專利名稱：控制大豆胞囊線蟲(chóng)的生物種衣劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種控制大豆胞囊線蟲(chóng)的生物種衣劑。
背景技術(shù)：
大豆胞囊線蟲(chóng)病(Soybean Cyst Nematode)，又稱大豆黃萎病、火龍秧子，是制約世界大豆生產(chǎn)的首要病害之一。該病害一般使大豆減產(chǎn)10 % 30 %，嚴(yán)重地塊可達(dá)70 % 90%，甚至造成絕產(chǎn)，比任何一種單一病害所造成的危害都大。該病在大豆主產(chǎn)區(qū)擴(kuò)展迅速，已成為主要病害之一，從世界范圍來(lái)看，大豆胞囊線蟲(chóng)病的危害和蔓延有日益加重的趨勢(shì)。近年來(lái)隨著我國(guó)大豆栽培面積的不斷擴(kuò)大，大豆胞囊線蟲(chóng)(Heterodera glycines)的分布也越來(lái)越廣，主要發(fā)生在東北和黃淮海等共14個(gè)省市自治區(qū)，是造成大豆低產(chǎn)田的主要原因之一。控制大豆胞囊線蟲(chóng)病害目前沒(méi)有特別有效的方法，國(guó)內(nèi)常用的種衣劑中因含有克百威(呋喃丹)等有效的殺蟲(chóng)成分對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)有一定的防治效果，但隨著呋喃丹的禁用，尋找新的替代品成為必然。尤其是近20年來(lái)，隨著可持續(xù)農(nóng)業(yè)和有機(jī)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，人們已將防治線蟲(chóng)病害的工作重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了生物防治。在微生物農(nóng)藥迅速發(fā)展的過(guò)程中，國(guó)際上一些新型生物技術(shù)公司，如Mycogen公司、Ecogen公司等應(yīng)運(yùn)而生。一些全球性大型化學(xué)農(nóng)藥公司和生物技術(shù)公司，如美國(guó)的杜邦公司和孟山都公司、德國(guó)的拜耳公司、瑞士的先正達(dá)公司、日本的住友公司等也紛紛投巨資發(fā)展微生物農(nóng)藥。在目前發(fā)現(xiàn)的近萬(wàn)種抗生素當(dāng)中，約有70%是由放線菌產(chǎn)生的各種次生代謝產(chǎn)物。農(nóng)用抗生素作為生物農(nóng)藥中的重要類群，較其它生物農(nóng)藥具有更高效、快速、安全等優(yōu)點(diǎn)。放線菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物具有豐富的結(jié)構(gòu)多樣性，因此放線菌作為線蟲(chóng)的生防因子展現(xiàn)出巨大的潛力。另外，PGI^R制劑是近年來(lái)在根瘤菌肥和復(fù)合生物肥的單一肥效研究基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)研制的集促生、抗病生防為一體的新型活體接種劑。研究發(fā)現(xiàn)，PGI^R在植物根圍的聚集，它們旺盛的代謝作用加強(qiáng)了土壤中有機(jī)物質(zhì)的分解，促進(jìn)了植物營(yíng)養(yǎng)元素的礦化， 增強(qiáng)了對(duì)作物營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)。某些PGH 菌株產(chǎn)生的植物激素可促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)、增強(qiáng)根系吸收礦物營(yíng)養(yǎng)和水分的能力，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。同時(shí)PGI^R在根圍的定殖能在一定程度上抑制病原物的定殖和傳播，而促進(jìn)菌根真菌的生長(zhǎng)發(fā)育，并對(duì)受污染土壤也具有一定的生物修復(fù)能力。因此，本發(fā)明旨在利用放線菌的抗生素活性和PGI^R中的巨大芽孢桿菌對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的生物防治作用，形成多樣性微生物菌群從而有效控制大豆胞囊線蟲(chóng)的危害，為我國(guó)植物寄生線蟲(chóng)的生物防治開(kāi)辟新的途徑。目前我國(guó)種衣劑市場(chǎng)比較薄弱，品種單一，原藥少?，F(xiàn)有種衣劑以農(nóng)藥劑型的種衣劑占多數(shù)，并且種衣劑中原藥品種以高毒農(nóng)藥呋喃丹為主來(lái)防治地下害蟲(chóng)，新的殺蟲(chóng)農(nóng)藥品種少。種衣劑配方中活性成分總含量偏低、成膜劑和助劑研究不夠，可選擇的品種少。隨著人們對(duì)各種安全因素的考慮，生物種衣劑正漸漸成為研究的熱點(diǎn)。通過(guò)生防菌株的篩選， 找到高效的菌株，再利用生物多樣性原理將多株生防菌株通過(guò)混配協(xié)同增效作用，應(yīng)用于生物種衣劑，從而達(dá)到增強(qiáng)作物抗逆能力、抗病蟲(chóng)以及促生增產(chǎn)的效果。