專利名稱：一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，適用于生產(chǎn)殺滅寄生性雜草菟絲子的真菌孢 子。
背景技術(shù)：
菟絲子是一種惡性寄生雜草，是國際植物病害檢疫對象。世界上共發(fā)現(xiàn)200余種 菟絲子，在我國發(fā)現(xiàn)的有10多種，分布在新疆、寧夏、四川、陜西、內(nèi)蒙古、山西、河北、山東、 江蘇、浙江、廣東、廣西、東北三省、臺灣等地區(qū)。菟絲子可在棉花、大豆、辣椒、甜菜、西紅柿、 桂圓、冬青、扶芳藤、榛子、連翹等多種農(nóng)作物、園藝植物和藥用植物上寄生。被寄生的植物 輕則減產(chǎn)20-30%，嚴(yán)重的甚至顆粒無收。目前在我國登記的可以殺滅菟絲子的農(nóng)藥只有一 種。但是使用農(nóng)藥來殺滅菟絲子，實(shí)際使用效果較差，殺滅率低，專一性差，對生產(chǎn)作物有不 良影響；而且有農(nóng)藥殘留問題，給人體健康和環(huán)境帶來危害。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的弊端，本發(fā)明提供一種對菟絲子具有殺滅專一性強(qiáng)、殺滅徹底、 時效長而且對人體和作物無害，不破壞環(huán)境的盤長孢菌的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明的技術(shù)方案是 一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟(1)菌種的制備；制備一級斜面菌種土豆培養(yǎng)基制作用新鮮土豆去皮后稱取200克，切成約半厘米見方的小塊，加入 到1000毫升水中，煮沸后保持沸騰半小時，然后用兩層紗布過濾，濾液補(bǔ)足水分到1000毫 升，加入葡萄糖20克，攪拌將葡萄糖溶解。然后加入20克瓊脂粉，加熱將瓊脂粉溶解，然后 分裝到試管中，121°C下高壓滅菌20分鐘，滅菌后趁熱擺成斜面，凝固后即成土豆斜面培養(yǎng)基?；蛘卟捎幂私z子種子培養(yǎng)基將20克菟絲子種子在800毫升水中煮沸，保持沸騰 半小時，然后用兩層紗布過濾，其余操作同土豆培養(yǎng)基斜面制作。斜面長度以占試管的1/3-1/2為宜。在無菌條件下將盤長孢菌接種到斜面上，在 25-27°C下避光培養(yǎng)3天。制備二級液體菌種菟絲子種子液體培養(yǎng)基配方粉碎后的菟絲子種子1%，淀粉2%，玉米漿4%，葡 萄糖1%，蛋白胨0. 1%，硫酸銨1%，碳酸鈣0.4%，硫酸鎂0.04%，磷酸氫二鉀0. 1%。加 水溶解后分裝至三角瓶中，裝量為三角瓶容量的1/3到1/5。將上述培養(yǎng)基在121°C下高壓滅菌30分鐘，待溫度降低到30°C時即可接種。在 無菌條件下，將一級斜面菌種用無菌水洗下后倒入三角瓶中，每個斜面菌種可接種3-5個 1000毫升的三角瓶。然后在搖床上，以28°C、250轉(zhuǎn)/分鐘，避光培養(yǎng)48小時。即為二級液 體菌種。制備三級生產(chǎn)用菌種在發(fā)酵罐中制備生產(chǎn)用菌種，發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基配方淀粉2%，葡萄糖1%，玉米漿3 %，硫酸銨0. 3 %，蛋白胨0. 1 %，碳酸鈣0.4%，氯化鈉0.3%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸 鎂0. 03%，豆油0. 3%。培養(yǎng)基在121°C高壓滅菌30分鐘，待培養(yǎng)基溫度降低至30°C時， 將二級液體菌種以無菌操作接入。接種比例為2%，即每2升二級液體菌種可接種100升 生產(chǎn)用液體培養(yǎng)基。發(fā)酵罐培養(yǎng)控制參數(shù)為溫度28°C，罐壓0. 5公斤/厘米2，通氣量 1 0.5(即1噸的發(fā)酵液，通氣量為每分鐘500升無菌空氣)，連續(xù)通氣培養(yǎng)48小時。