專利名稱：多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醋糟深加工技術(shù)，具體為一種多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料 方法。
背景技術(shù)：
山西省是中國(guó)的一個(gè)產(chǎn)醋大省，目前的年產(chǎn)量達(dá)30萬(wàn)噸左右，由于我省食醋生產(chǎn) 工藝多采用固態(tài)發(fā)酵法，需要大量添加輔料和填充料，因而產(chǎn)生了大量副產(chǎn)品醋糟，而每生 產(chǎn)一噸醋，可生產(chǎn)約0. 3噸醋糟，也就是說(shuō)僅山西省每年就有9萬(wàn)噸左右醋糟。諸多醋廠因沒(méi)有很好的利用而導(dǎo)致醋糟多處堆積、發(fā)霉、變臭，造成環(huán)境污染、資 源浪費(fèi)等問(wèn)題。醋糟含有一定量的蛋白質(zhì)和脂肪，同時(shí)還含有B族維生素、無(wú)機(jī)鹽、未發(fā)酵 淀粉、糊精、有機(jī)酸等，可見(jiàn)醋糟對(duì)于開(kāi)發(fā)飼料來(lái)源有很大的前景。但同時(shí)也面臨著一些問(wèn) 題，醋糟中粗纖維含量高，熱能和消化率低，并含有一定量醋酸等，當(dāng)其作為粗飼料直接使 用，喂量受到控制，只能最低限度地維持牲畜的生命活動(dòng)。為了更好的開(kāi)發(fā)利用醋糟生產(chǎn)蛋白飼料，趙守賢，張宏斌等利用雙菌種混合發(fā)酵 醋糟蛋白飼料120天的飼喂試驗(yàn)表明，利用糖化力強(qiáng)的菌種與轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)高的酵母菌種同 步混合發(fā)酵處理醋糟，既可最大限度地提高醋糟的營(yíng)養(yǎng)成分，又可改善其適口性[2]。曹日 亮，楊晉青等利用混合菌種CY(C為擔(dān)子菌，Y為酵母菌)將醋糟發(fā)酵使其粗蛋白和真蛋白 的含量均有所提高，粗纖維含量降低。從而為醋糟的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)的理論依據(jù)，為利 用微生物發(fā)酵糟渣類飼料，開(kāi)辟豬的非常規(guī)飼料資源的生產(chǎn)實(shí)踐，提供了可行性技術(shù)方案。 張建新，岳文斌等以醋糟為底物，對(duì)木霉、曲霉進(jìn)行篩選及產(chǎn)酶條件研究并優(yōu)選出適合醋糟 發(fā)酵的菌種或組合。劉軍以醋糟為主要原料，經(jīng)酵母固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的方法，使醋糟 粗蛋白有所提高并得到適宜的發(fā)酵條件。但目前醋糟用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料的方法仍然不夠 全面和合理。申請(qǐng)?zhí)?00710139651. 9采用紅曲霉菌生產(chǎn)醋糟生物飼料的方法一種采用紅 曲霉菌生產(chǎn)醋糟生物飼料的方法，其制作步驟是A.首先將紅曲霉菌原種通過(guò)一級(jí)試管擴(kuò) 繁、二級(jí)液體培養(yǎng)制成種菌；B.接著按下述重量百分比把新鮮黑小麥醋糟和麥麩混合攪拌 均勻成混合物料，新鮮黑小麥醋糟80 87%、麥麩13 20% ；C.按混合物料重量的3 5%接種培養(yǎng)好的紅曲霉菌種菌；D.將接種的物料放入發(fā)酵池中發(fā)酵6 8天，發(fā)酵的溫度 為30 35°C ；Ε.最后把發(fā)酵好的濕飼料烘干并粉碎即制成飼料。申請(qǐng)?zhí)?8124959. 0高 蛋氨酸生物飼料蛋白及其制備方法，一種高蛋氨酸生物飼料蛋白，它主要由植物餅粕，酒、 醬醋糟，粗淀粉，棒桿菌，葡萄糖，有機(jī)氮，黑曲霉等，經(jīng)粉碎，攪拌，發(fā)酵，粉碎，干燥而成，其 特征在于它是由下述重量百分比的原料制成的生物飼料蛋白植物餅粕60-70%酒醬醋糟 5-15%粗淀粉5-10%棒桿菌2-3%葡萄糖3-8%有機(jī)氮2_5%黑曲霉2_3%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了提高利用微生物發(fā)酵醋糟生產(chǎn)得到的蛋白飼料中氨基酸、維生素、生 物活性物質(zhì)、益生素等成分，并且改善發(fā)酵飼料的適口性。而提供了一種多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法。本發(fā)明是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法， 使用的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，料水比1 0.5-0. 7，發(fā)酵溫度26-30°C，接菌種量為10-20%，發(fā)酵 時(shí)間為48-120h ；菌種組合為平菇+白地霉+釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母?！N多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法，使用的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，料水比 1 0.6，發(fā)酵溫度28°C，接菌種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為72h;其中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基各個(gè)組分的重量比為醋糟50-60%，酒糟20-30%，麩皮 10-20%，玉米粉8-12% ；再添上述組分混合重量計(jì)算的硫酸銨0. 5-1.5%，磷酸二氫鉀 0. 6-1. 0%，硫酸鎂 0. 4-1. 