專利名稱：：一種棉花育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及作物育種領(lǐng)域，尤其涉及一種棉花育種方法。
背景技術(shù)：
：作物育種的基本過程是創(chuàng)造變異_變異后代的選擇_優(yōu)良基因型的確定_鑒定和繁殖這幾個步驟，就整個過程來講，最基本的是首先要創(chuàng)造變異?；诓煌膭?chuàng)造變異方法，目前的育種方法可以歸納為以下幾種①誘變育種，指利用人工誘變(物理誘變或化學(xué)誘變)的方法獲得生物新品種的育種方法，優(yōu)點能提高變異頻率，變異范圍廣，缺點有利變異少，須大量處理材料；誘變的方向和性質(zhì)不能控制；②雜交育種，指利用具有不同基因組(同種)的生物個體進行雜交，造成基因重組；③單倍體育種，利用花藥離體培養(yǎng)技術(shù)獲得單倍體植株，再誘導(dǎo)其染色體加倍，從而獲得所需要的純系植株的育種方法；④多倍體育種，主要利用秋水仙素處理萌發(fā)的種子或幼苗，造成染色體加倍；⑤細(xì)胞工程育種，是指用細(xì)胞融合的方法獲得雜種細(xì)胞，利用細(xì)胞的全能性，用組織培養(yǎng)的方法培育雜種植株的方法；⑥基因工程育種，將外源基因通過轉(zhuǎn)基因的方法整合到植物基因組的方法。上述的6種方法均有自己的優(yōu)點和缺點。單倍體育種、多倍體育種、細(xì)胞育種和基因工程育種過程中的一個重要步驟是組織培養(yǎng)，就是選擇合適的外植體，比如花藥、幼胚、莖尖等，利用細(xì)胞的全能性，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株。組織培養(yǎng)僅僅是一個方法，其在育種上的應(yīng)用關(guān)鍵是利用什么手段創(chuàng)造的變異外植體，不同方法創(chuàng)造的變異外植體，會有不同的預(yù)期目標(biāo)和結(jié)果。植物嫁接能否用來創(chuàng)造遺傳變異呢？大多的學(xué)術(shù)觀點普遍認(rèn)為植物嫁接的組織(砧木和接穗)保持各自的遺傳完整性，其遺傳物質(zhì)不會混合；嫁接僅僅是一種無性繁殖，主要用來增強植物的抗逆性和適應(yīng)性。通過嫁接可以產(chǎn)生變異也有一些報道，其中有關(guān)嫁接產(chǎn)生嵌合體以及嫁接誘導(dǎo)的遺傳變異報道較多，但是否發(fā)生遺傳物質(zhì)的交換，學(xué)術(shù)上仍存在爭論。但新近已有的對嫁接接合部組織的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)分析表明嫁接植物在砧木和接穗間可以交換各自的遺傳信息(SandraStegemannandRalphBock，ExchangeofGeneticMaterialBetweenCellsinPlantTissueGrafts,Science,2009(324):649)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡便的通過嫁接創(chuàng)造變異的棉花育種方法，其育種效率高，其創(chuàng)造遺傳變異的實質(zhì)與有性雜交等不同，易于實現(xiàn)或達到所期望的育種目標(biāo)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種棉花育種方法，包括如下步驟，(1)培育嫁接苗選取待改良或具改良潛力的棉花品種/系作為接穗或砧木，播種于苗床或營養(yǎng)缽中，育成接穗株或砧木株；選取與前述接穗或砧木有優(yōu)勢互補性的棉花品種/系作為相對應(yīng)的砧木或接穗，播種于苗床或營養(yǎng)缽中，育成砧木株或接穗株；當(dāng)砧木株和接穗株具有12片真葉時，采用靠接法進行嫁接；將嫁接苗置于溫度為2535°C、相對濕度為8595%、避免光照直射的環(huán)境中培養(yǎng)1015天；(2)選取外植體在嫁接1020天以后，選取上述通過靠接后成活的嫁接苗，沿其嫁接結(jié)合部兩端剪開，保留嫁接結(jié)合部及其兩端向外多余一點(35mm，為保留較多的嫁接結(jié)合部作出適當(dāng)?shù)念A(yù)留，避免消毒時損傷到結(jié)合部的組織，在消毒處理后將該多余部分組織切除)的主莖組織(SandraStegemannandRalphBock的研究結(jié)果表明基因轉(zhuǎn)移發(fā)生在嫁接部位，不會長距離發(fā)生)，將接口處的組織沿切口斜面一分為二，分為接穗外植體和砧木外植體；將接穗外植體和砧木外植體進行消毒；利用嫁接接口處的器官作為組織培養(yǎng)的外植體(explant)，進行植物組織培養(yǎng)，由于所選擇的外植體不同，導(dǎo)致其滅菌方法、培養(yǎng)基的配制、配方、操作方法均不同，可根據(jù)實際情況進行選擇、取舍。