菌株Snea253是本研究組從土壤中分離出來(lái)的一株生防放線菌(專利號(hào) ZL200810010465. X，菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 2348)，已于2010年7月7日獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵液中的殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)能很好的抑制和殺死大豆胞囊線蟲(chóng)；菌株Sneb207為本研究組分離出的一株促進(jìn)大豆生長(zhǎng)并可抑制大豆胞囊線蟲(chóng)的PGPR， 為巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium,已于2008年4月9日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 2447。將這2菌株生防菌的發(fā)酵液進(jìn)行混配，即達(dá)到抑制大豆胞囊線蟲(chóng)的繁殖作用，又能促進(jìn)大豆植株健康生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是獲得一種可以抑制大豆胞囊線蟲(chóng)病害促進(jìn)大豆生長(zhǎng)的生物種衣劑，依據(jù)生物多樣性原理，將多株具有殺線活性的菌株按常規(guī)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，使用該菌的代謝產(chǎn)物與其他元素、助劑等混配處理，形成生物種衣劑，用以包衣大豆種子，達(dá)到有效控制大豆胞囊線蟲(chóng)病害促進(jìn)大豆幼苗生長(zhǎng)的目的。本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，土壤放線菌和細(xì)菌有很多種類都具有一定的殺線活性，從這些生防菌株中篩選出復(fù)配效果好的組合委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Sti^ptomyces venezuelae) Snea253和巨大芽孢桿菌(Bacillus)B207進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。本發(fā)明的生防菌株委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Sti^ptomyces venezuelae) Snea253和巨大芽孢桿菌(Bacillus) Snel3207是通過(guò)試管菌種培養(yǎng)后，再經(jīng)擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)來(lái)制備，其具體方法如下1.試管菌種培養(yǎng)放線菌種子培養(yǎng)基配方可溶性淀粉20g，磷酸氫二鉀0. 5g，硝酸鉀lg，氯化鈉 0. 5g，硫酸亞鐵0. Olg，七水硫酸鎂0. 5g，瓊脂15-20g，加水至1000ml，pH為7. 2-7. 4。將接種于斜面上的Snea253置于恒溫培養(yǎng)5 7天。細(xì)菌培養(yǎng)基配方為牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基，即成分牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，酵母浸膏l(xiāng)g，蔗糖10g，瓊脂15g，加水至1000ml。將接種于斜面上的Sneb207置于25°C恒溫培養(yǎng)2d，獲得試管菌種。2.液體發(fā)酵培養(yǎng)放線菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉4%、葡萄糖2%、可溶性淀粉6%、硫酸銨 0. 4%、氯化鈉0. 2%、磷酸氫二鉀0. 02%、碳酸鈣0. 2%。細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基為液態(tài)NA培養(yǎng)基，配方為以重量百分比計(jì)，含有牛肉浸膏 0.2%、蛋白胨1%、酵母浸膏0.5%、蔗糖1%、余下為蒸餾水，pH為8。將試管菌種接種到250mL三角瓶(每瓶裝IOOmL)液體培養(yǎng)基中，25°C 下， 搖床轉(zhuǎn)速以150r · miiT1 200r · mirT1、振蕩培養(yǎng)48h，獲得種子培養(yǎng)液。液體發(fā)酵的菌種可以通過(guò)大型發(fā)酵罐進(jìn)行規(guī)模生產(chǎn)，其產(chǎn)品為發(fā)酵液或發(fā)酵液的制成品。
具體實(shí)施例方式為了更詳細(xì)地進(jìn)一步闡明而不是為了限制本發(fā)明，給出了下列實(shí)施例。