0%o其中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基各個(gè)組分的重量比為醋糟50%，酒糟25%，麩皮15%，玉米 粉10% ；再添上述組分混合重量計(jì)算的硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.8%，硫酸鎂0.8% ；菌種組合為平菇+白地霉+釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母，按平菇釀酒酵母+產(chǎn)朊 假絲酵母+白地霉=1 2-3質(zhì)量比的接種比(其中釀酒酵母產(chǎn)朊假絲酵母白地霉= 1:1:1)，最終發(fā)酵產(chǎn)品成分分析測(cè)定結(jié)果如下發(fā)酵產(chǎn)品中菌體細(xì)胞數(shù)為29.67乂108個(gè)/ g。粗蛋白含量為31. 75%，粗蛋白含量比發(fā)酵前提高了 15. 96%。真蛋白含量為24. 50%，真 蛋白含量比發(fā)酵前提高了 23. 17%。纖維素酶，糖化酶和酸性蛋白酶活力分別為917. 24U/ g，705. 94U/g，643. 5U/g。產(chǎn)品中各氨基酸均有所提高，其中6種必需氨基酸提高30%以上， 總氨基酸含量提高31. 42%。原料轉(zhuǎn)化率為95. 71 %。雖然目前已有利用醋糟生產(chǎn)蛋白飼料的相關(guān)報(bào)道，但是鮮見(jiàn)關(guān)于鮮醋糟不經(jīng)過(guò)滅 菌處理直接進(jìn)行發(fā)酵的報(bào)道。而使用鮮醋糟可以節(jié)省滅菌的成本。大多數(shù)研究采用黑曲 霉，綠色木霉等分解纖維素的霉菌進(jìn)行發(fā)酵，但本發(fā)明沒(méi)有選用這些霉菌，而選用平菇作為 分解纖維素的菌種。這是因?yàn)橐环矫婵紤]到產(chǎn)品感官質(zhì)量，另一方面是考慮到安全性。本 發(fā)明技術(shù)方案的創(chuàng)新就在于用大型食用真菌平菇和其他菌種共同發(fā)酵。本發(fā)明采用鮮醋糟 作為發(fā)酵的主要基質(zhì)，輔以酒糟。酒糟可以是酒精發(fā)酵中的下腳料，其含有大量的粗蛋白和 少量淀粉、糖，均可被菌體利用。本發(fā)明通過(guò)微生物發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料，使產(chǎn)品不僅含較豐富的氨基酸、維生 素、生物活性物質(zhì)、益生素等成分，而且改善發(fā)酵飼料的適口性。探索出一種符合山西實(shí)際、 切實(shí)可行的醋糟發(fā)酵方法，進(jìn)一步推行循環(huán)經(jīng)濟(jì)，既可節(jié)約開(kāi)支、降低成本，變廢為寶，改善 環(huán)境，又可帶動(dòng)農(nóng)村規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與環(huán)境保護(hù)雙贏的目標(biāo)。第一部分菌種組合及發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選目的是通過(guò)挑選四種屬于飼用安全范圍內(nèi)的適合單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)的菌株(平菇、 白地霉、假絲酵母、釀酒酵母)，進(jìn)行雙菌種，三菌種和四菌種組合發(fā)酵試驗(yàn)，并確定菌種最 佳組合。使用所選菌種組合，分別對(duì)不同添加量的原輔料以及不同添加量的硫酸銨、硫酸 鎂、磷酸二氫鉀進(jìn)行發(fā)酵，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)不同配方發(fā)酵產(chǎn)物用血球計(jì)數(shù)法計(jì)菌體細(xì)胞 數(shù)進(jìn)行分析，最后確定合理的培養(yǎng)基配方。原料準(zhǔn)備菌種產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、白地霉、平菇。主要原料和試劑鮮醋糟(含水量約68% )；酒糟(含水量約10% )；麩皮；玉 米粉葡萄糖(C6H12O6),蛋白胨，酵母膏，瓊脂，磷酸二氫鉀(KH2PO3),硫酸鎂(MgSO4)硫酸銨[(NH4)2SO4]培養(yǎng)基①馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18-20g，水IOOOmL, pH 自然，0. IOMPa 滅菌 20min ；②酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基葡萄糖2g，蛋白胨2g，酵母膏l(xiāng)g，蒸餾水 100ml, pH 自然，0. IOMPa 滅菌 20min。③液體搖瓶培養(yǎng)基不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基和酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基。④基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基鮮醋糟60 %，酒糟20 %，麩皮10 %，玉米粉10 %，硫酸銨1 %， 磷酸二氫鉀0.5%，硫酸鎂0.5%，料水比1 0. 5。菌種活化，然后液體菌種培養(yǎng)。以下為篩選方法及結(jié)果發(fā)酵工藝流程將醋糟、酒糟和其他輔料混勻，接種量為10%，在28°C條件下發(fā)酵 4d后，一部分在40°C下烘干，用以測(cè)定其水分，另一部分利用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定其菌體細(xì) 胞數(shù)，最終結(jié)果以樣品含水量為10%計(jì)。1、菌種組合的篩選將四個(gè)菌種分為纖維素分解菌(平菇)和產(chǎn)蛋白菌(釀酒酵 母、白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母)兩類，將纖維素分解菌和產(chǎn)蛋白菌按1 1的接種比接入培養(yǎng) 基中(其中含有1個(gè)以上產(chǎn)蛋白菌時(shí)各菌種以等質(zhì)量比例混合)，進(jìn)行雙菌、三菌和四菌混 合發(fā)酵選出最佳的菌種組合。7種菌種組合發(fā)酵分別編號(hào)為1.平菇+白地霉、2.平菇+釀酒酵母、3.平菇+產(chǎn) 朊假絲酵母、4.平菇+白地霉+釀酒酵母、5.