專利名稱：一種提高植物抗鹽性的紫草LeERF-1基因過表達載體及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物生物技術及遺傳育種技術領域，具體涉及一種來源于硬紫草的 ERF轉(zhuǎn)錄因子cDNA序列、氨基酸序列、DNA序列和啟動子區(qū)序列，及其cDNA序列在培育抗逆 (如抗鹽性)植物中的應用。
背景技術：
ERF 類轉(zhuǎn)錄因子屬于 AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族(Onate-Sanchez et al. , 2007; Plant Physiol. ； 143: 400—409; Pirrello et al., 2006; Plant Cell Physiol. ； 47: 1195-1205; Van der Fits and Memelink, 2001; Plant J. ； 25: 43-53)。ERF 作為植物中轉(zhuǎn)錄因子的大家族，其成員處在廣泛的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡中，不僅調(diào)控下游靶標基因的表達， 而且，自身也處于復雜的調(diào)控之下。乙烯、ABA、干旱、高溫、茉莉素、水楊酸、鹽堿、凍害、病害以及機械傷害等外界因子都可以誘導ERF類轉(zhuǎn)錄因子的表達。ERF含有一個高度保守的DNA結合域(定義為ERF域)，包含58_59個氨基酸，可與兩個相似的順式作用元件結合，即GCC盒和CRT/DRE (Buttner and Singh, 1997; PNAS ； 94: 5961-5966; Chakravarthy et al.，2003; Plant Cell; 15: 3033-3050; Gu et al.， 2002; Plant Cell; 14: 817-831; Pirrello et al., 2006; Plant Cell Physiol. ； 47: 1195-1205)。GCC盒存在于許多I3R基因的啟動子中，如煙草中的Tsil’ ERF2/4’ OPBPH 南芥中的ERFl，A tERFl/2, CBFl，DREB1/2，番茄中的Pti4/5/6等通過與GCC盒的結合來調(diào)控植物抗病相關基因及一些啟動子中含有GCC盒的其它信號途徑的基因的表達；而CRT/ DRE則主要調(diào)節(jié)干早和低溫反應相關基因的表達，如擬南芥的CBF1，DREBlA和DREB2A可以結合DRE順式作用元件，調(diào)控COR類基因的表達，提高植物對干早、滲透脅迫和凍害的抵抗能力，調(diào)控植物對非生物脅迫的耐性(Asselbergh et al.，2007; Plant Physiol.； 144: 1863-1877; Bart et al.，1998; PNAS； 95: 15107-15111; Chakravarthy et al.， 2003; Plant Cell; 15: 3033-3050; Gu et al., 2002; Plant Cell; 14: 817-831; Onate-Sanchez et al., 2007; Plant Physiol. ； 143: 400-409; Ronning et al., 2003; Plant Physiol. ； 131: 419-429)。據(jù)報導，分離的擬？廠中，擬南芥的TINY、AP2, ^VT等基因參與植物的生長和發(fā)育 (Buttner and Singh, 1997; PNAS ； 94: 5961-5966) d幼7 廠7 基因在擬南芥中超表達后對灰霉病、菌核病及白粉病都具有抗性(Onate-Sanchez et al.，2007; Plant Physiol.； 143: 400-409)；煙草脅迫誘導基因(7>幻7)超表達后對灰疫病、黑腐病、胡椒溫和斑點病毒(PMMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)的抗性增加；番茄的/^i^/i/^基因參與植物的抗病反應(Gu et al. , 2002; Plant Cell; 14: 817-831) fl參與抗冷害(Buttner, Singh, 1997; PNAS ； 94: 5961-5966) ；基因參與植物的次生代謝。而在ERF抗鹽研究方面，也有很多報道，如CBF1/2/3/4、DDFl、Tsil、CaERFLPl、 TERFl和基因參與了抗鹽反應，轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性得到了極大的提高。因此通過基因工程方法將ERF家族基因轉(zhuǎn)入植物中是一種培育抗鹽植物的有力途徑，對于我國乃至全球的鹽堿地開發(fā)及灘涂綠化具有重要的應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是提供一個可顯著提高植物抗鹽性的紫草基因過表達載體及其應用。