專(zhuān)利名稱(chēng)：菊黃東方鲀與紅鰭東方魨三倍體的誘導(dǎo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚(yú)類(lèi)的制種方法，特別是涉及一種菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體的生產(chǎn)方法，該技術(shù)屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
菊黃東方飩俗稱(chēng)艇巴、滿天星等，主要分布于中國(guó)黃海、東海和渤海。而紅鰭東方飩主要分布于北太平洋西部的日本、朝鮮半島和中國(guó)沿海。紅鰭東方飩是個(gè)體最大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的品種之一。因其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、蛋白質(zhì)高、營(yíng)養(yǎng)豐富，素有“魚(yú)類(lèi)之王”的美譽(yù)，深受廣大美食家的喜愛(ài)。
紅鰭東方飩生長(zhǎng)快，但是毒性大，國(guó)內(nèi)不允許食用；菊黃東方飩生長(zhǎng)慢，在江蘇、上海地區(qū)有食用習(xí)慣，商品價(jià)值高，市場(chǎng)也很大。因此，想利用前者的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，通過(guò)雜交，獲得與菊黃飩形態(tài)特征相似，但是生長(zhǎng)快的雜交飩，以提高商品價(jià)值。從國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)動(dòng)物研究的趨勢(shì)來(lái)看，三倍體技術(shù)是具有潛力的一種方法。三倍體水產(chǎn)動(dòng)物由于具有不育性的特點(diǎn)，即性腺不能發(fā)育成熟或發(fā)育畸形，而不能繁殖后代，因此沒(méi)有性成熟或繁殖方面的能量損耗，避免了繁殖階段的生長(zhǎng)停止或高死亡率。目前，三倍體水產(chǎn)動(dòng)物在控制過(guò)度繁殖、加快生長(zhǎng)速度等方面都顯示了良好的效果。因此根據(jù)菊黃東方飩的特性，開(kāi)發(fā)一種誘導(dǎo)方法，獲得菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體，以提高菊黃東方飩的生長(zhǎng)速度，提高其經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益是養(yǎng)殖業(yè)者的共同期盼。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體的誘導(dǎo)方法。本發(fā)明的步驟為I)選取性腺成熟的紅鰭東方飩雄魚(yú)和雌魚(yú)、菊黃東方飩的雄魚(yú)和雌魚(yú)，分別采集精液和成熟卵子；進(jìn)行正反雜交；2)將精液與卵粒均勻混合，室溫靜置2min，加入海水進(jìn)行人工受精；3)三倍體獲得將受精后3-7min的受精卵轉(zhuǎn)移至30_40°C海水浴中進(jìn)行熱休克5-20min,抑制第二極體的形成及其排出，使染色體組加倍。4)解除休克將卵移至常溫海水中孵化，按照普通菊黃東方飩苗種生產(chǎn)方法管理，培育菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體魚(yú)苗。在步驟2)中，海水水溫為15_20°C。在步驟3)中，海水中起始熱休克的時(shí)間為受精后3_7min ;熱休克持續(xù)時(shí)間為10_16min ；熱休克溫度為30_36°C。在步驟4)中，海水孵化的溫度為15_20°C。更優(yōu)選地，
步驟3)中，海水中起始熱休克的時(shí)間為受精后4-6min ;熱休克持續(xù)時(shí)間為14_16min，熱休克溫度為34_35°C ;步驟4)中，海水孵化的溫度為17°C。采用上述方法誘導(dǎo)，能夠得到較高的誘導(dǎo)率。本發(fā)明的進(jìn)一步方案為誘導(dǎo)得到菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體后，利用染色體核型分析、流式細(xì)胞儀等技術(shù)測(cè)定上述魚(yú)體的染色體倍數(shù)，然后進(jìn)行菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體培育。