平菇+白地霉+產(chǎn)朊假絲酵母、6.平菇+釀酒 酵母+產(chǎn)朊假絲酵母、7.平菇+白地霉+釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母。菌種組合的篩選結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果如圖1-1所示，處理7的菌種組合即平菇+白地霉+釀酒酵母+產(chǎn)朊假 絲酵母為最佳菌種組合，菌體細(xì)胞數(shù)最多達(dá)13. 1億個(gè)/g。結(jié)果表明四菌種混合發(fā)酵效果 高于雙菌種和三菌種。多菌種混合發(fā)酵主要是利用不同微生物之間的協(xié)同性、互補(bǔ)性，使其 發(fā)揮出正組合效應(yīng)。利用平菇能夠有效地將纖維素降解為酵母能夠利用的單糖類物質(zhì)，使 得到酵母良好的生長(zhǎng)繁殖，合成更多的菌體蛋白。由于平菇的接種量都是相同的，結(jié)果差異 是由白地霉、釀酒酵母和產(chǎn)朊假絲酵母之間不同組合的協(xié)同發(fā)酵造成的。2、發(fā)酵原料正交試驗(yàn)在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基和確定菌種組合的基礎(chǔ)上改變醋糟，酒 糟，麩皮，玉米粉的添加量(其中醋糟含量不得低于50%;發(fā)酵原料以100%計(jì)，不足的以麩 皮補(bǔ)足)，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(菌體細(xì)胞數(shù))進(jìn)行極差分析和直觀分析以及 方差分析，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵原料配比。發(fā)酵原料配比正交試驗(yàn)結(jié)果對(duì)醋糟，酒糟，玉米粉進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)(其中原料總量以100%計(jì)， 不足的以麩皮補(bǔ)足)，以進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵原料組成。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1-1，正 交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1-2。表I-IL9 (33)發(fā)酵原料因素水平表 注原料以100%計(jì)，不足的以麩皮補(bǔ)足表1-2發(fā)酵原料配比正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 根據(jù)表1-2，以樣品中菌體細(xì)胞數(shù)為指標(biāo)，因素A的極差最大，其次是B，最少是C， 所以影響菌體細(xì)胞數(shù)的因素主次順序?yàn)锳 > B > C ；在水平上，最佳組合為A1B2C2即A(醋 糟)為50%，B(酒糟)為25%，C(玉米粉)為10%，麩皮為15%。為了更加直觀的看出各因素水平間的差異對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響，以各因素水平為 橫坐標(biāo)，各因素水平菌體細(xì)胞數(shù)的k(平均值)為縱坐標(biāo)作直觀分析圖1-2。根據(jù)圖1-2可知，可以確定理論上的最優(yōu)組合是A1B2C2，這個(gè)組合與9次試驗(yàn)獲得 的結(jié)果相同，所以該組合為最佳發(fā)酵原料的組合。
表1-3發(fā)酵原料正交試驗(yàn)方差分析表 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析見(jiàn)表1-3，結(jié)果表明在所選中的因素和水平范圍內(nèi)，因素 A的F值極顯著，因素B的F值顯著，因素C的F值不顯著，所以影響菌體細(xì)胞數(shù)的因素主次 順序?yàn)锳 > B > C。在三個(gè)因素中鮮醋糟的添加量對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響最大，隨著添加量 的減少菌體細(xì)胞數(shù)增加，但考慮到試驗(yàn)的目的因此添加量為50%。酒糟的添加量對(duì)菌體細(xì) 胞數(shù)影響較大，添加量為25%時(shí)菌體細(xì)胞數(shù)最大。玉米粉的添加量對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)影響不顯
-frh-
者O3、硫酸銨添加量的影響方法是在發(fā)酵原料正交試驗(yàn)中得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和確定菌種組合的基礎(chǔ)上 改變硫酸銨的添加量為0. 0%、0. 1 %、0. 5%、1. 0 %、1. 5%和2. 0 %，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，對(duì)實(shí) 驗(yàn)結(jié)果(菌體細(xì)胞數(shù))分析，確定硫酸銨的最佳添加量。硫酸銨添加量的影響結(jié)果如圖1-3所示，隨著硫酸銨添加量的增加，菌體細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)出現(xiàn)先增加后減少的 趨勢(shì)。這是由于微生物生長(zhǎng)需要適宜的C/N，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中碳源的含量不變，因此隨著硫酸 銨的添加量的增加，可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，在添加量為1.0%時(shí)菌體細(xì)胞數(shù)達(dá)最大值為 29. 64X IO8個(gè)/g。但是隨著硫酸銨的添加量的繼續(xù)增加，造成C/N不適宜，從而抑制了微 生物的生長(zhǎng)，所以菌體細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。因此硫酸銨的最佳添加量為1.0%。