專利名稱：一種紫馬鈴薯根尖脫毒與快繁技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物脫毒與組培快繁技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紫馬鈴薯的根尖脫毒和 組培快繁技術(shù)。
背景技術(shù)：
紫色馬鈴薯屬茄科一年生作物，原產(chǎn)澳大利亞。薯型長(zhǎng)橢圓型，表皮光滑，薯肉呈 紫黑色，富含花青素、Vc、胡蘿卜素等，兼具食用、藥用功能?；ㄇ嗨厥谴嬖谟谥参镏械乃?性色素，屬類黃酮化合物，是目前科學(xué)界發(fā)現(xiàn)的防治疾病，維護(hù)人類健康最直接、最有效、最 安全的自由基清除劑，其清除自由基的能力是VC的20倍，VE的50倍?；ㄇ嗨鼐哂行》肿?結(jié)構(gòu)，是唯一能透過血腦屏障清除自由基保護(hù)大腦細(xì)胞的物質(zhì)，同時(shí)能減少抗生素給人體 的一些危害。花青素除對(duì)致癌物質(zhì)有抑制作用外，還可以增強(qiáng)人體免疫力，延緩衰老，增強(qiáng) 體質(zhì)，增強(qiáng)視力。此外，紫馬鈴薯果肉淀粉含量高，口感較好，品質(zhì)極佳，適合深加工。因此， 紫馬鈴薯具有很好的研究開發(fā)和綜合利用價(jià)值。2000年后本項(xiàng)目組成員從澳大利亞引進(jìn)了 21個(gè)紫色馬鈐薯品種，通過組織繼代 從中培養(yǎng)了 6個(gè)品系，2006年移植大地，進(jìn)行系統(tǒng)選育，獲得芽眼淺、表皮光滑、肉色深紫， 口感好，并適合加工的甬紫1號(hào)新品種，并利用根尖脫毒技術(shù)獲得脫毒試管苗，通過組織培 養(yǎng)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速大量繁殖，至今實(shí)驗(yàn)室已完成脫毒試管苗15. 1萬株，同時(shí)進(jìn)行了 試管苗移栽試驗(yàn)，移栽成活率達(dá)到了 98 %以上，生產(chǎn)試管薯原原種32萬粒，繁殖原種129余 畝，初步摸索出了一套適合紫馬鈴薯的栽培技術(shù)。但在紫馬鈴薯的田間試植和組培快繁的過程中，很快發(fā)現(xiàn)存在有以下兩個(gè)問題一是紫馬鈴薯田間植株病毒發(fā)病嚴(yán)重。經(jīng)檢測(cè)，紫馬鈴薯病毒病是由18種病毒 復(fù)合侵染所致，其中，9種是專門寄生于馬鈴薯的病毒，另9種是來自其它寄主植物的病毒。 其中的馬鈴薯Y病毒(Potato Virus Y, PVY)、馬鈴薯卷葉病毒(Potato Leaf roll virus, PLRV)、馬鈴薯 X 病毒(Potato Virus X，，PVX)及馬鈴薯 S 病毒(Potato Virus S，PVS)，這 4種是危害馬鈴薯(包括紫馬鈴薯)最嚴(yán)重的病毒，是農(nóng)業(yè)部嚴(yán)格規(guī)定必須植檢的重點(diǎn)病毒 種類；同時(shí)這些病毒又均具有難以分離、純化的特點(diǎn)。針對(duì)這一特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室已研究成功 采用多重RT-PCR同步快速檢測(cè)技術(shù)，對(duì)紫馬鈴薯實(shí)施高靈敏度的病毒檢測(cè)，該技術(shù)無需分 離、純化，即能快速對(duì)紫馬鈴薯植株或試管苗實(shí)施是否帶這4種主要病毒及帶其中何種病 毒的檢測(cè)。二是紫馬鈴薯組培快繁污染率高。在采用傳統(tǒng)馬鈐薯莖尖脫毒的情況下，存在 有操作難度大、工作效率低(在顯微鏡下，用手術(shù)工具連續(xù)剝離十余層包裹于莖尖外的莖 片)，導(dǎo)致難以徹底剝離與消毒，一般組培苗污染率高達(dá)60%左右；同時(shí)還存有外植體分化 速度和脫毒試管苗繁殖速度較慢，微型薯長(zhǎng)勢(shì)弱及移植大田生產(chǎn)薯畝產(chǎn)偏低等問題。至目前，關(guān)于采用以紫馬鈴薯的根尖為外植體進(jìn)行脫毒和組培快繁的技術(shù)，目前 尚未見有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對(duì)馬鈐薯組培傳統(tǒng)莖尖脫毒技術(shù)所存在的操作繁瑣、效率低、消 毒難徹底、組培苗污染率高等問題，提出一種操作簡(jiǎn)便、效率高、消毒易徹底、組培苗污染率 低、繁殖速度快，苗質(zhì)好并與病毒檢測(cè)技術(shù)相配套的一種紫馬鈴薯根尖脫毒與快繁技術(shù)。一種紫馬鈴薯根尖脫毒與快繁技術(shù)，該技術(shù)按以下步驟進(jìn)行(1)培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和各階段培養(yǎng)基的組分及其每升所含的重量 為1)基本培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基 +NH4N03400mg/L+KN0350mg/L+KH2P04500mg/L+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 7-9g/L，pH 5. 