(2)培養(yǎng)基的制備；(3)將步驟(1)中制備的菌種與步驟(2)中制備的培養(yǎng)基進(jìn)行混合，并攪拌均勻；(4)分裝到曲盤進(jìn)行發(fā)酵、培養(yǎng)；(2)至(4)的具體過程如下將麩皮60%，豆餅面20%，玉米面20%，另加水80%。 先將固體原料混合均勻，然后加水混合均勻，分裝在透氣的棉布袋中，每袋裝量不超過5公 斤，然后在121°C高壓滅菌1小時。待培養(yǎng)基溫度降低至30°C時，將三級生產(chǎn)用菌種按10% 的比例接種入固體培養(yǎng)基，攪拌均勻，分裝在曲盤中，曲盤上先用4層滅過菌的紗布鋪底， 每盤中所裝培養(yǎng)基高度不超過3厘米，上面再蓋4層滅過菌的紗布。將曲盤放在發(fā)酵間在 25-27°C避光培養(yǎng)3天，然后在30°C下避光培養(yǎng)1天。接種后12小時內(nèi)采用間歇通風(fēng)，半小 時一次，每次10-15分鐘。風(fēng)壓控制在10-15毫米水銀柱。室內(nèi)相對濕度95%，料溫27°C。 接種后12小時到24小時，通風(fēng)時間逐漸延長，風(fēng)壓控制在40-80毫米水銀柱。24小時后， 風(fēng)壓控制在120-160毫米水銀柱，相對濕度為95%。接種后60-72小時，降低濕度，提高風(fēng) 壓，加大風(fēng)量，促進(jìn)孢子成熟，料溫30°C，相對濕度60-70%。(5)晾干或者風(fēng)干將菌劑在蔭涼無陽光直射處晾干，至水分含量在12%以下；或 者用鼓風(fēng)機(jī)將菌劑吹干至水分降低到8%以下。(6)粉碎使用轉(zhuǎn)速不超過3000轉(zhuǎn)/分鐘的粉碎機(jī)將晾干的菌劑粉碎。(7)活菌數(shù)檢測檢測活菌數(shù)使用血球計數(shù)板。方法如下隨機(jī)從粉碎后的菌劑中 抽取10次，每次抽取大約10克左右，混勻。從中稱取20克，用兩層紗布包起。用潔凈的 水將紗布包浸泡20分鐘，期間要不停的揉搓紗布包并用水沖洗。將洗液攪勻，在血球計數(shù) 板上蓋好蓋玻片，用吸管吸取洗出的孢子液，使其沿著血球計數(shù)板的縫隙滴入計數(shù)室。在 400-600倍視野下，計數(shù)血球計數(shù)板上的四角和中間的共5個中格，將計數(shù)結(jié)果乘以IO4即 為每克含菌數(shù)。如果遇到菌在雙線上，則只需計數(shù)相鄰兩邊的菌數(shù)即可。(8)包裝儲藏按市場需要分裝成合適重量，用不透光的塑料袋或者布袋盛裝。附 上說明書，注明生產(chǎn)日期、成品含菌數(shù)、使用時的兌水量。在蔭涼干燥處儲藏，避免陽光直 射。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為用本方法生產(chǎn)的盤長孢菌劑對菟絲子具有殺滅專一性強(qiáng)、殺滅 徹底、時效長的特點(diǎn)，對人體和作物無害，不破壞環(huán)境，是一種無毒、高效、環(huán)境友好的生物 除草劑。


圖1是本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟
(1)菌種的制備；制備一級斜面菌種土豆培養(yǎng)基制作用新鮮土豆去皮后稱取200克，切成約半厘米見方的小塊，加入 到1000毫升水中，煮沸后保持沸騰半小時，然后用兩層紗布過濾，濾液補(bǔ)足水分到1000毫 升，加入葡萄糖20克，攪拌將葡萄糖溶解。然后加入20克瓊脂粉，加熱將瓊脂粉溶解，然后 分裝到試管中，121°C下高壓滅菌20分鐘，滅菌后趁熱擺成斜面，凝固后即成土豆斜面培養(yǎng)基?；蛘卟捎幂私z子種子培養(yǎng)基將20克菟絲子種子在800毫升水中煮沸，保持沸騰 半小時，然后用兩層紗布過濾，其余操作同土豆培養(yǎng)基斜面制作。斜面長度以占試管的1/3-1/2為宜。在無菌條件下將盤長孢菌接種到斜面上，在 25-27°C下避光培養(yǎng)3天。制備二級液體菌種菟絲子種子液體培養(yǎng)基配方粉碎后的菟絲子種子1%，淀粉2%，玉米漿4%，葡 萄糖1%，蛋白胨0. 1%，硫酸銨1%，碳酸鈣0.4%，硫酸鎂0.04%，磷酸氫二鉀0. 1%。加 水溶解后分裝至三角瓶中，裝量為三角瓶容量的1/3到1/5。將上述培養(yǎng)基在121°C下高壓滅菌30分鐘，待溫度降低到30°C時即可按種。