本發(fā)明的有益效果在于I.本發(fā)明通過(guò)利用高溫休克方法進(jìn)行誘導(dǎo)，并通過(guò)控制誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間，抑制第二極體釋放，從而大大提高菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體的誘導(dǎo)率，據(jù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，所獲得的菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體的人工兩導(dǎo)率高達(dá)100%。2.本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，可操作性強(qiáng)，避免了化學(xué)方法進(jìn)行誘導(dǎo)帶來(lái)的污染。3.采用本發(fā)明所述方法培育的菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體，具有生長(zhǎng)速度快、個(gè)體規(guī)格大、養(yǎng)殖成活率高，抗病能力強(qiáng)、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。在菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體誘導(dǎo)中，其中最優(yōu)選的誘導(dǎo)條件為，選取性腺成熟的紅鰭東方飩雄魚(yú)和雌魚(yú)、菊黃東方飩的雄魚(yú)和雌魚(yú)，分別采集精液和成熟卵子；進(jìn)行正反雜交；受精后5min用35°C的海水浴熱休克處理15min，抑制第二極體排出，然后在17°C的海水中孵化，完成熱休克法的三倍體誘導(dǎo)。采用該條件進(jìn)行菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，孵化率=6. 69%，三倍體率達(dá)100%，相對(duì)三倍體數(shù)為35. 42%。


圖I菊黃東方飩二倍體魚(yú)苗細(xì)胞DNA熒光分布直方圖。圖2紅鰭東方飩二倍體魚(yú)苗細(xì)胞DNA熒光分布直方圖。圖3菊黃東方飩母本X紅鰭東方飩父本三倍體魚(yú)苗細(xì)胞DNA熒光分布直方圖。圖4菊黃東方飩父本X紅鰭東方飩母本三倍體魚(yú)苗細(xì)胞DNA熒光分布直方圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)例I菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體的倍性鑒定采用德國(guó)Partec公司Cystain DNA Istep染液一步法染色,通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞DNA含量來(lái)鑒定倍性。I、組織細(xì)胞懸液制備及測(cè)定采用隨機(jī)抽取方式對(duì)5-8日齡10尾菊黃東方飩母本X紅鰭東方飩父本三倍體和10尾菊黃東方飩父本X紅鰭東方飩母本三倍體進(jìn)行鑒定，每次以10尾菊黃東方飩二倍體和10尾紅鰭東方飩二倍體作為對(duì)照。
(I)組織細(xì)胞提取及DNA熒光染色取每一尾魚(yú)的活體尾鰭約1mm3，放入I. 5mL微量離心管中，加入Cystain DNA Istep染液O. 5ml,剪碎尾鰭組織至肉眼看不見(jiàn)塊狀物,再輕輕研至均衆(zhòng)狀；用300目德國(guó)Partec公司生產(chǎn)的細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾,再向?yàn)V液中加入CystainDNA Istep染液O. 5ml,進(jìn)一步染色。(2)流式細(xì)胞儀測(cè)定PARTEC為德國(guó)Partec Gmbh公司生產(chǎn)，型號(hào)PA，該機(jī)激發(fā)光源為負(fù)離子激光器。測(cè)量前，用鞘液調(diào)整細(xì)胞濃度在I X 106個(gè)/ml左右，測(cè)量時(shí)保持測(cè)量速率在200 300個(gè)/S。選正常二倍體細(xì)胞懸液為對(duì)照樣品。(3)檢測(cè)控制測(cè)定前調(diào)校流式細(xì)胞儀使管道暢通，噴嘴清潔，儀器處于最佳狀態(tài)，進(jìn)行FL0WCHECK校正，使各通道的變異系數(shù)(CV)穩(wěn)定在3%以下，DNA含量由儀器自動(dòng)檢出。通過(guò)控制流速保持細(xì)胞分離純度。2、檢測(cè)原理與表示方法以二倍體對(duì)照組細(xì)胞為參考計(jì)算二倍體和三倍體頻率，細(xì)胞DNA含量以DNA指數(shù)(DNAindex, DI)表不。DI =處理組細(xì)胞G0/1峰值道數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞G0/1峰值道數(shù)均值以DI = I. 0±0. I為DNA 二倍體的判斷標(biāo)準(zhǔn)。如果DI = I. 5±0. 1，則為三倍體。對(duì)三倍體處理組與二倍體對(duì)照組的DNA進(jìn)行分析(表I)，結(jié)果表明二者細(xì)胞DNA的G0/1峰值道數(shù)差異顯著。流式細(xì)胞儀給出的對(duì)照組與三倍體處理組細(xì)胞DNA含量熒光分布直方圖見(jiàn)圖I-圖 4。表I三倍體處理組與二倍體對(duì)照組的DNA比較(均值)