6-5. 8 ；2)根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/L+BA0. 5-lmg/L+NAAO. 3-0. 7mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；3) ±曾殖培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基 +NH4N03400mg/L+KN03500mg/L+KH2P0450mg/ L+BA0. 2-0. 5mg/L+NAA0. 2-0. 5mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/0. 5L+BA0. 2-0. 5mg/L+NAA0. lmg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；5)生根培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基 +NH4N03400mg/L+KN03500mg/L+KH2P0450mg/ L+NAA0. 1-0. 5mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；6)微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/L+NAA0. 1-0. 5mg/L+6BA0. 5_lmg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；(2)根尖脫毒與快繁1)材料預(yù)處理和根尖外植體的選取、滅菌將紫馬鈴薯種薯放入滅菌細(xì)沙內(nèi)于 37 土 2°C下進(jìn)行熱處理6-12周至抽生出根系；取l-2cm長(zhǎng)主根根尖，經(jīng)70%酒精消毒 30秒、0. 升汞加一滴土溫?fù)u動(dòng)消毒8分鐘及無菌水洗3-5次后，在顯微鏡下將前端長(zhǎng) 0. 1-0. 2mm的根尖切下作為外植體，備用；2)根尖誘導(dǎo)再生植株培養(yǎng)將外植體接種在步驟(1)2)根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25 土 2°C、光強(qiáng)lOOOlux、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)，至四周后其余條件不變光強(qiáng)增強(qiáng)到20001UX， 六周后增強(qiáng)到40001UX，八周后減弱到15001UX下繼續(xù)培養(yǎng)直至從根尖誘導(dǎo)出再生植株幼 芽，此階段總共需培養(yǎng)3. 5-4. 5個(gè)月；3)幼芽增殖培養(yǎng)將幼芽接種在步驟(1)3)增殖培養(yǎng)基上，在25 土 2°C，光強(qiáng) 2000-30001ux、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)1個(gè)月至長(zhǎng)成8_10cm長(zhǎng)小苗；4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)將小苗剪成2-2. 5cm長(zhǎng)小段接種在步驟(1)4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)基 上，在25 土 2°C，光強(qiáng)2000-30001uX、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)至長(zhǎng)成8-lOcm長(zhǎng)小苗；以后每 隔3-4周按同上工藝進(jìn)行一次繼代擴(kuò)繁，直到滿足苗數(shù)要求；5)生根培養(yǎng)將繼代擴(kuò)增小苗接種到步驟(1) 5)生根培養(yǎng)基上，在25 土 2°C，光強(qiáng) 2000-30001uX、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)，1周后長(zhǎng)出根系成為完整試管苗；6)試管微型薯的培育將長(zhǎng)高至8-lOcm的試管苗，剪成帶有1_2個(gè)葉片和腋芽的 莖段，按每瓶5-6個(gè)莖段接種至裝于三角瓶?jī)?nèi)的步驟(1)6)微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；在22°C、 黑暗條件下培養(yǎng)10-15天始形成微型薯，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)6-8周后即可收獲微型薯；(3)紫馬鈴薯試管苗或試管微型薯的病毒檢測(cè)