4、磷酸二氫鉀添加量的影響在發(fā)酵原料正交試驗(yàn)中得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和確定菌種組合的基礎(chǔ)上改變磷 酸二氫鉀的添加量為0. 0%、0. 2%,0. 4%,0. 6%、0. 8%和1. 0%，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn) 結(jié)果(菌體細(xì)胞數(shù))分析，確定磷酸二氫鉀的最佳添加量。磷酸二氫鉀添加量的影響結(jié)果如圖1-4所示，隨著磷酸二氫鉀添加量的增加，菌體細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)出現(xiàn)增加后穩(wěn)定 的趨勢(shì)。說(shuō)明隨著磷酸二氫鉀的添加量的增加，可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，在添加量達(dá)到 0. 8 %時(shí)菌體細(xì)胞數(shù)達(dá)最大為23. 58 X IO8個(gè)/g。但是隨著磷酸二氫鉀的添加量的繼續(xù)增加， 微生物的生長(zhǎng)量基本趨于穩(wěn)定。因此磷酸二氫鉀的最佳添加量為0. 8%。5、硫酸鎂添加量的影響在發(fā)酵原料正交試驗(yàn)中得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和確定 菌種組合的基礎(chǔ)上和確定菌種組合的基礎(chǔ)上改變硫酸鎂的添加量為0. 0%、0. 2%、0. 4%、 0.6%、0. 8%和1.0%，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(菌體細(xì)胞數(shù))分析，確定硫酸鎂的最 佳添加量。硫酸鎂添加量的影響結(jié)果如圖1-5所示，隨著硫酸鎂添加量的增加，菌體細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)出現(xiàn)增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)。說(shuō)明隨著硫酸鎂的添加量的增加，可以促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，但是隨著硫酸鎂的添加量 的繼續(xù)增加，微生物的生長(zhǎng)量基本趨于穩(wěn)定。在添加量為0. 6%時(shí)菌體細(xì)胞數(shù)達(dá)最大值為 24. 24X IO8個(gè)/g。因此硫酸鎂的最佳添加量為0. 6%。6、無(wú)機(jī)離子添加量正交試驗(yàn)在發(fā)酵原料正交試驗(yàn)中得到的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基、確定的菌種組合和以上單因素實(shí) 驗(yàn)的基礎(chǔ)上改變硫酸銨，磷酸二氫鉀和硫酸鎂的添加量，進(jìn)行L9 (33)正交試驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (菌體細(xì)胞數(shù))進(jìn)行極差分析和直觀分析以及方差分析，進(jìn)一步優(yōu)化無(wú)機(jī)離子的添加量。無(wú) 機(jī)鹽添加量正交試驗(yàn)結(jié)果在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)硫酸銨，磷酸二氫鉀，硫酸鎂進(jìn)行三因素三水平的 正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步確定最佳無(wú)機(jī)離子添加量組成。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1-4，正交試 驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1-5。表1_4L9(33)無(wú)機(jī)離子因素水平表 表1-5無(wú)機(jī)離子正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 根據(jù)表1-5，以菌體細(xì)胞數(shù)為指標(biāo)，因素A的極差最大，其次是B，最少是C，所以影 響菌體細(xì)胞數(shù)的因素主次順序?yàn)锳 > B > C ；在水平上，最佳組合為A2B2C3即A(硫酸銨) 為1.0%，8(磷酸二氫鉀)為0.8%，C(硫酸鎂)為0.8%。為了更加直觀的看出個(gè)因素水平間的差異對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響，以各因素水平為 橫坐標(biāo)，各水平菌體細(xì)胞數(shù)的k(平均值)為縱坐標(biāo)作直觀分析圖1-6。根據(jù)圖1-6可知，可以確定理論上的最優(yōu)組合是A2B2C3，這個(gè)組合與9次試驗(yàn)獲得 的結(jié)果相同，所以該組合為最佳組合。 表1-6無(wú)機(jī)離子正交試驗(yàn)方差分析表 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析見(jiàn)表1-6，結(jié)果表明在所選因素和水平范圍內(nèi)，因素A的 F值顯著，因素B和C的F值不顯著，所以A因素(硫酸銨)是影響菌體細(xì)胞數(shù)的最主要因 素，B (磷酸二氫鉀)、C (硫酸鎂)因素影響不大。這說(shuō)明硫酸銨的添加量影響到C/N，從而 影響到微生物的生長(zhǎng)繁殖，無(wú)機(jī)鹽磷酸二氫鉀和硫酸鎂提供微生物所需的大量元素，是細(xì)胞的組成成分、維持細(xì)胞滲透壓、維持酸堿度的穩(wěn)定以及激活酶不可缺少的物質(zhì)，但對(duì)菌體 細(xì)胞數(shù)的影響不大，添加足量即可。第二部分發(fā)酵工藝條件的研究在上述最優(yōu)菌種組合和最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)行含水量、培養(yǎng)溫度、接種 量、接種比例和發(fā)酵時(shí)間單因素試驗(yàn)，并且根據(jù)接種量、接種比例和發(fā)酵時(shí)間的單因素試驗(yàn) 結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的發(fā)酵工藝條 件。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基比例鮮醋糟50%，酒糟25%，麩皮15%，玉米粉10%;硫酸銨1%，磷 酸二氫鉀0.8%，硫酸鎂0.8%。1、料水比的影響在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別以料水比為1 0.4、1 0.5,1 0.6,1 0.7