(3)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)切除接穗外植體和砧木外植體兩端非嫁接結(jié)合部分，剩余部分切成約0.5cm長的切段，分別接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；(4)愈傷組織的增殖、繼代培養(yǎng)將上述誘導(dǎo)的愈傷組織在培養(yǎng)3545天后，挑取淡黃色、疏松、有光澤的愈傷組織轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)；培養(yǎng)2535天后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基；(5)胚狀體萌發(fā)與植株再生經(jīng)過分化，可以分化形成胚性愈傷組織，挑選心形或球形的胚狀體，接入成苗培養(yǎng)基，待萌發(fā)形成再生植株后，轉(zhuǎn)入大的三角瓶中培養(yǎng)，嫁接移栽或煉苗后直接移栽。所述步驟(1)中的嫁接方法為用鋒利的刀片去除砧木株子葉上面的頂芽，保留其主莖上的一個子葉，沿砧木的主莖由上到下劈開11.5cm長的斜面；接著去除接穗株下部根及莖上的子葉，保留1個真葉的生長點及34cm長的主莖，將接穗下端削成一個斜面，刀口深度約11.5cm，然后將接穗和砧木切口的兩個斜面靠在一起，至少保證砧木和接穗一側(cè)的韌皮部密切結(jié)合，用嫁接夾或石蠟封口膜包裹固定嫁接結(jié)合部，1015天后去除嫁接夾或石蠟封口膜，嫁接棉花開始長出新葉，即表明嫁接成活。所述外植體消毒的方法是將外植體先用自來水沖洗后，濾紙吸干，放在70%酒精中浸泡12分鐘，并輕輕搖動，取出后用蒸餾水沖洗35次，接著放在0.01%HgCl2中浸泡45分鐘，并輕輕搖動，取出后用滅菌蒸餾水沖洗58次，使其不殘留HgCl2。所述誘導(dǎo)愈傷、繼代、分化、成苗培養(yǎng)條件為28士2t:，人工光照強度2000Lx，每天光照培養(yǎng)14小時、暗培養(yǎng)10小時。所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS無機鹽+B5維生素+蔗糖30g/L+2，4-Dlmg/L+KT0.2mg/L+Phytagel(植物凝膠)2.5g/L，pH=5.8。所述繼代培養(yǎng)基為MS無機鹽-NH4N03+2XKN03+B5維生素+蔗糖30g/L+2，4_Dlmg/L+KT0.lmg/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8。所述分化培養(yǎng)基為MS無機鹽-NH4N03+2XKN03+B5維生素+ZT0.lmg/L+IBA0.lmg/L+蔗糖30g/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8。所述成苗培養(yǎng)基MS無機鹽-NH4N03+2XKN03+B5維生素+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+谷胺酰氨1.Og/L+天門冬酰氨0.5g/L+Phytagel2.5g/L，pH=6.2)。所述砧木為中棉所24;所述接穗為轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因Bt+CpTI的中棉所41。所述棉花育種方法中還可包括外植體/再生植株變異的驗證、篩選步驟分析在原砧木或接穗所存在的目標(biāo)基因是否出現(xiàn)在相對應(yīng)的接穗或砧木所形成的外植體/再生植株中，分析的方法可以為PCR擴增、分子標(biāo)記、熒光原位雜交中的至少一種，若出現(xiàn)，則為可選的外植體/再生植株材料。