在 無菌條件下，將一級斜面菌種用無菌水洗下后倒入三角瓶中，每個斜面菌種可接種3-5個 1000毫升的三角瓶。然后在搖床上，以28°C、250轉(zhuǎn)/分鐘，避光培養(yǎng)48小時。即為二級液 體菌種。制備三級生產(chǎn)用菌種在發(fā)酵罐中制備生產(chǎn)用菌種，發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基配方淀粉2%，葡萄糖1%，玉米 漿3 %，硫酸銨0. 3 %，蛋白胨0. 1 %，碳酸鈣0.4%，氯化鈉0.3%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸 鎂0. 03%，豆油0. 3%。培養(yǎng)基在121°C高壓滅菌30分鐘，待培養(yǎng)基溫度降低至30°C時， 將二級液體菌種以無菌操作接入。接種比例為2%，即每2升二級液體菌種可接種100升 生產(chǎn)用液體培養(yǎng)基。發(fā)酵罐培養(yǎng)控制參數(shù)為溫度28°C，罐壓0. 5公斤/厘米2，通氣量 1 0.5(即1噸的發(fā)酵液，通氣量為每分鐘500升無菌空氣)，連續(xù)通氣培養(yǎng)48小時。(2)培養(yǎng)基的制備；(3)將步驟(1)中制備的菌種與步驟(2)中制備的培養(yǎng)基進(jìn)行混合，并攪拌均勻；(4)分裝到曲盤進(jìn)行發(fā)酵、培養(yǎng)；(2)至(4)的具體過程如下將麩皮60%，豆餅面20%，玉米面20%，另加水80%。 先將固體原料混合均勻，然后加水混合均勻，分裝在透氣的棉布袋中，每袋裝量不超過5公 斤，然后在121°C高壓滅菌1小時。待培養(yǎng)基溫度降低至30°C時，將三級生產(chǎn)用菌種按10% 的比例接種入固體培養(yǎng)基，攪拌均勻，分裝在曲盤中，曲盤上先用4層滅過菌的紗布鋪底， 每盤中所裝培養(yǎng)基高度不超過3厘米，上面再蓋4層滅過菌的紗布。將曲盤放在發(fā)酵間在 25-27°C避光培養(yǎng)3天，然后在30°C下避光培養(yǎng)1天。接種后12小時內(nèi)采用間歇通風(fēng)，半小 時一次，每次10-15分鐘。風(fēng)壓控制在10-15毫米水銀柱。室內(nèi)相對濕度95%，料溫27°C。 接種后12小時到24小時，通風(fēng)時間逐漸延長，風(fēng)壓控制在40-80毫米水銀柱。24小時后， 風(fēng)壓控制在120-160毫米水銀柱，相對濕度為95%。接種后60-72小時，降低濕度，提高風(fēng) 壓，加大風(fēng)量，促進(jìn)孢子成熟，料溫30°C，相對濕度60-70%。(5)晾干或者風(fēng)干將菌劑在蔭涼無陽光直射處晾干，至水分含量在12%以下；或者用鼓風(fēng)機(jī)將菌劑吹干至水分降低到8%以下。(6)粉碎使用轉(zhuǎn)速不超過3000轉(zhuǎn)/分鐘的粉碎機(jī)將晾干的菌劑粉碎。(7)活菌數(shù)檢測檢測活菌數(shù)使用血球計數(shù)板。方法如下隨機(jī)從粉碎后的菌劑中 抽取10次，每次抽取大約10克左右，混勻。從中稱取20克，用兩層紗布包起。用潔凈的 水將紗布包浸泡20分鐘，期間要不停的揉搓紗布包并用水沖洗。將洗液攪勻，在血球計數(shù) 板上蓋好蓋玻片，用吸管吸取洗出的孢子液，使其沿著血球計數(shù)板的縫隙滴入計數(shù)室。在 400-600倍視野下，計數(shù)血球計數(shù)板上的四角和中間的共5個中格，將計數(shù)結(jié)果乘以IO4即 為每克含菌數(shù)。如果遇到菌在雙線上，則只需計數(shù)相鄰兩邊的菌數(shù)即可。(8)包裝儲藏按市場需要分裝成合適重量，用不透光的塑料袋或者布袋盛裝。附 上說明書，注明生產(chǎn)日期、成品含菌數(shù)、使用時的兌水量。在蔭涼干燥處儲藏，避免陽光直 射。本發(fā)明生產(chǎn)菌劑的使用方法1.使用方法將菌劑成品用紗布包好，在潔凈水中浸泡半小時，期間用手輕輕揉 搓紗布包，并反復(fù)用水沖洗幾次，盡量把菌劑洗脫下來。將濾液兌水后即可裝噴霧器使用。 