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1)紫馬鈴薯病毒ssRNA的制備選取紫馬鈴薯馬鈴薯Y病毒(Potato Virus Y， PVY)、馬鈴薯卷葉病毒(Potato Leaf roll virus, PLRV)、馬鈴薯 X 病毒(Potato Virus X， PVX)及馬鈴薯S病毒(Potato Virus S，PVS)的葉片、葉梗、莖干或馬鈴薯塊莖為材料，放 入100mL0. 5Triton X-100 0. 4% Na2S03的病毒浸提液中；置37°C浸提20min，室溫浸提lh 后取上清液；經(jīng)12，000r/min離心機(jī)離心lOmin后，取上清液保存于-20°C，備用；2) cDNA合成根據(jù)馬鈴薯病毒CP基因序列設(shè)計(jì)出馬鈴薯X病毒(Potato Virus X, PVX)馬鈴薯 Y 病毒(Potato Virus Y, PVY)馬鈴薯卷葉病毒(Potato Leaf roll virus, PLRV)及馬鈴薯S病毒(Potato Virus S)的特異性引物對(duì)；cDNA合成每個(gè)反應(yīng)總體積為 10ii L，反應(yīng)試劑包括病毒總RNA 2. 5iiL，lX匪LV，含3謹(jǐn)ol/L MgCl2緩沖液，1. 5mmol/L dNTPs，2. 5U RNA酶抑制劑，50U MMLV反轉(zhuǎn)錄酶MMLVRT，0. 5 y mol/L反義引物；反應(yīng)程序?yàn)?25°C溫育 10mim，42°C反轉(zhuǎn)錄 45mim，95°C滅活 2mim ；所述的馬鈴薯病毒特異性引物對(duì)為PVS 上游引物 P1 5 ‘ -ATGCCGCCCAAACCGGATCCGTCA-3，PVS 下游引物 P2 5 ‘ -TCATTGGGTGATTGCATTACGGTG-3，PVY 上游引物 P3 5 ‘ -GCAAATGACACAATCGATGCAGGA-3，PVY 下游引物 P4:5 ‘-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3，PVX 上游引物 P5 5 ‘ -GAGCACAACACAGACCACAG-3，PVX 下游引物 P6 5 ‘ -GACTAGTTATGGTGGTGGGAGAG-3，PLRV 上游引物 P7 5 ‘ -CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA-3，PLRV 下游引物 P8:5 ‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT-3，；3)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為25 ii L，取4 ii L反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為PCR反 應(yīng)模板；多重PCR的反應(yīng)體系包括1XPCR反應(yīng)緩沖液，3. 5mmol/L dNTPs, Taq DNA聚 合酶2U，0. 5mmol/L特異性引物對(duì)；擴(kuò)增程序?yàn)?4 V變性30s，60 V復(fù)性30s，72 V延 伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin ；其中PCR反應(yīng)中所加引物的體積比例為 PVX PVY PLRV PVS = 0. 4 0. 5 0. 9 1.0;4)觀察電泳條帶以電泳條帶對(duì)照、確立紫馬鈴薯試管苗或試管微型薯有否感染 相應(yīng)病毒。本發(fā)明的有益效果是一、本發(fā)明在紫馬鈴薯組培工作中將傳統(tǒng)的莖尖脫毒改進(jìn)為根尖脫毒，產(chǎn)生了以 下幾點(diǎn)優(yōu)異效果1、操作容易、效率顯著提高因馬鈐薯的“莖尖”是由外圍十余層莖片包裹中心的 莖尖而組成，以往在顯微鏡下，用手術(shù)工具連續(xù)剝除十余層莖片是一項(xiàng)難度較大而效率很 低的工作；而馬鈐薯的“根尖”直接暴露在外，在顯微鏡下切取其根尖的尖端就顯得十分容 易，效率可提高幾十倍至上百倍；2、消毒徹底，污染率低莖尖脫毒由于其外圍莖片不易除凈，消毒也就難以徹底， 導(dǎo)致組培苗污染率往往高達(dá)60%左右；而根尖脫毒由于其外圍無任何包裹，消毒容易而徹 底，故其組培苗污染率可下降至13. 3% (見表1)；3、提高了組培苗的質(zhì)量本發(fā)明以根尖為外植體不僅成功培育出了紫馬鈴薯組培 苗，并通過試驗(yàn)后明確，根尖組培苗比莖尖組培苗在外植體分化速度、植株再生速度、試管苗繁殖速度及微型薯產(chǎn)量上均有提高(見表1)；4、經(jīng)大田種植試驗(yàn)后明確，根尖脫毒組培苗其生根率和移栽成活率高達(dá)98%以 上，薯產(chǎn)量也較莖尖脫毒組培苗略有提高。二、本發(fā)明針對(duì)紫馬鈴薯尤其是其根尖的特點(diǎn)，對(duì)各級(jí)培養(yǎng)基作了適應(yīng)性改進(jìn)與 調(diào)整，確保了根尖組培的成功。