所述棉花育種方法中還可以包括再生植株變異的驗證、篩選步驟將再生植株與接穗或砧木相比，觀察比較標(biāo)記性狀是否由砧木或接穗轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的接穗或砧木所形成再生植株上，所述標(biāo)記性狀為花藥的顏色、葉形、葉色、腺體的有無、花基斑的有無、棉籽短纖維的多少及有無中的至少一種；若標(biāo)記性狀不發(fā)生轉(zhuǎn)移，可將再生苗移栽后收獲的種子和砧木或接穗種子繼續(xù)種植，對其后代進行多個性狀的比較分析，來進一步篩選或確定所期望的或符合生產(chǎn)需要的品種/系。本發(fā)明具有積極有益的效果1.利用嫁接來創(chuàng)造遺傳變異是比較簡便的育種方法，不需要大量資金和昂貴精密儀器設(shè)備，可以在溫室條件下周年開展。2.許多親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的屬間植物，含有不同的染色體組，雖不能進行有性雜交，但它們可以相互嫁接在一起，因此，通過嫁接可以獲得通常采用有性雜交無法獲得的遠(yuǎn)緣變異；選取砧木與接穗遠(yuǎn)緣嫁接創(chuàng)造的變異體進行栽培，有可能改良植物的品質(zhì)、產(chǎn)量、抗逆性等，比如棉屬中的二倍體草棉和四倍體的陸地棉通過雜交是很難獲得種子的，但通過嫁接就可能將草棉中的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到陸地棉中。3.植物育種廣泛存在有性雜交不親和現(xiàn)象，往往還會遇到花期不遇、花粉敗育等問題；而通過嫁接可以克服這些障礙，這是遠(yuǎn)緣雜交育種不可比擬的。通過嫁接，促使接合部愈傷組織產(chǎn)生兼具砧木、接穗雙親優(yōu)良性狀的變異類型，在植物育種生產(chǎn)實踐中有更大的應(yīng)用潛力。4.和有性雜交等的遺傳變異不同，棉花嫁接創(chuàng)造的變異有自己的特點，首先砧木和接穗交換細(xì)胞核的遺傳物質(zhì)，主要是大的DNA片段，而非整個基因組信息，其次還可以發(fā)生細(xì)胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)相互交換，這兩點都與植物中常用的雜交育種不同，也與細(xì)胞育種不同；有性雜交是雙親各提供一半的染色體給子代，且子代的細(xì)胞質(zhì)是母性遺傳，這種變異叫基因的垂直轉(zhuǎn)移；不通過有性雜交發(fā)生的基因轉(zhuǎn)移稱為水平基因轉(zhuǎn)移，植物嫁接是水平基因轉(zhuǎn)移的一種方式，這種變異應(yīng)用到育種上，和有性雜交相比有幾個優(yōu)點(l)接穗和砧木的細(xì)胞核基因和細(xì)胞質(zhì)基因均可能發(fā)生交換，導(dǎo)致變異的發(fā)生；(2)就細(xì)胞核基因來講，只發(fā)生大的DNA片段轉(zhuǎn)移，而不像有性雜交那樣親本將一半染色體均轉(zhuǎn)移給子代，在目的片段轉(zhuǎn)移的同時，也有許多累贅基因(不利性狀的基因)也一起發(fā)生了轉(zhuǎn)移；比如棉花的抗黃萎病育種，盡管一些海島棉種質(zhì)中含有抗黃萎病的DNA片段，但是有性雜交后，子代不僅發(fā)生極端的分離，且可能攜帶有晚熟、鈴小、衣分低等不利性狀的基因，而嫁接的遺傳變異就可能解決這個問題，因為嫁接后有可能只發(fā)生抗黃萎病DNA片段的轉(zhuǎn)移，這樣就可能通過篩選獲得只改良作物的某一劣勢性狀而保留其它優(yōu)良性狀的變異體，此外嫁接的遺傳變異手段還可以克服植物遠(yuǎn)緣雜交引起的不育等問題。5.本發(fā)明提供一種新的棉花轉(zhuǎn)基因手段，可以將目的基因(比如本發(fā)明實施例中所提到的抗蟲基因)轉(zhuǎn)移到所需改良的品種中；利用嫁接來創(chuàng)造遺傳變異可作為常規(guī)育種和現(xiàn)代基因工程育種的一種輔助手段，是一條不容忽視的具有廣闊前景的育種途徑。