專(zhuān)利名稱(chēng)：：來(lái)自海洋的鏈霉菌的分離培養(yǎng)方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種菌種的培養(yǎng)方法，特別是一種來(lái)自海洋的鏈霉菌BM-2的分離培養(yǎng)方法；本發(fā)明還涉及鏈霉菌BM-2的用途。
背景技術(shù)：
：許多放線菌的次生代謝產(chǎn)物具有醫(yī)藥和植物保護(hù)方面的用途，已廣泛用作抗細(xì)菌、抗真菌和抗腫瘤藥物，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的數(shù)萬(wàn)種微生物來(lái)源的生物活性物質(zhì)中，約有70%是由放線菌所合成的。目前分離得到的絕大多數(shù)放線菌都來(lái)源于土壤，陸生放線菌產(chǎn)生的抗生素占天然來(lái)源抗生素的三分之二以上，然而隨著病原微生物對(duì)抗生素抗性的日益提高，尋找具有新型作用機(jī)制的抗生素已迫在眉睫。近20年來(lái)，從陸生放線菌中分離得到的先導(dǎo)化合物的數(shù)量銳減，于是人們把目光投向了更為廣闊的生境-海洋。海洋放線菌的生活環(huán)境十分特殊，如高鹽度，高壓，低營(yíng)養(yǎng)，低溫及與不同生物之間的關(guān)系等。在這些所謂生命的極限環(huán)境中，海洋放線菌已發(fā)展出獨(dú)特的代謝方式，這不僅確保其在極端環(huán)境中生存，也提供了產(chǎn)生新穎抗生素的潛力。因此，海洋環(huán)境將成為放線菌和放線菌代謝產(chǎn)物的重要新來(lái)源。雖然海洋放線菌不是海洋微生物生態(tài)系統(tǒng)中的主要組成部分，但越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示，其代謝產(chǎn)物具有獨(dú)特性。來(lái)自國(guó)際著名的海洋天然產(chǎn)物研究機(jī)構(gòu)加州大學(xué)的W.Fenical教授于2001年6月在日本舉行的第10次國(guó)際海洋天4然產(chǎn)物研討會(huì)上報(bào)道了他們的最新發(fā)現(xiàn):他們首次發(fā)現(xiàn)并成功培養(yǎng)了一屬海洋放線菌，命名為Mw/mw/om.，這種菌只能在有鹽的條件下生長(zhǎng)，具有獨(dú)特的16SrRNA序列。對(duì)100株這種菌進(jìn)行了抗菌及抗腫瘤活性篩選試驗(yàn)，結(jié)果有80%的發(fā)酵液抽提物顯示出明顯的抗菌和抗腫瘤活性。對(duì)其中一株菌發(fā)酵液進(jìn)行化學(xué)研究，從中分離純化出一系列結(jié)構(gòu)新穎的化合物，命名為Salinosporamides，這些化合物具有很強(qiáng)的抗癌活性。許多放線菌的次生代謝產(chǎn)物具有醫(yī)藥和植物保護(hù)方面的用途，己廣泛用作抗細(xì)菌、抗真菌和抗腫瘤藥物。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前關(guān)于海洋放線菌活性物質(zhì)的研究已經(jīng)引起人們的重視，從海洋環(huán)境中分離得到了多種產(chǎn)生新活性物質(zhì)的海洋放線菌，并對(duì)得到的菌株的發(fā)酵條件、生物活性以及活性物質(zhì)的.分離鑒定進(jìn)行了研究，取得了可喜的成果，但己有的研究主要集中在醫(yī)藥的開(kāi)發(fā)上，而海洋放線菌對(duì)植物病原真菌的抗菌物質(zhì)研究還剛剛起步，從海洋環(huán)境中尋找具有新的抗菌機(jī)制的海洋放線菌應(yīng)用于植物病害的生物防治對(duì)于開(kāi)發(fā)高效環(huán)保新型農(nóng)藥具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對(duì)多種植物病原真菌有強(qiáng)抗菌作用的鏈霉菌BM-2(&印tomK"sp.BM-2)的分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種來(lái)自海洋的鏈霉菌BM-2(&reptomyc"sp.BM-2)的分離培養(yǎng)方法，其特點(diǎn)是，其步驟如下(1)富集培養(yǎng)從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有50mL的無(wú)菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養(yǎng)液中，190r/min，25。