三、本發(fā)明對(duì)根尖外植體徹底的消毒措施與獨(dú)特的多重RT-PCR同步快速檢測(cè)病 毒技術(shù)相結(jié)合，確保了紫馬鈴薯組培苗的零帶毒，從而為紫馬鈴薯組培苗的優(yōu)質(zhì)、安全、高 產(chǎn)和大面積推廣奠定了基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例1 ( 一種紫馬鈴薯根尖脫毒與快繁技術(shù)1)(1)培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和各階段培養(yǎng)基的組分及其每升所含重量 為1)基本培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基 +NH4N03400mg/L+KN0350mg/L+KH2P04500mg/L+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 7g/L，pH 5. 8 ；2)根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/L+BA0. 5mg/L+NAA0. 7mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ； 3) ±曾殖培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基 +NH4N03400mg/L+KN03500mg/L+KH2P0450mg/ L+BAO. 5mg/L+NAA0. 2mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/0. 5L+BA0. 2mg/L+NAA0. lmg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；5)生根培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基 +NH4N03400mg/L+KN03500mg/L+KH2P0450mg/ L+NAAO. 5mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；6)微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/L+NAA0. lmg/L+6BA0. 75mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；所述的馬鈴薯基本培養(yǎng)基為馬鈴薯200g/L+蔗10g/L+瓊脂20g/L ；(2)根尖脫毒與快繁1)材料預(yù)處理和根尖外植體的選取、滅菌將紫馬鈴薯種薯放入滅菌細(xì)沙內(nèi)于37 土 2°C下進(jìn)行熱處理6-12周至抽生根系；取l-2cm長(zhǎng)主根根尖，經(jīng)70%酒精消毒30秒、 0. 升汞加一滴土溫?fù)u動(dòng)消毒8分鐘及無菌水洗3-5次后，在顯微鏡下將前端0. 1-0. 2mm 根尖切下作為外植體，備用；2)根尖誘導(dǎo)再生植株培養(yǎng)將外植體接種在步驟(1)2)根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25 土 2°C、光強(qiáng)lOOOlux、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)，至四周后其余條件不變光強(qiáng)增強(qiáng)到20001UX， 六周后增強(qiáng)到40001UX，八周后減弱到15001UX下繼續(xù)培養(yǎng)直至從根尖誘導(dǎo)出再生植株幼 芽，此階段總共需培養(yǎng)3. 5-4. 5個(gè)月；3)幼芽增殖培養(yǎng)將再生植株幼芽接種在步驟(1)3)增殖培養(yǎng)基上，在25 土 2°C， 光強(qiáng)2000-30001UX、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)1個(gè)月至長(zhǎng)成8-lOcm長(zhǎng)小苗；4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)將小苗剪成2-2. 5cm長(zhǎng)小段接種在步驟(1) 4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，在25 土 2°C，光強(qiáng)2000-30001UX、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)至8-lOcm長(zhǎng)小苗；以后每隔 3-4周按同上工藝進(jìn)行一次繼代擴(kuò)繁，直到滿足苗數(shù)要求；5)生根培養(yǎng)將繼代擴(kuò)繁小苗接種到步驟(1)5)生根培養(yǎng)基上，在25 土 2°C，光強(qiáng) 2000-30001uX、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)，1周后長(zhǎng)出根系成為完整試管苗；6)試管微型薯的培育將長(zhǎng)高至8-lOcm的試管苗，剪成帶有1_2個(gè)葉片和腋芽的 