(1)本發(fā)明的技術方案為通過PCR IfmmLeERF-I基因cDNA序列、DNA序列和啟動子區(qū)序列，并利用其cDNA序列構建植物過表達載體pBI121-LeERF-l-eGFP，通過農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化植物，提高植物抗鹽性能。本發(fā)明所提供基因，是具有SEQ ID Nol的cDNA序列 atggttccat ttccacaaag agacctccct ctcaatgaga atgactcaca agaaatcata60 ttatttgaaa ttctcaaaga ggctaacact ataatgagcc aattgagtca 120 aatttttcga gtcgagggcc aattcattcc atcgcgaata agcgttatag aggagtaagg 180 cgtcggccat gggggaaata tgcagttgag attcgtgact cgaatcgaca aggtcataga 240 gtttggcttg gaacatttgg gactgctgaa gaggctgcct tggcttatga tagagctgcc 300 tttaatatgc gtggtgccaa ggctttactt aattttccac ctgaacttgt tatgcaatca 360 tcgatagata ggattgggtt ctag 384 上述的Z^y /^-/基因是具有SEQ ID No2的氨基酸序列
Met Val Pro Phe Pro Gln Arg Asp Leu Pro Leu Asn Glu Asn Asp Ser 151015
Gln Glu lie lie Leu Phe Glu lie Leu Lys Glu Ala Asn Thr lie Met
202530
Ser Pro Pro Asn Lys lie Glu Ser Asn Phe Ser Ser Arg Gly Pro lie
354045
His Ser lie Ala Asn Lys Arg Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Pro Trp
505560
Gly Lys Tyr Ala Val Glu lie Arg Asp Ser Asn Arg Gln Gly His Arg 65707580
Val Trp Leu Gly Thr Phe Gly Thr Ala Glu Glu Ala Ala Leu Ala Tyr
859095
Asp Arg Ala Ala Phe Asn Met Arg Gly Ala Lys Ala Leu Leu Asn Phe
100105110
Pro Pro Glu Leu Val Met Gln Ser Ser lie Asp Arg lie Gly Phe
115120125
上述的Z^T /7-/基因是具有SEQ ID No3的DNA序列
atggttccat ttccacaaag agacctccct ctcaatgaga atgactcaca agaaatcata60
ttatttgaaa ttctcaaaga ggctaacact ataatgagcc
aattgagtca120
aatttttcga gtcgagggcc aattcattcc atcgcgaata agcgttatag aggagtaagg180
cgtcggccat gggggaaata tgcagttgag attcgtgact cgaatcgaca aggtcataga240gtttggcttg gaacatttgg gactgctgaa gaggctgcct tggcttatga tagagctgcc300
tttaatatgc gtggtgccaa ggctttactt aattttccac ctgaacttgt tatgcaatca360
tcgatagata ggattgggtt ctag384 上述的Z^y /7-/基因是具有SEQ ID No4的啟動子區(qū)DNA序列
aattggcttt aattaataca aggtgtatgt aatgtttgaa aaaaattcta tgatctctgg60
catgaaaata ttcatgtgtt ttcaccatga cctgatgaga ataatttgat gatgcatatg120
tttgatctga gcctgattat ttttggatat tttaggcaaa gatttaaaat ctatatttta180
ggcaaagatt gaaatctccg tttgattatg ttaattgttt tattaacttt ttttaagagg240
taagccgcgg tccttactat gcgcattagg taaacctcga actgacaggc tcgatcaaga300
aagtgttggt aggggaatcg aactcatgaa ctttcggtct cacctactcc accaacttgg360
ccacccttta gagtacaaat aaaatagaat gtgttttcaa cgtgagtaga accaagactt420