按照菌劑含量，每克含菌數(shù)1億/克的菌劑每公斤可兌水5公斤，含菌數(shù)不同的菌劑依此比 例計算兌水量。噴霧器要清洗干凈，不能有農(nóng)藥殘留。菌劑要現(xiàn)配現(xiàn)用。2.噴打方法和時間在菟絲子剛纏繞植株時即可噴藥。噴藥時先用噴霧器噴頭挑 斷菟絲子莖，造成傷口后再噴藥效果更好。噴藥時間要在早晨或者傍晚，避免在陽光直射下 噴藥。小雨天也可噴藥，但是下大雨時不可噴藥。3.藥效噴藥后3天左右，菟絲子開始萎蔫，出現(xiàn)水浸狀。菌劑感染處凹陷，出現(xiàn) 褐色斑點(diǎn)。5天左右菟絲子上的病灶蔓延相連，7-10天菟絲子有明顯枯死。20天后受菟絲 子寄生植株恢復(fù)生長，菟絲子枯死脫落。4.實(shí)施例 1 我們在河北省唐山市樂亭縣被菟絲子寄生的冬青上使用本方法生產(chǎn)的菌劑，效果 明顯。打藥后5天，菟絲子枯萎死亡，冬青未受影響。10天后，冬青恢復(fù)生長。實(shí)施例2 在廣西興業(yè)縣農(nóng)業(yè)局下屬的桂圓種植園使用本方法生產(chǎn)的菌劑，效果明顯。打藥 3天后，菟絲子大部分已死亡，經(jīng)手工將枯死的菟絲子從桂圓上取下后，經(jīng)過5天后，桂圓恢 復(fù)正常生長。
權(quán)利要求
一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟(1)菌種的制備；(2)培養(yǎng)基的制備；(3)將步驟(1)中制備的菌種與步驟(2)中制備的培養(yǎng)基進(jìn)行混合，并攪拌均勻；(4)分裝到曲盤進(jìn)行發(fā)酵、培養(yǎng)；(5)晾干或者風(fēng)干；(6)粉碎；(7)活菌數(shù)檢測；(8)包裝儲藏。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟(1)中包括 以下步驟a.一級斜面菌種的制備以土豆斜面培養(yǎng)基或菟絲子種子斜面培養(yǎng)基在25-27°C避光 培養(yǎng)3天，即得。b.二級液體菌種的制備將下述原料粉碎后的菟絲子種子1%，淀粉2%，玉米漿 4%，葡萄糖1%，蛋白胨0. 1%，硫酸銨1%，碳酸鈣0.4%，硫酸鎂0. 04%，磷酸氫二鉀 0. 1%，加水溶解后分裝至三角瓶中，每一三角瓶的原料容量的裝量為三角瓶容量的1/3到 1/5。將上述培養(yǎng)基在121°C下高壓滅菌30分鐘，待溫度降低到30°C時即可接種，在無菌條 件下，將一級斜面菌種用無菌水洗下后倒入三角瓶中，每個斜面菌種可接種3-5個1000毫 升的三角瓶。然后在搖床上，以28°C、250轉(zhuǎn)/分鐘，避光培養(yǎng)48小時，即得二級液體菌種。c.三級生產(chǎn)用菌種的制備是在發(fā)酵罐中進(jìn)行制備的，發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基配方淀粉 2 %，葡萄糖1 %，玉米漿3 %，硫酸銨0. 3 %，蛋白胨0. 1 %，碳酸鈣0.4%，氯化鈉0. 3 %，磷 酸氫二鉀0. 1%，硫酸鎂0.03%，豆油0.3%。培養(yǎng)基在121°C高壓滅菌30分鐘，待培養(yǎng)基 溫度降低至30°C時，將二級液體菌種以無菌操作接入。接種比例為2%，即每2升二級液體 菌種可接種100升生產(chǎn)用液體培養(yǎng)基。發(fā)酵罐培養(yǎng)控制參數(shù)為溫度28°C，罐壓0. 5公斤/ 厘米2，通氣量1 0.5，連續(xù)通氣培養(yǎng)48小時，即得生產(chǎn)用菌種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟(2)中包括 以下步驟將麩皮60 %，豆餅面20 %，玉米面20 %進(jìn)行混合均勻，然后另加水80 %，成糊狀， 分裝在透氣的棉布袋中，上述固體原料每袋裝量不超過5公斤，然后在121°C高壓滅菌1小 時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述步驟(3)和(4) 中包括以下步驟待步驟(2)的培養(yǎng)基溫度降低至30°C時，將三級生產(chǎn)用菌種按10%的比 例接種入固體培養(yǎng)基，攪拌均勻，然后分裝在曲盤中，曲盤上先用4層滅過菌的紗布鋪底， 每盤中所裝培養(yǎng)基高度不超過3厘米，上面再蓋4層滅過菌的紗布。