具體實施例方式實施例1一種棉花育種方法，包括如下步驟(1)培育嫁接苗①育砧木株選取具有改良潛力的非轉(zhuǎn)基因棉花中棉所24作為砧木，播種于苗床或營養(yǎng)缽中，育成砧木株；②育接穗株選取轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因Bt+CpTI的棉花品種中棉所41作為接穗，播種于苗床或營養(yǎng)缽中，育成接穗株；③嫁接當(dāng)砧木株和接穗株具有12片真葉時，以靠接法嫁接用鋒利的刀片去除砧木株子葉上面的頂芽，保留其主莖上的一個子葉，沿砧木的主莖由上到下劈開約1.5cm長的斜面；接著去除接穗株下部根及莖上的子葉，保留l個真葉的生長點及34cm長的主莖，將接穗下端削成一個斜面，刀口深度約11.5cm，然后將接穗和砧木切口的兩個斜面靠在一起，至少保證砧木和接穗一側(cè)的韌皮部密切結(jié)合，用嫁接夾或石蠟封口膜包裹固定嫁接結(jié)合部，將嫁接苗置于溫度為3(TC、相對濕度為90%、避免光照直射的環(huán)境中培養(yǎng)，12天后去除嫁接夾或石蠟封口膜，嫁接棉花開始長出新葉，即表明嫁接成活。(2)選取外植體在嫁接15天后，選取上述通過靠接后成活的嫁接苗，將其剪斷，保留接口處及接口兩端向外多余一點的那段主莖組織(在消毒后以便將接口兩端的非結(jié)合部組織切除，盡可能的保留較長的嫁接結(jié)合部組織)，將接口處的組織沿切口斜面一分為二，分為接穗外植體和砧木外植體；將接穗外植體和砧木外植體進行消毒先用自來水沖洗外植體，再以濾紙吸干，放在70%酒精中浸泡1.5分鐘，并輕輕搖動，取出后用蒸餾水沖洗35次，接著放在0.01%HgCl2中浸泡45分鐘，并輕輕搖動，取出后用滅菌蒸餾水沖洗58次，無HgCl2殘留。(3)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)切除接穗外植體和砧木外植體兩端非嫁接接口部分，剩余部分切成約0.5cm長的切段，分別平接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；將接穗外植體和砧木外植體接入不同的培養(yǎng)皿中，并置于28士2t:，人工光照強度2000Lx，每天光照培養(yǎng)14小時、黑暗培養(yǎng)10小時的條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基構(gòu)成為:MS無機鹽+B5維生素+蔗糖30g/L+2，4-Dlmg/L+KT0.2mg/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8。(4)愈傷組織的增殖、繼代、分化培養(yǎng)進行上述誘導(dǎo)培養(yǎng)40天后，挑取淡黃色、疏松、有光澤的愈傷組織轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28士2t:，光照強度2000Lx，每天光照培養(yǎng)14小時、暗培養(yǎng)10小時的條件下進行培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)基的配方為MS無機鹽-NH4N03+2XKN03+Bs維生素+蔗糖30g/L+2，4-Dlmg/L+KT0.lmg/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8)，培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)入新鮮繼代培養(yǎng)基中，如此繼代培養(yǎng)23次后挑選長勢良好的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(MS無機鹽-NH4N03+2XKN03+B5維生素+ZT0.lmg/L+IBA0.lmg/L蔗糖30g/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8)中分化培養(yǎng)，每兩周更換一次培養(yǎng)基。(5)胚狀體萌發(fā)與植株再生從分化形成的胚性愈傷組織中挑選心形、球形等的胚狀體，轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基，待萌發(fā)形成再生植株后，轉(zhuǎn)入大的三角瓶中培養(yǎng)，適時嫁接或待根長好后移栽。