acttgaaaaa acttaagcca tcggtatttt tattaacttt gatatcaata gtgtcggttg480
aatgattact tatttctaga attaagattt gacttggatc ctaatgtttt aaccagattt540
tccatttcca gcccaactat ggcccagaac catctaacta aagcaaggcc gaacagtagt600
ggcctccttg cctcattggg tgcacaccag ccccaactat tttatggcag tcaatccaat660
gacgatgagg aggtcaattc atcacttaat tcacatgagt catgacacat gaataatata720
tgcacaccga caccacctca cacatgatgt cctatggttt agtgttgttt gtgagccggg780
ttatcctgga ctcaaaagaa tccgactcaa tgacatgatc gaaataaatt gattctgatt840
ttgatttgaa atattgactc gaaatagaat cggaacggat tcgagtattg tagattacac900
aatccataaa tccacgaaca aaacgagaca atgaaaacgt aatcaaatga gcactataag960
aacttgctta gacttgccat cacattaccc ctacctcgac cttttccacc cctacctcga1020
ccttttccac gaccacgccc ttgtccgccc ttcaaaattc gtcctctact attagacagt1080
gattgtggtg gaagagattg agagtaatat ttaaggagga ctttatgtca tatgcactga1140
attggagcca tatggcattg gactagattg agatgaagca ataattgaac atggagagtt1200
gccacttaat actggtcatg gatatagaag atgatgatgt tgaaattcca tatgcagtat1260
ttttccaatt tgaactatgt tgtagttaaa aaacatccaa tgagtcacga tataaacttt1320
gaaaatttaa taatctgtag aaaatgatgg tggtaattca aaatttaggg gttggcatgc1380
tgggctgtta tacatacacc taaatagtgc atggttggag gtgaaatgat tattttgtcc1440
ccccttccta tttgcaagta tagtagttag gaagtttcat taagaacaaa attgtcattt1500
cactaaaaaa aaatctattt gggtgtgtgt atagtattgc ccgttggcat gatggcatcg1560
cctatttgat ttttctaaag ttcctaatac tctcatcgtc tcaaaataaa tgattgttta1620
gatgaaaaat attttattag ggattgtgaa aaactacaat gaaattgtca aaaactatat1680
tgaaaatgta aaaagctaca ttgaaattat aaaaatgtat attgaaatgg taaagaatca1740
attattatgg aataaataat ttttttctag ataattctct tttttgaaat agagggagta1800
tttttaattc gatctccatc tatttagaca tacaagaaaa atgacttaag aaataagcga1860
cgctgtcgag ataatagaat agtctagcgg ttgagttaga atcggtagaa tgaaaagggg1920
tggagaattg ttactagaag cagtacgtaa tgccagtaaa gcctgacgga tgcgatgagg1980
tcatcattgt gtcagattca tggaattcaa tagaccgctc ctccaaggaa aattctttgt2040
agcaatccta ttcctatcat tacaatctgc taatcattgg cttcatttta atggactctc2100
5tttttcgata attatttttt attctaataa aattaatttg ttttaattta aaaattaaaa2160
ccttttcata atataactat acagtaattg acaattaaat tcggcatcaa agaaaacaaa2220
agcttgaatc aaaattcaaa acttagtgga gtaatatctt agtaacggtc gaatataaac2280
attcctaaat ttgaatacga atgaaactaa gataaagctc tataatggat gagtgtcttc2340