和1 0.8進(jìn)行單因素試驗(yàn)，從而確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳料水比。料水比的影響結(jié)果分析如圖2-1所示，隨著含水量的增加，菌體細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。說(shuō) 明微生物需要在適宜含水量的環(huán)境中生長(zhǎng)，隨著發(fā)酵基質(zhì)中的含水量的增加，菌體細(xì)胞數(shù) 的數(shù)量也在增加。但水分過(guò)高會(huì)降低培養(yǎng)基的通氧，不利于微生物的生長(zhǎng)，在料水比為 1 0.6時(shí)菌體細(xì)胞數(shù)達(dá)最大值為22. 45 X IO8個(gè)/g。因此最佳料水比為1 0.6。2、發(fā)酵溫度的影響在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和以上確定的最佳料水比的基礎(chǔ)上，分別以溫度為24°C、26°C、 28°C、30°C、32°C進(jìn)行單因素試驗(yàn)，從而確定發(fā)酵培養(yǎng)最佳溫度。發(fā)酵溫度的影響結(jié)果分析如圖2-2所示，隨著溫度的增加，菌體細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)。說(shuō)明微 生物需要在適宜的溫度環(huán)境中生長(zhǎng)，隨著溫度的增加，菌體細(xì)胞數(shù)的數(shù)量也在增加。但溫度 過(guò)高反而會(huì)不利于微生物的生長(zhǎng)，在溫度28°C時(shí)菌體細(xì)胞數(shù)達(dá)最大為26. 55 X IO8個(gè)/g。因 此發(fā)酵最適溫度為28°C。3、接種量的影響在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和以上確定的最佳料水比、溫度的基礎(chǔ)上，分別以5 %、10 %、 15%、20%的接種量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，從而確定最佳接種量。接種量的影響結(jié)果分析如圖2-3所示隨著接種量的增大，發(fā)酵產(chǎn)物中菌體細(xì)胞數(shù)逐漸增加后趨于穩(wěn)定。 說(shuō)明適當(dāng)加大接種量有利于縮短培養(yǎng)過(guò)程中的適應(yīng)期，提前進(jìn)入對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期，但接種 量過(guò)大，往往使菌絲生長(zhǎng)過(guò)快，培養(yǎng)基粘度增加，造成溶氧不足而影響產(chǎn)物的合成。接種量 15%時(shí)，產(chǎn)物中菌體細(xì)胞數(shù)最多達(dá)27. 5X IO8個(gè)/g，但當(dāng)接種量大于15%后，發(fā)酵產(chǎn)物中菌 體細(xì)胞數(shù)基本達(dá)到穩(wěn)定。這主要是因?yàn)閯傞_(kāi)始隨著接種量的增加，固態(tài)培養(yǎng)基中微生物數(shù) 量越來(lái)越多，但是當(dāng)微生物數(shù)量增長(zhǎng)到一定數(shù)量后，由于受到培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限制，微 生物生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，因此菌體數(shù)量不再增長(zhǎng)。4、接種比的影響在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和以上確定的最佳料水比、溫度的基礎(chǔ)上，分別以纖維素分解 菌(平菇)產(chǎn)蛋白菌(其中釀酒酵母產(chǎn)朊假絲酵母白地霉=1 1 1)為1 1、 1 2、1 3、2 1、2 3、3 1和3 2進(jìn)行單因素試驗(yàn)，從而確定最佳接種比。
接種比的影響結(jié)果分析如圖2-4所示，按平菇釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母+白地霉(其中釀酒酵母產(chǎn)朊 假絲酵母白地霉=1 1 1)為1 3的接種比進(jìn)行發(fā)酵，菌體細(xì)胞數(shù)最多達(dá)29. 35 X IO8 個(gè)/g。多菌種混合發(fā)酵是在各菌種按合適的比例，才能更好的發(fā)揮菌種之間正協(xié)同效應(yīng)。 在試驗(yàn)中平菇能夠有效地將纖維素降解為酵母能夠利用的單糖類物質(zhì)，使得酵母良好的生 長(zhǎng)繁殖，合成更多的菌體蛋白；但是當(dāng)平菇比例過(guò)高時(shí)，相對(duì)其他三種菌比例降低，從而使 三種菌的適應(yīng)期延長(zhǎng)，加之平菇生長(zhǎng)較慢，影響菌體細(xì)胞數(shù)在短時(shí)間內(nèi)的增加，因此需要一 個(gè)合適的比例，即平菇釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母+白地霉為1 3。5、發(fā)酵時(shí)間的影響在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和以上確定最佳料水比、溫度的基礎(chǔ)上，分別以24h、48h、72h、 96h、120h的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)，從而確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。