將曲盤放在發(fā)酵間在 25-27°C避光培養(yǎng)3天，然后在30°C下避光培養(yǎng)1天；接種后12小時內(nèi)采用間歇通風(fēng)，半小 時一次，每次10-15分鐘，風(fēng)壓控制在10-15毫米水銀柱，室內(nèi)相對濕度95%，料溫27°C ；接 種后12小時到24小時，通風(fēng)時間逐漸延長，風(fēng)壓控制在40-80毫米水銀柱；24小時后，風(fēng) 壓控制在120-160毫米水銀柱，相對濕度為95% ；接種后60-72小時，降低濕度，提高風(fēng)壓， 加大風(fēng)量，促進(jìn)孢子成熟，料溫30°C，相對濕度60-70%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟(5)為將菌劑在蔭涼無陽光直射處晾干，至水分含量在12%以下；或者用鼓風(fēng)機(jī)將菌劑吹干至水分 降低到8%以下。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟(6)中使 用轉(zhuǎn)速不超過3000轉(zhuǎn)/分鐘的粉碎機(jī)將晾干的菌劑粉碎。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟(7)為待 固體發(fā)酵第4天后，檢測活菌數(shù)，大于2億/克即為合格產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟a中采 用土豆培養(yǎng)基制作用新鮮土豆去皮后稱取200克，切成約半厘米見方的小塊，加入到1000 毫升水中，煮沸后保持沸騰半小時，然后用兩層紗布過濾，濾液補(bǔ)足水分到1000毫升，加入 葡萄糖20克，攪拌將葡萄糖溶解。然后加入20克瓊脂粉，加熱將瓊脂粉溶解，然后分裝到 試管中，121°C下高壓滅菌20分鐘，滅菌后趁熱擺成斜面，凝固后即成土豆斜面培養(yǎng)基，作 為一級斜面菌種。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的步驟a中菟絲 子種子培養(yǎng)基將20克菟絲子種子在800毫升水中煮沸，保持沸騰半小時，然后用兩層紗布 過濾濾液補(bǔ)足水分到1000毫升，加入葡萄糖20克，攪拌將葡萄糖溶解。然后加入20克瓊 脂粉，加熱將瓊脂粉溶解，然后分裝到試管中，121°C下高壓滅菌20分鐘，滅菌后趁熱擺成 斜面，凝固后即成菟絲子斜面培養(yǎng)基，一級斜面菌種。
10.根據(jù)權(quán)利8或9所述的一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的斜面長度以 占試管的1/3-1/2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種盤長孢菌的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟(1)菌種的制備；(2)培養(yǎng)基的制備；(3)將步驟(1)中制備的菌種與步驟(2)中制備的培養(yǎng)基進(jìn)行混合，并攪拌均勻；(4)分裝到曲盤進(jìn)行發(fā)酵、培養(yǎng)；(5)晾干或者風(fēng)干；(6)粉碎；(7)活菌數(shù)檢測；(8)包裝儲藏。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為用本方法生產(chǎn)的盤長孢菌劑對菟絲子具有殺滅專一性強(qiáng)、殺滅徹底、時效長的特點(diǎn)，對人體和作物無害，不破壞環(huán)境，是一種無毒、高效、環(huán)境友好的生物除草劑。
文檔編號A01N63/04GK101914455SQ20101025256
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者易叢琴, 賈佩嶠 申請人:易叢琴;賈佩嶠