taagcaaaat ctaattacat catctttaaa tagggttaaa ttatcatata tattagcaag2400
tcaagtgttg aataaagtca ttaacataag aaagtattat tagtagtgca ttttgttcac2460
atcttacttt tggaccaatt gcaaaggcac aatcttctgg aaaaagaatt aatatcctct2520
tatgaaccac atgtccttgt actaatccta ggactctcaa ttataagtac gagtacatat2580
tgtgcacatt ttgttcatca caaaaatttc ttgtc2615
所用的cDNA克隆方法為常規(guī)PCR與RACE結合法，啟動子區(qū)擴增方法為Genome Walking PCR 法。所用的植物表達載體為pBI 121-eGFP載體，利用XbaI和BamHI酶切位點將厶站冗廠-纟基因的不含終止密碼子的open reading frame (ORF)區(qū)克隆入pBI121_eGFP載體,得到pBI121-LeERF-l-eGFP過表達載體。所用的轉(zhuǎn)化方法為根癌農(nóng)桿菌GV3101介導法。(2 )本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其有益效果是
LeERF-I基因是我們在研究過程中從硬紫草中克隆到的一個ERF家族B3亞家族新成員，通過進一步克隆其啟動子并序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因的啟動子區(qū)含有多種與植物抗性相關的啟動子元件，如抗鹽性、抗病菌侵染、抗寒性響應元件等，預示該基因還可能參與植物的多種逆境脅迫響應。進一步通過構建該基因的植物過表達載體，并通過農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，證實含該基因的過表達載體轉(zhuǎn)化植物后確實可顯著提高植物的抗鹽性。因此，我們的發(fā)明提供了一個可高效表達ERF家族新成員LeERF-I基因的過表達載體，應用該載體可培育高抗鹽性的植物新品種，對于我國乃至全球的鹽堿地開發(fā)及灘涂綠化具有重要的應用價值。


圖 1 Le-ERF-I 的 3，RACE 產(chǎn)物圖 2 Le-ERF-I 的 5，RACE 產(chǎn)物
圖3 Le-ERF-I與其他物種的氨基酸序列比對結果圖4 Le-ERF-I的進化樹分析
圖 5 Le-ERF-I 基因啟動區(qū) Genome Walking PCR 產(chǎn)物圖6 pBI 121-eGFP載體和紫草ERF基因PCR產(chǎn)物的雙酶切電泳7 pBI 121-eGFP和pBI121-LeERF-l_eGFP在擬南芥中的亞細胞定位圖8 pBI121-LeERF-l-eGFP過表達植株和野生型植株的抗鹽反應(左剛轉(zhuǎn)入含200 mM氯化鈉的培養(yǎng)基上；右轉(zhuǎn)入含200 mM氯化鈉的培養(yǎng)基上4 d后)。
具體實施例方式實施例1、硬紫草轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與序列分析
選取在光照條件下B5固體培養(yǎng)基上生長18天左右的紫草愈傷組織細胞接種到M9生產(chǎn)培養(yǎng)基中，于暗條件下?lián)u培，收集細胞，用液氮速凍后保存于一 80°C冰箱備用。利用GTC 法提取 RNA (Zhang et al. , 2010; Plant Biol. ； doi:10. 1111/ j.1438-8677. 2010. 00375. χ),參照 Clontech SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Mountain View, CA, USA)試劑盒說明書進行cDNA的第一鏈合成。根據(jù)滇紫草的 ERF 序列 φ^ΤΡ廠-7 (Qi et al. , 2008; J. Plant Physiol. ； 165，1474 - 1482)設計了用于 3，RACE 的引物，ERF-3-RACE-F :5，- TTC CAT TTC CAC AAA GAG ACC- 3，，利用該引物和試劑盒中的UPM引物進行PCR擴增得到約600 bp的ERF基因的3’端序列(圖1)； 并設計了用于 5，RACE 的引物 ERF-5-RACE-F1 :5，- GCC TCT TCA GCA GTC CCA AAT GTT CCA- 3，和 ERF-5-RACE-F2 5' - GCC GAC GCC TTA CTC CTC TAT AAC GCT- 3，，分別利用 ERF-5-RACE-F1 和 UPM 以及 ERF-5-RACE-F2 和 NUP 進行巢式 PCR 得到約 250 bp 的 ERF 基因的5’端序列(圖2)。分別對得到的3’端序列和5’端序列進行克隆測序后得到了 ERF基因的全長序列SEQ ID Nol,命名為LeERF-I。推測基因全長序列編碼128個氨基酸的多肽，氨基酸序列比對結果表明硬紫草的^和滇紫草的OpERF-I序列高度保守。分析結果表明LeERF-I具有一個 ΑΡ2 ？ ERF 保守區(qū)(圖 3)，禾口 Pti5, ERFl, 0RCA3 的同源性分別是 75%, 74% 和 66%。LeERF-I 和擬南芥所有ERF成員的進化分析表明，LeERF-I屬于B3亞家族，與已報道的擬南芥成員 ERFl, AtERFl5, 0RA59 和 AtERF14 進化距離較近(圖 4)。實施例2硬紫草LeERF-I轉(zhuǎn)錄因子基因的DNA序列擴增