莖段，按每瓶5-6個(gè)莖段接種至裝于三角瓶?jī)?nèi)的步驟(1)6)微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在22°C、 暗培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)10天至15天始形成微型薯；相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)6-8周后即可收獲微 型薯；(3)紫馬鈴薯試管苗的病毒檢測(cè)1)紫馬鈴薯病毒ssRNA的制備選取紫馬鈴薯馬鈴薯Y病毒(Potato Virus Y， PVY)、馬鈴薯卷葉病毒(Potato Leaf roll virus, PLRV)、馬鈴薯 X 病毒(Potato Virus X， PVX)及馬鈴薯S病毒(Potato Virus S，PVS)的葉片、葉梗、莖干或馬鈴薯塊莖為材料，放 A lOOmLO. 5Triton X-100 0. 4% Na2S03 的病毒浸提液中；置 37°C浸提 20min，室溫浸提 lh 后取上清液；經(jīng)12，000r/min離心機(jī)離心lOmin后，取上清液保存于-20°C，備用；2) cDNA合成根據(jù)馬鈴薯病毒CP基因序列設(shè)計(jì)出馬鈴薯X病毒(Potato Virus X, PVX)馬鈴薯 Y 病毒(Potato Virus Y, PVY)馬鈴薯卷葉病毒(Potato Leaf roll virus, PLRV)及馬鈴薯S病毒(Potato Virus S)的特異性引物對(duì)；cDNA合成每個(gè)反應(yīng)總體積為 10ii L，反應(yīng)試劑包括病毒總RNA 2. 5iiL，lX匪LV，含3謹(jǐn)ol/L MgCl2緩沖液，1. 5mmol/L dNTPs，2. 5U RNA酶抑制劑，50U MMLV反轉(zhuǎn)錄酶MMLVRT，0. 5 y mol/L反義引物；反應(yīng)程序?yàn)?25°C溫育 10mim，42°C反轉(zhuǎn)錄 45mim，95°C滅活 2mim ；所述的馬鈴薯病毒(PVX、PVY、PLRV、PVS)特異性引物對(duì)為 3)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為25 ii L，取4 ii L反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為PCR反 應(yīng)模板；多重PCR的反應(yīng)體系包括1XPCR反應(yīng)緩沖液，3. 5mmol/L dNTPs, Taq DNA聚 合酶2U，0. 5mmol/L特異性引物對(duì)；擴(kuò)增程序?yàn)?4 V變性30s，60 V復(fù)性30s，72 V延 伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin ；其中PCR反應(yīng)中所加引物的體積比例為 PVX PVY PLRV PVS = 0. 4 0. 5 0. 9 1.0;4)觀察電泳條帶以電泳條帶對(duì)照、確立本例紫馬鈴薯試管苗未感染相應(yīng)病毒。實(shí)施例2 ( 一種紫馬鈴薯根尖脫毒與快繁技術(shù)2)(1)培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和各階段培養(yǎng)基的組分及其每升所含重量 為1)基本培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN0350mg/L KH2P04500mg/L+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 8g/L，pH 5. 7 ；2)根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/L+BA0. 8mg/L+NAA0. 5mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；3) ±曾殖培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基 +NH4N03400mg/L+KN03500mg/L+KH2P0450mg/ L+BAO. 35mg/L+NAA0. 35mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/0. 5L+BA0. 35mg/L+NAA0. lmg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；5)生根培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基 +NH4N03400mg/L+KN03500mg/L+KH2P0450mg/ L+NAAO. 3mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；6)微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/L+NAA0. 