成苗培養(yǎng)基的配方MS無機鹽-NH4N03+2XKN03+B5維生素+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+谷胺酰氨1.0g/L+天門冬酰氨0.5g/L+Phytagel2.5g/L，pH=6.2)。上述各種培養(yǎng)基所用到的母液成分構(gòu)成及配制方法如下①MS大量元素母液(10X)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>②MS微量元素母液(100X)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>③MS鐵鹽母液(100X)稱10升量溶解在100ml蒸餾水中。配1升取培養(yǎng)基母液10ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注意配制時，兩種成分分別溶解在少量蒸餾水中，其中EDTA較難完全溶解，可適當(dāng)加熱?；旌蠒r，先取一種置容量瓶(燒杯)中，然后將另一種成分逐加逐劇烈震蕩，至產(chǎn)生深黃色溶液，最后定容，保存在棕色試劑瓶中。④Bs維生素母液(100X)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(6)遺傳變異的驗證及選擇所選砧木中棉所24為非轉(zhuǎn)基因棉花，接穗為轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因Bt+CpTI的棉花品種中棉所41，如果抗蟲基因發(fā)生轉(zhuǎn)移，則通過對砧木接口處的外植體進行組織培養(yǎng)而獲得的再生苗中可檢測到該抗蟲基因。下面用PCR方法來檢測用砧木接口處組織作外植體，獲得的再生苗是否含有雙價抗蟲基因Bt+CpTI:①DNA的提取田間選取10克左右棉花植株的嫩葉(葉齡小于一周)混合，用液氮充分研磨至細(xì)粉狀，裝入50ml離心管中，加入100200illP-巰基乙醇，按5ml/g樣的比例加入65。C左右的DNA裂解緩沖液(2%CTAB，2%PVP，O.1%DIECA，1.4MNaCl，O.02MNa2EDTA(pH8.0)，0.1MTris-HCl)，并迅速攪拌混勻，65。C水浴30min，間隔10min左右搖動一次，取出后加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，輕輕地混勻，3800r/min離心15min，取上清液至干凈離心管，重新加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，混勻之后，3800r/min離心15min，將上清轉(zhuǎn)到干凈離心管中，加入2/3倍體積冰凍過的異丙醇，輕輕地上下顛倒直至絮狀DNA沉淀產(chǎn)生，_201:冰箱內(nèi)放置半個小時以上，然后挑出DNA至干凈的離心管，用76%乙醇浸泡，特別是第一次換乙醇應(yīng)在半小時以內(nèi)，中間注意換乙醇23次，然后倒去乙醇風(fēng)干，最后加一定體積的TE溶解。用DNA紫外分光光度計測濃度，并將其稀釋到10ng/ii1的濃度。②雙價抗蟲基因Bt+CpTI的特異引物序列為5'-AGATGTCCATCAAGTGTGG—3'5'-TACAATAACAATGGACTGC-3'PCR的反應(yīng)體系為20iil的PCR反應(yīng)體系含2XPCR緩沖液，15mmol/LMgCl2，200iimol/L的dNTPs，每個引物濃度為0.5iimol/L，0.5U的Taq酶和100ngDNA模板，不足部分由H^補足并上覆25iU左右的礦物油。PCR反應(yīng)程序如下95。C變性3min，1個循環(huán)；94。C變性lmin，58。C退火lmin，72°C延伸1.5min，35個循環(huán)；72°C5min;4。C保存。擴增產(chǎn)物由1%的瓊脂糖水平電泳系統(tǒng)檢測。以砧木的接口組織作為外植體，通過組織培養(yǎng)的方法共獲得36株再生苗，通過PCR檢測，發(fā)現(xiàn)有3株棉花含有接穗的雙價抗蟲基因Bt+CpTI，說明該基因發(fā)生了轉(zhuǎn)移。