發(fā)酵時(shí)間的影響結(jié)果分析如圖2-5所示發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)品的菌體細(xì)胞數(shù)逐漸增加，在發(fā) 酵時(shí)間為72h時(shí)，產(chǎn)品菌體細(xì)胞數(shù)最多達(dá)25. 58X IO8個(gè)/g。隨后菌體細(xì)胞數(shù)略呈減少的趨 勢(shì)。這是因?yàn)榘l(fā)酵初期，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)品的菌體細(xì)胞數(shù)逐漸增加，進(jìn)入衰退期，菌 體細(xì)胞數(shù)隨微生物的自溶而逐漸降低，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，還可能造成雜菌污染，影響發(fā)酵產(chǎn)品 的品質(zhì)。因此發(fā)酵時(shí)間確定為72h。6、發(fā)酵工藝條件正交試驗(yàn)在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)接種量，接種比，培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行 三因素三水平的正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵工藝條件。發(fā)酵工藝條件正交試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果分析表2_1L9 (33)發(fā)酵工藝條件因素水平表 表2-2發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)接種量，接種比和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的 正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步確定最佳發(fā)酵工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2-1，正交試驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表2-2。根據(jù)表2-2，以菌體細(xì)胞數(shù)為指標(biāo)，因素A的極差最大，其次是B，最小是C，所以影 響菌體細(xì)胞數(shù)的因素主次順序?yàn)锳 > B > C ；在水平上，最佳組合為A2B2C3即A(接種量) 為10%，B(接種比)為1 2，((發(fā)酵時(shí)間)為961!。為了更加直觀的看出各因素水平間的差異對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響，以各因素水平為 橫坐標(biāo)，各水平菌體細(xì)胞數(shù)的k(平均值)為縱坐標(biāo)作直觀分析圖2-6。根據(jù)圖2-6可知，可以確定理論上的最優(yōu)組合是A2B2C2，這個(gè)組合與9次試驗(yàn)獲得 的最優(yōu)組合A2B2C3并不相同。一個(gè)是實(shí)際的試驗(yàn)結(jié)果，另一個(gè)是從試驗(yàn)信息中推論獲得的 結(jié)果。為確定哪個(gè)更好一些，按照上面所確定的實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果(A2B2C3)和理論推出來(lái)的最 優(yōu)組合(A2B2C2)再進(jìn)行試驗(yàn)比較，得到理論試驗(yàn)結(jié)果(A2B2C2)為29. 78X 108個(gè)/g，理論結(jié) 果比實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果好，所以A2B2C2組合為最佳組合，即接種量10%，接種比為1 2，發(fā)酵時(shí) 間為72h。表2-3發(fā)酵工藝條件正交試驗(yàn)方差分析表
對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析見(jiàn)表2-3，結(jié)果表明在所選中的因素和水平范圍內(nèi)，因素 A的F值極顯著，因素B的F值顯著，因素C的F值不顯著，所以影響菌體細(xì)胞數(shù)的因素主次 順序?yàn)锳 > B > C。因?yàn)檫m當(dāng)加大接種量有利于縮短培養(yǎng)過(guò)程中的適應(yīng)期，提前進(jìn)入對(duì)數(shù) 期和穩(wěn)定期，并可以降低雜菌的污染，所以接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響很大。合適接種比可以 發(fā)揮混合菌種之間的互利，協(xié)同作用，從而使菌體細(xì)胞數(shù)達(dá)到最大值，對(duì)發(fā)酵的效果影響也 很大。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的發(fā)酵時(shí)間影響發(fā)酵效果較小，根據(jù)單因素試驗(yàn)48h的菌體細(xì)胞數(shù)明顯 低于72h、96h和120h，同時(shí)為了縮短發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵時(shí)間選擇72h。


