Η23為東四口門特有，H2、H12、H15 為羅旁特有，H6、H18為青皮塘所特有，H7為東江所特有，H13為梧州所特有，H16為北江所特有。
權(quán)利要求
1.一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法，包括如下步驟1)在某一洄游魚類各生境設(shè)采樣點(diǎn)，采集樣本；2)提取樣本基因組DNA，利用COI基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序， 將測(cè)得的正反向序列進(jìn)行比對(duì)后，通過軟件進(jìn)行聚類和單倍型分析，確定每個(gè)樣本的單倍型類型；3)把每個(gè)樣本的單倍體型標(biāo)示在采樣點(diǎn)上，根據(jù)不同采樣點(diǎn)所含有的種群類型，確定該洄游魚類的種群分布和洄游路線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速確定魚類種群分布和洄游路線的方法，其特征在于， 步驟2)所述CO I基因通用引物序列如下CO I F，:5，-TTCTCCACCAACCACA ARGAYATYGG-3，(SEQ ID NO 1)；CO I R，5，-CACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA-3‘ (SEQ ID NO :2)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速確定洄游魚類種群分布和洄游路線的方法，其特征在于，步驟2)的具體操作為(1)采用酚-氯仿法提取樣本基因組DNA；(2)利用COI基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為50μ1，含有5μ1 buffer(200mM Tris-HCl,pH8. 4 ；200mM KCl ； 100mM(NH4)2S04 ； 15Mm MgC12)，4ul dNTP Mixture (2. 5mM), 0.6μ1引物(上游引物0. 3 μ ，下游引物0.3 μ )，4μ1模板DNA，0. 5μ1 Taq酶，其余用無菌水補(bǔ)足；PCR反應(yīng)的條件94°C預(yù)變性:3min，40個(gè)循環(huán)(94°C變性30s，51.4°C退火45s， 72°C延伸 lmin)，最后 72°C延伸 7min ；(3)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；(4)將測(cè)得的正反向序列進(jìn)行比對(duì)后，通過軟件進(jìn)行聚類和單倍型分析，確定每個(gè)樣本的單倍型類型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法，其特征在于，所述洄游魚類為廣東魴。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速確定洄游魚類種群分布及洄游路線的方法，該方法基于COⅠ基因的聚類分析技術(shù)，具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01K61/00GK102499157SQ20111035010
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者吳茜, 李捷, 李新輝, 李躍飛, 楊計(jì)平, 王超, 譚細(xì)暢, 賴子尼 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所