根據(jù)的cDNA序列在兩端設計兩條引物，ERF-F 5’- ATG GTT CCA TTT CCA CAA AG- 3，禾口 ERF-R: 5' - GAA CCC AAT CCT ATC TAT CG- 3'，以硬紫草基因組 DNA 為模板，進行 PCR 擴增。PCR 擴增體系為10X PCR buffer 5 μ LUO mM dNTP mix 1 μ L、25 HiMMgCl2 3 μ LUO μ M上游引物和下游引物各1 μ L、基因組DNA 1 yL、Taq酶(TaKaRa Biotech. Co. , Ltd, Dalian, China) 0.5 μ L、滅菌水補齊到 50 μ L。PCR 擴增程序為 95°C預變性 5 min，然后 95°C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 1 min 共 30 個循環(huán)，72°C延伸 10 min。PCR擴增得到約400 bp的片段?？寺y序結果顯示該序列和cDNA序列完全一致，說 m LeERF-I基因無內(nèi)含子。實施例3硬紫草轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動子區(qū)DNA序列擴增
根據(jù)基因DNA序列設計了 3條特異性引物，ERF-Pl :5，_ ATG GAA TGA ATT GGC CCT CGA- 3' ；ERF-P2: 5' - TGG CCG ACG CCT TAC TCC TCT- 3'和 ERF-P3 5' - GCA GTC CCA AAT GTT CCA AGC- 3，，分別和 TaKaRa Genome Walking Kit (TaKaRa Biotech. Co. , Ltd, Dalian, China)試劑盒中的API引物進行PCR，按照說明書中的PCR條件進行擴增，得到一個約5K bp的條帶，測序結果表明該條帶是基因的上游啟動子區(qū)。對上述得到的基因的上游啟動子區(qū)提交到PLACE網(wǎng)站(http//www. dna. affrc. go. jp/PLACE/)進行motif的分析。結果表明，在的啟動子區(qū)有很多元件和激素誘導和抗逆境有關(表1)
表1 LeERF-I基因的上游啟動子區(qū)motif分析
權利要求
1. 一種表達硬紫草Zi^yp/^w基因的植物過表達載體，其特征是含有Zi^yp/^w基因的 pBI121-LeERF-l-eGFP 載體。
2.根據(jù)權利要求1所述的pBI121-LeERF-l-eGFP植物過表達載體的構建方法，其特征 LeERF-I基因和pBI121_EGFP載體分別用Xba I和BamH I雙酶切并回收目的片段，在T4 DNA連接酶的作用下連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后采用卡那霉素(Kan)培養(yǎng)基篩選即可得到含有pBI121-LeERF-l-eGFP過表達載體的陽性克隆。
3.根據(jù)權利要求1所述的pBI121-LeERF-l-eGFP植物過表達載體在培育抗鹽植物中的應用。
4.根據(jù)權利要求1所述的pBI121-LeERF-l-eGFP植物過表達載體在鹽堿地開發(fā)及灘涂綠化中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物生物技術及遺傳育種技術領域，具體涉及一種來源于硬紫草(LithospermumerythrorhizonSieb.etZucc)的ERF轉(zhuǎn)錄因子基因LeERF-1的cDNA序列(如SEQIDNo1)、氨基酸序列(如SEQIDNo2)、DNA序列(如SEQIDNo3)和啟動子區(qū)序列(如SEQIDNo4)，以及其植物過表達載體pBI121-LeERF-1-eGFP在培育抗逆(如抗鹽性)植物中的應用。本發(fā)明為通過基因工程手段培育高抗鹽性的植物新品種提供了一個重要的靶標，對于我國乃至全球的鹽堿地開發(fā)及灘涂綠化具有重要的應用價值。
文檔編號A01H5/00GK102453727SQ201010523749
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權日2010年10月29日
發(fā)明者尹雅樂, 張文舉, 彭欣, 戚金亮, 楊永華, 桂恒, 游錄鵬, 潘琴燕, 祖慧琳, 鄒愛蘭 申請人:南京大學