3mg/L+6BA0. 5mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；步驟(2)的根尖脫毒與快繁中，其步驟、工藝同實(shí)施例1 ；步驟(3)的病毒檢測(cè)中，以紫馬鈴薯試管微型薯為材料，其余步驟、工藝同實(shí)施例 1，檢測(cè)結(jié)果明確紫馬鈴薯試管微型薯未感染相應(yīng)病毒。實(shí)施例3 ( 一種紫馬鈴薯根尖脫毒與快繁技術(shù)3)(1)培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和各階段培養(yǎng)基的組分及其每升所含重量 為1)基本培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN0350mg/L KH2P04500mg/L+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 9g/L，pH 5. 6 ；2)根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/L+BAl. Omg/L+NAAO. 3mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；3) ±曾殖培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基 +NH4N03400mg/L+KN03500mg/L+KH2P0450mg/ L+BAO. 2mg/L+NAA0. 5mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/0. 5L+BA0. 5mg/L+NAA0. lmg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；
5)生根培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基 +NH4N03400mg/L+KN03500mg/L+KH2P0450mg/ L+NAAO. lmg/L+水解乳蛋白 lg/L+蔗糖 20g/L ；6)微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4N03400mg/L+KN03500mg/ L+KH2P0450mg/L+NAA0. 5mg/L+6BAl. 0mg/L+ 水解乳蛋白 lg/L+ 蔗糖 20g/L ；步驟⑵的根尖脫毒與快繁中，其步驟、工藝同實(shí)施例1 ；步驟(3)的病毒檢測(cè)中，以紫馬鈴薯試管苗為材料，其余步驟、工藝同實(shí)施例1，檢 測(cè)結(jié)果明確紫馬鈴薯試管苗未感染相應(yīng)病毒。試驗(yàn)例(紫馬鈴薯莖尖脫毒快繁與根尖脫毒快繁的效果對(duì)比試驗(yàn))該試驗(yàn)在浙江省農(nóng)科院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所衛(wèi)星車間_浙江省寧波市農(nóng)科 院組織培養(yǎng)中心內(nèi)進(jìn)行。2005年7月11日將甬紫1號(hào)紫馬鈴薯種薯放入滅菌細(xì)沙內(nèi)，于37 土 2°C下進(jìn)行 熱處理6-12周至抽生出根系；取l-2cm長(zhǎng)主根根尖158個(gè)，經(jīng)70%酒精消毒30秒、0. 升 汞加一滴土溫?fù)u動(dòng)消毒8分鐘及無菌水洗5次完成滅菌后，在顯微鏡下將其前端0. 1-0. 2mm 的根尖切下作為根尖組培用外植體；另取甬紫1號(hào)紫馬鈴薯莖尖518個(gè)，按同樣方法經(jīng)滅菌 處理后，在無菌室內(nèi)顯微鏡下，逐個(gè)用手術(shù)工具連續(xù)剝除包裹于其外的十余層莖片后，摘出 其內(nèi)長(zhǎng)0. 1 0. 3mm的莖尖，并從中挑選出158個(gè)結(jié)構(gòu)較為完整者作為莖尖組培用外植體；以實(shí)施例1各階段培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，并按該例的步驟、工藝，將上述的根尖和莖 尖組培用外植體進(jìn)行接種、管理與培養(yǎng)，最后將微型薯種入隔離網(wǎng)室進(jìn)行生產(chǎn)薯生產(chǎn)，試驗(yàn) 各階段的對(duì)比結(jié)果見表1。由表1可見，根尖污染21個(gè)，污染率為13.3%，而莖尖污染94個(gè)污染率高達(dá) 59.5% ；根尖平均愈傷組織為27天，而莖尖為28天；根尖形成再生植株平均為123天，而 莖尖再生植株為128天；根尖苗的月平均繁殖速度為4. 8倍，莖尖苗的月平均繁殖速度只有 4. 3倍；根尖組培苗的平均微型薯為3. 1粒/株，莖尖組培苗的平均微型薯為2. 4粒/株； 根尖苗大田畝均產(chǎn)達(dá)3088斤，莖尖苗畝均產(chǎn)為2995斤。由此可見根尖組培苗比莖尖組培 苗在外植體分化速度、植株再生速度、試管苗繁殖速度及微型薯的組培苗和大田產(chǎn)量均有 所提高。表1紫馬鈴薯莖尖脫毒與根尖脫毒的效果對(duì)比