圖1-1不同菌種組合對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響注1.平菇+白地霉、2.平菇+釀酒酵母、3.平菇+產(chǎn)朊假絲酵母、4.平菇+白地 霉+釀酒酵母、5.平菇+白地霉+產(chǎn)朊假絲酵母、6.平菇+釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母、7.平 菇+白地霉+釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母。圖1-2試驗(yàn)因素與水平直觀分析1-3不同硫酸銨添加量對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響圖1-4不同磷酸二氫鉀添加量對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響圖1-5不同硫酸鎂添加量對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響圖1-6試驗(yàn)因素與水平直觀分析2-1不同料水比對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響圖2-2不同發(fā)酵溫度對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響圖2-3不同接種量對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響圖2-4不同接種比對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響圖2-5不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌體細(xì)胞數(shù)的影響圖2-6試驗(yàn)因素與水平直觀分析圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1，為了適應(yīng)工業(yè)化的要求，必須要進(jìn)行大容器的擴(kuò)大發(fā)酵試驗(yàn)。在上述實(shí) 驗(yàn)的最優(yōu)發(fā)酵原料配比和最優(yōu)發(fā)酵工藝條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行擴(kuò)大發(fā)酵試驗(yàn)，一次拌料500g， 裝入一個(gè)瓷盤中，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵72h，發(fā)酵后測(cè)定其菌體細(xì)胞數(shù)，粗蛋白，真蛋 白，酶活性以及氨基酸組成。菌種平菇+白地霉+釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母。
發(fā)酵培養(yǎng)基鮮醋糟250g，酒糟125g，麩皮75g，玉米粉50g，再加入硫酸銨1%，磷 酸二氫鉀0.8%，硫酸鎂0.8%，料水比1 0. 6，接種量10%，接種比平菇釀酒酵母+產(chǎn) 朊假絲酵母+白地霉=1 2 (其中釀酒酵母產(chǎn)朊假絲酵母白地霉=1 1 1)，發(fā)酵 溫度28°C，發(fā)酵時(shí)間為72h。發(fā)酵工藝流程；斜面菌種，液體菌種，發(fā)酵原料混勻，接種(接種量10% )，28°C發(fā) 酵72h，40°C烘干后得到成品，成分分析。結(jié)果與分析發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)物的感官性狀根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，發(fā)酵原料在發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)的感官變化見(jiàn)表3-1表3-1發(fā)酵過(guò)程中培養(yǎng)物的感官性狀 發(fā)酵前后粗蛋白、真蛋白和菌體細(xì)胞數(shù)的測(cè)定如表3-2所示經(jīng)過(guò)多菌種發(fā)酵，原料粗蛋白由發(fā)酵前的27. 38%到發(fā)酵后的 31. 75%，提高了 15.96%。原料真蛋白由發(fā)酵前的19. 08%到發(fā)酵后的24. 50%，提高了 23. 17%，菌體細(xì)胞數(shù)達(dá)到29. 67X 108個(gè)/g。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵營(yíng)養(yǎng)價(jià)值確有所提高。表3-2粗蛋白，真蛋白和菌體細(xì)胞數(shù)的測(cè)定結(jié)果(結(jié)果以樣品含水量為10%計(jì)) 在本試驗(yàn)(擴(kuò)大發(fā)酵試驗(yàn))中，發(fā)酵前重為700g，發(fā)酵后重為670g，原料轉(zhuǎn)化率為 95. 71%。發(fā)酵產(chǎn)品酶活力的測(cè)定蛋白飼料在發(fā)酵過(guò)程中，微生物分泌各種酶類對(duì)飼料中的纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉等 進(jìn)行分解。因此發(fā)酵后，發(fā)酵飼料中會(huì)存在一定的酶類。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3-3，從表中可看出發(fā)酵產(chǎn)品中存在有較多的纖維素酶、糖化酶和蛋白酶。纖維素酶的存在說(shuō)明平菇分解纖維素并為其他菌種提供易利用的單糖類物質(zhì)，使 其得以良好地生長(zhǎng)繁殖，合成更多的菌體蛋白。糖化酶、蛋白酶的存在使得飼料被禽畜采食 后，淀粉類及蛋白類物質(zhì)在動(dòng)物的腸道內(nèi)能得到更快、更好的分解，有利于食物的消化，提 高飼料的利用率。 表3-3酶活力的測(cè)定結(jié)果(結(jié)果以樣品含水量為10%計(jì)) 發(fā)酵產(chǎn)品氨基酸的測(cè)定對(duì)發(fā)酵前后氨基酸含量進(jìn)行比較，可以了解原料發(fā)酵前后氨基酸的組成是如何變 化的，明確營(yíng)養(yǎng)成分是否真有提高，從氨基酸組成上對(duì)發(fā)酵蛋白飼料進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用氨基酸 分析儀對(duì)發(fā)酵前后的氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3-4 表3-4發(fā)酵前后樣品中氨基酸的測(cè)定結(jié)果(結(jié)果以樣品含水量為10%計(jì)) 從表3-4中可以看出所有氨基酸都有所提高，其中賴氨酸，蘇氨酸、絲氨酸、谷氨 酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸等11種氨基酸的提高率超過(guò)了 30%，總氨基酸含量提 高率達(dá)到了 31. 42%。從植物性蛋白的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)看，賴氨酸和蛋氨酸是一般植物性蛋白缺乏 的，發(fā)酵后賴氨酸提高較明顯，而蛋氨酸也略有提高。從一般畜禽生長(zhǎng)所需的必需氨基酸角 度來(lái)看，蘇氨酸，脯氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，賴氨酸，組氨酸這6種氨基酸提高較明顯。