權(quán)利要求
1.一種高溫休克誘導(dǎo)菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體的方法，其特征在于包括如下步驟 1)選取性腺成熟的紅鰭東方飩雄魚(yú)和雌魚(yú)、菊黃東方飩的雄魚(yú)和雌魚(yú)，分別采集精液和成熟卵子；進(jìn)行正反雜交 2)將精液與卵粒均勻混合，攪拌后室溫靜置2min，加入海水進(jìn)行人工受精； 3)三倍體獲得將受精后3-7min的受精卵轉(zhuǎn)移至30_40°C海水浴中進(jìn)行熱休克處理5-20min,使染色體組加倍。
4)解除熱休克將卵移至海水中孵化，按照普通菊黃東方飩苗種生產(chǎn)方法管理，培育菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體魚(yú)苗。
2.如權(quán)利要求I所述的菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體誘導(dǎo)方法，其特征在于 步驟2)中，海水水溫為15-20°C。
3.如權(quán)利要求I所述的菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體誘導(dǎo)方法，其特征在于 步驟3)中，海水中起始熱休克的時(shí)間為受精后3-7min ;熱休克持續(xù)時(shí)間為10_16min ； 熱休克溫度為30-36 °C。
4.如權(quán)利要求I所述的菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體誘導(dǎo)方法，其特征在于 步驟4)中，海水孵化的溫度為15-20°C。
5.如權(quán)利要求I所述的菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體誘導(dǎo)方法，其特征在于 海水中起始熱休克的時(shí)間為受精后4-6min ;熱休克持續(xù)時(shí)間為14_16min，熱休克 溫度為34-35°C。
6.如權(quán)利要求I所述的菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體誘導(dǎo)方法，其特征在于 步驟4)中，海水孵化的溫度為17°C。
7.如權(quán)利要求I所述的菊黃東方飩與紅鰭東方飩雜交三倍體誘導(dǎo)方法，其特征在于 選取性腺成熟的紅鰭東方飩雄魚(yú)和雌魚(yú)、菊黃東方飩的雄魚(yú)和雌魚(yú)，分別采集成熟卵和精液，人工受精，進(jìn)行正反雜交，受精后5min用35°C的海水浴熱休克處理15min，抑制第二極體排出，然后在17°C的海水中孵化，完成熱休克法的三倍體誘導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明是一種菊黃東方鲀與紅鰭東方魨雜交三倍體的誘導(dǎo)方法，其主要步驟為選取發(fā)育成熟的紅鰭東方鲀雄魚(yú)和雌魚(yú)、菊黃東方鲀的雄魚(yú)和雌魚(yú)，分別采集成熟卵和精液，人工受精，進(jìn)行正反雜交；受精后3-7min用30-40℃的海水熱休克處理5-20min，然后在15-20℃的海水中孵化，完成熱休克法的三倍體誘導(dǎo)。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，可操作性強(qiáng)，并且大大提高菊黃東方鲀與紅鰭東方魨雜交三倍體的誘導(dǎo)率，據(jù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，所獲得的菊黃東方鲀與紅鰭東方魨雜交三倍體的人工誘導(dǎo)率高達(dá)100％，獲得的三倍體具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)A01K61/00GK102823522SQ201110163898
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者張福崇, 劉海金, 趙振良, 趙文江, 范文濤, 趙海濤, 劉永新 申請(qǐng)人:河北省水產(chǎn)研究所, 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站