實(shí)施例1 生防菌的發(fā)酵委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Sti^ptomyces venezuelae) Snea253的液體培養(yǎng)的菌種接種到 50L-100L的發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，在下培養(yǎng)，初始pH為6，發(fā)酵120h_140h。巨大芽孢桿菌 (Bacillus) Sneb207的液體培養(yǎng)的菌種接種到50L-100L的發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，在25°C下培養(yǎng)，pH為8，發(fā)酵48h-72h。期間抽樣檢查發(fā)酵液對(duì)靶標(biāo)線蟲(chóng)的活性，按照活性標(biāo)準(zhǔn)曲線確定放罐時(shí)間。實(shí)施例2 元素用量的篩選所用試劑全部為分析純，包括磷酸二氫鉀、硫酸鉀、硫酸銅、硫酸錳、硫酸亞鐵、鉬酸銨、硼酸等。將各元素按照不同比例混合后研磨，加入粘結(jié)劑對(duì)大豆包衣，以大豆種子的發(fā)芽勢(shì)為篩選指標(biāo)，選出促進(jìn)大豆生長(zhǎng)的大量元素和微量元素的組合。組合配比(按重量百分比計(jì))CuS04 0 . 09%, (NH4)6Mo7O24 · 4H20 0. 18%, H3BO3 0. 04%, MnSO4 0. 3%, FeSO4 0. 04%, KH2PO4 1. 5%, K2SO4 1%。實(shí)施例3 控制大豆胞囊線蟲(chóng)的生物種衣劑制備將各生防菌發(fā)酵液處理后，按本發(fā)明的比例進(jìn)行復(fù)配后，再將各種元素按比例混合后粉碎研磨，再與助劑混合均勻加入蒸餾水?dāng)嚢璩删鶆虻恼吵硪?，濕法研磨，振蕩混合均勻，制備出本發(fā)明的生物種衣劑。實(shí)施例4 生物種衣劑的田間應(yīng)用效果2010年在遼寧省康平縣和黑龍江省安達(dá)市進(jìn)行田間小區(qū)播種試驗(yàn)。小區(qū)試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組5次重復(fù)的方法。每個(gè)處理5行區(qū)，2. 5m行長(zhǎng)，行距0. 65m,處理間隔lm，小區(qū)面積 8. Im2,總面積450m2。以不包衣為空白對(duì)照，以商品種衣劑為種衣劑對(duì)照。通過(guò)計(jì)數(shù)大豆根上胞囊數(shù)和根內(nèi)線蟲(chóng)數(shù)，田間考種結(jié)果顯示本發(fā)明的效果良好， 不但控制了大豆胞囊線蟲(chóng)數(shù)量的增殖，而且也促進(jìn)了大豆幼苗的生長(zhǎng)以及大豆產(chǎn)量的增加。試驗(yàn)結(jié)果如下表。表1大豆生物種衣劑處理大豆根外胞囊和根內(nèi)線蟲(chóng)數(shù)量的變化
權(quán)利要求
1.一種生物種衣劑，它包含對(duì)植物無(wú)害的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物、微量元素和大量元素， 以及其他助劑，能抑制大豆胞囊線蟲(chóng)病害并有促生增產(chǎn)作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的生物種衣劑，其中次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)自放線菌菌株Snea253(為委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Mi^ptomyces venezuelae，已于2008年1月18日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 2348)和根際促生芽孢桿菌Sneb207 (為巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium,已于2008年4月9日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 2447)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2的生物種衣劑，該生物種衣劑的微生物含量為IO8Cfu/ml ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1的生物種衣劑，其中微量元素和大量元素的配比為CuSO40. 09%, (NH4)6Mo7O24 · 4H20 0. 18%, H3BO3 0. 04%, MnSO4 0. 3%, FeSO4 0. 04%, KH2PO4 1. 5%, K2SO4 1%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的生物種衣劑，其中助劑包括成膜劑甲基纖維素占所述的生物種衣劑的重量比為4%-6%，分散劑木質(zhì)素磺酸占重量比為2%-4%，粘結(jié)劑羧甲基纖維素鈉占重量比為1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的生物種衣劑按種子量的均勻包于大豆表面，晾干后即可播種， 適用于大豆胞囊線蟲(chóng)的防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治大豆胞囊線蟲(chóng)的生物種衣劑，它包含2種生防菌株的殺線活性物質(zhì)、按比例混配的元素和各種助劑。大量試驗(yàn)證明，本發(fā)明生物種衣劑在理化性狀上都符合種衣劑的要求，包衣后明顯促進(jìn)大豆苗期的生長(zhǎng)，提高大豆產(chǎn)量，對(duì)大豆苗期胞囊線蟲(chóng)病害的控制效果顯著。
文檔編號(hào)A01C1/06GK102308853SQ20111004923
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者萬(wàn)傳浩, 朱曉峰, 段玉璽, 王媛媛, 郭寧, 陳立杰 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)