對于所獲得的36株再生苗，僅以棉花的雙價抗蟲基因為目的基因，來驗證是否發(fā)生了轉(zhuǎn)移來證明通過嫁接發(fā)生的水平基因轉(zhuǎn)移能否應(yīng)用到植物育種上，但是，對于其它再生苗，是否也發(fā)生了其它基因的水平轉(zhuǎn)移，可通過分子標(biāo)記、熒光原位雜交等技術(shù)來進行相應(yīng)驗證篩選工作。而對于育種工作者來講，只要將其收獲的種子和砧木或接穗種子繼續(xù)種植，后代進行多個性狀的比較分析，就可確定哪些性狀的基因發(fā)生了轉(zhuǎn)移。此外，利用本發(fā)明方法的思路，也可以應(yīng)用到其它植物的遺傳育種研究當(dāng)中，還可以創(chuàng)造一些新的遺傳材料，比如棉花染色體片段置換系、異染色體片段系等的構(gòu)建，用來進行基因定位、分子設(shè)計育種等的研究。9權(quán)利要求一種棉花育種方法，包括如下步驟(1)培育嫁接苗選取待改良或具改良潛力的棉花品種/系作為接穗或砧木，播種于苗床或營養(yǎng)缽中，育成接穗株或砧木株；選取與前述接穗或砧木有互補性狀的棉花品種/系作為相對應(yīng)的砧木或接穗，播種于苗床或營養(yǎng)缽中，育成砧木株或接穗株；當(dāng)砧木株和接穗株具有1～2片真葉時，采用靠接法進行嫁接；將嫁接苗置于溫度為25～35℃、相對濕度為85～95％、避免光照直射的環(huán)境中培養(yǎng)10～15天；(2)外植體的選取在嫁接10～20天以后，選取上述通過靠接成活的嫁接苗，沿其嫁接結(jié)合部兩端剪斷，保留嫁接結(jié)合部及其兩端向外多余一點的主莖組織，將接口處的組織沿切口斜面一分為二，分為接穗外植體和砧木外植體；將接穗外植體和砧木外植體進行消毒；(3)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)切除接穗外植體和砧木外植體兩端非嫁接接口部分，剩余部分切成約0.5cm長的橫切段，分別接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)；(4)愈傷組織的增殖、繼代培養(yǎng)上述誘導(dǎo)培養(yǎng)35～45天后，挑取淡黃色、疏松、有光澤的愈傷組織轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)；培養(yǎng)25～35天后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基；(5)胚狀體萌發(fā)與植株再生經(jīng)過繼代培養(yǎng)基的分化，可以分化形成胚性愈傷組織，挑選心形或球形的胚狀體，接入成苗培養(yǎng)基，獲得再生植株后，轉(zhuǎn)入大的三角瓶中，進行煉苗后的嫁接移栽或直接移栽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花育種方法，其特征在于，所述步驟(1)中的嫁接方法為用鋒利的刀片去除砧木株子葉上面的頂芽，保留其主莖上的一個子葉，沿砧木的主莖由上到下劈開11.5cm長的斜面；接著去除接穗株下部根及莖上的子葉，保留1個真葉的生長點及34cm長的主莖，將接穗下端削成一個斜面，刀口深度約11.5cm，然后將接穗和砧木切口的兩個斜面靠在一起，至少保證砧木和接穗一側(cè)的韌皮部密切結(jié)合，用嫁接夾或石蠟封口膜包裹固定嫁接結(jié)合部，1015天后去除嫁接夾或石蠟封口膜，嫁接棉花開始長出新葉，即表明嫁接成活。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的棉花育種方法，其特征在于，所述外植體消毒的方法是將外植體先用自來水沖洗后，濾紙吸干，放在70%酒精中浸泡12分鐘，并輕輕搖動，取出后用蒸餾水沖洗35次，接著放在0.01%HgCl2中浸泡45分鐘，并輕輕搖動，取出后用滅菌蒸餾水沖洗58次，使其不殘留HgCl2。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的棉花育種方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)愈傷、繼代、分化、成苗培養(yǎng)條件均為28士2t:，人工光照強度2000Lx，每天光照培養(yǎng)14小時、黑暗培養(yǎng)10小時。