權(quán)利要求
一種紫馬鈴薯根尖脫毒與快繁技術(shù)，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)培養(yǎng)基的配制，包括基本培養(yǎng)基和各階段培養(yǎng)基的組分及其每升所含的重量為1)基本培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4NO3400mg/L+KNO350mg/L+KH2PO4500mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂7-9g/L，pH 5.6-5.8；2)根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.5-1mg/L+NAA0.3-0.7mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；3)增殖培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+BA0.2-0.5mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/0.5L+BA0.2-0.5mg/L+NAA0.1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；5)生根培養(yǎng)基馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；6)微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用馬鈴薯基本培養(yǎng)基+NH4NO3400mg/L+KNO3500mg/L+KH2PO450mg/L+NAA0.1-0.5mg/L+6BA0.5-1mg/L+水解乳蛋白1g/L+蔗糖20g/L；(2)根尖脫毒與快繁1)材料預(yù)處理和根尖外植體的選取、滅菌將紫馬鈴薯種薯放入滅菌細(xì)沙內(nèi)于37土2℃下進(jìn)行熱處理6-12周至抽生出根系；取1-2cm長(zhǎng)主根根尖，經(jīng)70％酒精消毒30秒、0.1％升汞加一滴土溫?fù)u動(dòng)消毒8分鐘及無菌水洗3-5次后，在顯微鏡下將前端長(zhǎng)0.1-0.2mm的根尖切下作為外植體，備用；2)根尖誘導(dǎo)再生植株培養(yǎng)將外植體接種在步驟(1)2)根尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25土2℃、光強(qiáng)1000lux、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)，至四周后其余條件不變光強(qiáng)增強(qiáng)到2000lux，六周后增強(qiáng)到4000lux，八周后減弱到1500lux下繼續(xù)培養(yǎng)直至從根尖誘導(dǎo)出再生植株幼芽，此階段總共需培養(yǎng)3.5-4.5個(gè)月；3)幼芽增殖培養(yǎng)將幼芽接種在步驟(1)3)增殖培養(yǎng)基上，在25土2℃，光強(qiáng)2000-3000lux、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)1個(gè)月至長(zhǎng)成8-10cm長(zhǎng)小苗；4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)將小苗剪成2-2.5cm長(zhǎng)小段接種在步驟(1)4)繼代生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，在25土2℃，光強(qiáng)2000-3000lux、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)至長(zhǎng)成8-10cm長(zhǎng)小苗；以后每隔3-4周按同上工藝進(jìn)行一次繼代擴(kuò)繁，直到滿足苗數(shù)要求；5)生根培養(yǎng)將繼代擴(kuò)增小苗接種到步驟(1)5)生根培養(yǎng)基上，在25土2℃，光強(qiáng)2000-3000lux、光照16小時(shí)/d下培養(yǎng)，1周后長(zhǎng)出根系成為完整試管苗；6)試管微型薯的培育將長(zhǎng)高至8-10cm的試管苗，剪成帶有1-2個(gè)葉片和腋芽的莖段，按每瓶5-6個(gè)莖段接種至裝于三角瓶?jī)?nèi)的步驟(1)6)微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；在22℃、黑暗條件下培養(yǎng)10-15天始形成微型薯，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)6-8周后即可收獲微型薯；(3)紫馬鈴薯試管苗或試管微型薯的病毒檢測(cè)1)紫馬鈴薯病毒ssRNA的制備選取紫馬鈴薯馬鈴薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)、馬鈴薯卷葉病毒(Potato