實(shí)施例2，一種多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法，菌種平菇+白地霉+釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母。發(fā)酵培養(yǎng)基鮮醋糟300g，酒糟100g，麩皮50g，玉米粉50g，再加入硫酸銨1. 5%， 磷酸二氫鉀0.6%，硫酸鎂1.0%，料水比1 0.5，接種量15%，接種比平菇釀酒酵母+ 產(chǎn)朊假絲酵母+白地霉=1 3 (其中釀酒酵母產(chǎn)朊假絲酵母白地霉=1 1 1)，發(fā) 酵溫度30°C，發(fā)酵時(shí)間為120h。發(fā)酵工藝流程；斜面菌種，液體菌種，發(fā)酵原料混勻，接種(接種量15% )，30°C發(fā) 酵72h，40°C烘干后得到成品。實(shí)施例3，一種多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法，菌種平菇+白地霉+釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母。發(fā)酵培養(yǎng)基鮮醋糟280g，酒糟120g，麩皮60g，玉米粉40g，再加入硫酸銨0. 5%, 磷酸二氫鉀1.0%，硫酸鎂0.4%，料水比1 0.7，接種量20%，接種比平菇釀酒酵母+ 產(chǎn)朊假絲酵母+白地霉=1 3 (其中釀酒酵母產(chǎn)朊假絲酵母白地霉=1 1 1)，發(fā) 酵溫度30°C，發(fā)酵時(shí)間為120h。發(fā)酵工藝流程；斜面菌種，液體菌種，發(fā)酵原料混勻，接種(接種量20% )，30°C發(fā) 酵72h，40°C烘干后得到成品。
權(quán)利要求
一種多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法，其特征在于使用的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，料水比1∶0.5-0.7，發(fā)酵溫度26-30℃，接菌種量為10-20％，發(fā)酵時(shí)間為48-120h；菌種組合為平菇+白地霉+釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法，其特征在于使用 的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，料水比1 0.6，發(fā)酵溫度28°C，接菌種量為10%，發(fā)酵時(shí)間為72h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法，其特征在于菌種 組合按平菇釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母+白地霉=1 2-3的接種比，其中釀酒酵母產(chǎn) 朊假絲酵母白地霉=1:1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法，其特征在于其中 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基各個(gè)組分的重量比為醋糟50-60%，酒糟20-30%，麩皮10-20%，玉米粉 8-12% ；再添上述組分混合重量計(jì)算的硫酸銨0. 5-1. 5%，磷酸二氫鉀0. 6-1. 0%，硫酸鎂 0. 4-1. 0%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法，其特征在于其中 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基各個(gè)組分的重量比為醋糟50%，酒糟25%，麩皮15%，玉米粉10%再添上 述組分混合重量計(jì)算的硫酸銨1 %，磷酸二氫鉀0.8%，硫酸鎂0.8%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種醋糟深加工技術(shù)，具體為一種多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法。提高了利用微生物發(fā)酵醋糟生產(chǎn)得到的蛋白飼料中氨基酸、維生素、生物活性物質(zhì)、益生素等成分，并且改善發(fā)酵飼料的適口性。一種多菌種固態(tài)發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料方法，使用的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，料水比1∶0.5-0.7，發(fā)酵溫度26-30℃，接菌種量為10-20％，發(fā)酵時(shí)間為48-120h；菌種組合為平菇+白地霉+釀酒酵母+產(chǎn)朊假絲酵母。本發(fā)明通過(guò)微生物發(fā)酵醋糟生產(chǎn)蛋白飼料，使產(chǎn)品不僅含較豐富的氨基酸、維生素、生物活性物質(zhì)、益生素等成分，而且改善發(fā)酵飼料的適口性。
文檔編號(hào)A23K1/06GK101884362SQ20101020248
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月14日
發(fā)明者梁靜波, 郝文杰, 郝林 申請(qǐng)人:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)