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的棉花育種方法，其特征在于，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS無機鹽+B5維生素+蔗糖30g/L+2，4-Dlmg/L+KT0.2mg/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的棉花育種方法，其特征在于，所述繼代培養(yǎng)基為MS無機鹽-NH4N03+2XKN03+Bs維生素+蔗糖30g/L+2，4-Dlmg/L+KT0.lmg/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的棉花育種方法，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基為MS無機鹽-NH4N03+2XKN03+B5維生素+ZT0.lmg/L+IBA0.lmg/L+蔗糖30g/L+Phytagel2.5g/L，pH=5.8;所述成苗培養(yǎng)基為MS無機鹽-NH4N03+2XKN03+B5維生素+NAA0.01mg/L+蔗糖30g/L+谷胺酰氨1.0g/L+天門冬酰氨0.5g/L+Phytagel2.5g/L，pH=6.2。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的棉花育種方法，其特征在于，所述砧木為中棉所24;所述接穗為轉(zhuǎn)雙價抗蟲基因Bt+CpTI的中棉所41。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的棉花育種方法，其特征在于，還包括外植體/再生植株變異的驗證、篩選步驟分析在原砧木或接穗所存在的目標(biāo)基因是否出現(xiàn)在相對應(yīng)的接穗或砧木所形成的外植體/再生植株中，分析的方法可以為PCR擴增、分子標(biāo)記、熒光原位雜交中的至少一種，若出現(xiàn)，則為可選的外植體/再生植株材料。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花育種方法，其特征在于，還包括再生植株變異的驗證、篩選步驟將再生植株與接穗和砧木相比，觀察比較標(biāo)記性狀是否由砧木或接穗轉(zhuǎn)移至對應(yīng)的接穗或砧木所形成再生植株上，所述標(biāo)記性狀為花藥的顏色、葉形、葉色、腺體的有無、花基斑的有無、棉籽短纖維的多少及有無中的至少一種；若標(biāo)記性狀不發(fā)生轉(zhuǎn)移，可將再生苗移栽后收獲的種子和砧木或接穗種子繼續(xù)種植，對其后代進行多個性狀的比較分析，進一步篩選、確定所期望的或符合生產(chǎn)需要的品種/系。全文摘要本發(fā)明涉及一種棉花育種方法。該方法是利用棉花嫁接產(chǎn)生的遺傳變異結(jié)合部為外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)出愈傷組織，經(jīng)愈傷組織的增殖、繼代培養(yǎng)，進而分化培養(yǎng)成棉苗，再進行煉苗后的嫁接移栽或直接移栽的育種方法。本發(fā)明利用嫁接創(chuàng)造遺傳變異，既有可能改良植物的品質(zhì)、產(chǎn)量、抗逆性等，還可以獲得通常采用有性雜交無法獲得的遠(yuǎn)緣變異，操作簡便、選育效率高且成本低；本發(fā)明提供一種新的棉花轉(zhuǎn)基因手段，可以將目的基因轉(zhuǎn)移到所需改良的品種中產(chǎn)生兼具砧木、接穗雙親優(yōu)良性狀的變異類型；利用嫁接來創(chuàng)造遺傳變異可作為常規(guī)育種和現(xiàn)代基因工程育種的一種輔助手段，是一條不容忽視的具有廣闊前景的育種途徑。文檔編號A01G1/00GK101707963SQ20091022771公開日2010年5月19日申請日期2009年12月30日優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日發(fā)明者郝俊杰申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院