Leafroll virus，PLRV)、馬鈴薯X病毒(Potato Virus X，PVX)及馬鈴薯S病毒(Potato Virus S，PVS)的葉片、葉梗、莖干或馬鈴薯塊莖為材料，放入100mL0.5Triton X-100 0.4％Na2SO3的病毒浸提液中；置37℃浸提20min，室溫浸提1h后取上清液；經(jīng)12,000r/min離心機(jī)離心10min后，取上清液保存于-20℃，備用；2)cDNA合成根據(jù)馬鈴薯病毒CP基因序列設(shè)計(jì)出馬鈴薯X病毒(Potato Virus X，PVX)馬鈴薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)馬鈴薯卷葉病毒(Potato Leafroll virus，PLRV)及馬鈴薯S病毒(Potato Virus S)的特異性引物對(duì)；cDNA合成每個(gè)反應(yīng)總體積為10μL，反應(yīng)試劑包括病毒總RNA 2.5μL，1×MMLV，含3mmol/L MgCl2緩沖液，1.5mmol/L dNTPs，2.5U RNA酶抑制劑，50U MMLV反轉(zhuǎn)錄酶MMLVRT，0.5μmol/L反義引物；反應(yīng)程序?yàn)?5℃溫育10mim，42℃反轉(zhuǎn)錄45mim，95℃滅活2mim；所述的馬鈴薯病毒特異性引物對(duì)為PVS上游引物P15‘-ATGCCGCCCAAACCGGATCCGTCA-3’PVS下游引物P25‘-TCATTGGGTGATTGCATTACGGTG-3’PVY上游引物P35‘-GCAAATGACACAATCGATGCAGGA-3’PVY下游引物P45‘-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’PVX上游引物P55‘-GAGCACAACACAGACCACAG-3’PVX下游引物P65‘-GACTAGTTATGGTGGTGGGAGAG-3’PLRV上游引物P75‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA-3’PLRV下游引物P85‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT-3’；3)PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)總體積為25μL，取4μL反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為PCR反應(yīng)模板；多重PCR的反應(yīng)體系包括1×PCR反應(yīng)緩沖液，3.5mmol/L dNTPs，Taq DNA聚合酶2U，0.5mmol/L特異性引物對(duì)；擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性30s，60℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；其中PCR反應(yīng)中所加引物的體積比例為PVX∶PVY∶PLRV∶PVS＝0.4∶0.5∶0.9∶1.0；4)觀察電泳條帶以電泳條帶對(duì)照、確立紫馬鈴薯試管苗或試管微型薯有否感染相應(yīng)病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紫馬鈴薯根尖脫毒與快繁技術(shù)，屬于植物脫毒與組培快繁技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括(1)培養(yǎng)基的配制；(2)根尖脫毒與快繁；(3)紫馬鈴薯試管苗或試管微型薯的復(fù)合病毒感染多重RT-PCR同步快速檢測(cè)等步驟。該發(fā)明依據(jù)紫馬鈴薯的特點(diǎn)，對(duì)各級(jí)培養(yǎng)基作了調(diào)整，并改傳統(tǒng)的莖尖脫毒為根尖脫毒，簡(jiǎn)化了操作程序，避免了高污染率，提高了工作效率，且接種體分化好，試管苗繁殖速度快，脫毒徹底，微型薯長(zhǎng)勢(shì)好，月增殖率達(dá)到4-6倍，其生根率和移栽成活率達(dá)98％以上。本發(fā)明可在紫馬鈴薯適宜地區(qū)推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101849509SQ201010212600
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者嚴(yán)成其, 余初浪, 劉鍵, 徐剛, 朱紅芬, 楊勇, 沈嵐, 王栩鳴, 王芳, 程曄, 羊健, 蔣益虹, 陳劍平, 黃堅(jiān) 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院