C條件下?lián)u床培養(yǎng)5天；(2)菌體的分離純化用移液槍取富集培養(yǎng)5天的培養(yǎng)液1.0mL加入到盛有9.0mL無(wú)菌海水的試管中，制備成10—i的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋?zhuān)謩e制備成10—2、10-3、10-4、10-5、l(T、10—7的樣品稀釋液；然后分別取10—5、10—6和10—7的樣品稀釋液0.2ml放到海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25'C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落；再分別挑取海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板上的菌落，用三區(qū)劃線的方法接種到海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板上，置于25i:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復(fù)劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個(gè)純化的菌株分別轉(zhuǎn)接到海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基試管斜面中保存；(3)菌株的篩選采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，以供試的植物病原真菌小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌為受試菌，分別測(cè)定分離純化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作時(shí)在PDA培養(yǎng)基平板中央接種培養(yǎng)5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培養(yǎng)皿壁15mm處對(duì)稱(chēng)劃線接種分離純化得到的不同菌株，25"C倒置恒溫培養(yǎng)，觀察植物病原真菌菌落生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)5d后測(cè)量抑菌帶寬度；每個(gè)菌株為一處理，每處理重復(fù)3次；選取一株對(duì)前述2種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于15mm的菌株，記為BM-2菌株；(4)菌株的鑒定將BM-2菌株于25"C下培養(yǎng)5天，觀察記錄菌落和細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，并進(jìn)行16SrDNA測(cè)序分析；根據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果初步認(rèn)為菌株BM-2屬于鏈霉菌屬；16SrDNA的同源性分析表明，BM-2菌株最接近于5^e/tom_yc"sp.，二者的16SrDNA序列相似性為99%，BM-2菌株為鏈霉菌(5^印tomyce!rsp.)。以上所述的來(lái)自海洋的鏈霉菌BM-2sp.BM-2)的分離培養(yǎng)方法技術(shù)方案中，所述的鏈霉菌BM-2菌株的優(yōu)化發(fā)酵條件為最適培養(yǎng)基為淀粉14g、乳糖16g、黃豆粉16g、磷酸氫二鉀3g、碳酸鈣4g、氯化鉀0.4g、氯化鈉30g，水1000ml，pH為7.5;發(fā)酵條件為接種量7%，裝瓶量250ml三角瓶80ml/瓶，搖床轉(zhuǎn)速190r/min，最適溫度28""C，培養(yǎng)時(shí)間5d。本發(fā)明中所涉及的生物材料"鏈霉菌BM-2(6^印to附y(tǒng)c"sp.BM-2)"菌株己于2009年2月4日在Genebank公開(kāi)(登錄號(hào)為FJ595715，網(wǎng)址為(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi7db二nuccore&id=222145980)。該菌株為公知公用材料，在該專(zhuān)利申請(qǐng)日期起二十年內(nèi)，公眾如果需要，淮海工學(xué)院海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室可對(duì)外提供。本發(fā)明所述的鏈霉菌BM-2(5Vreptom_yc"sp.BM-2)具備抑制多種植物病原真菌的用途。以下是發(fā)明人所做的鏈霉菌BM-2(&reptom少c"sp.BM-2)菌株(以下簡(jiǎn)稱(chēng)BM-2菌株)的相關(guān)試驗(yàn)。1、分離篩選試驗(yàn)。1.1培養(yǎng)基(1)富集培養(yǎng)基酵母膏5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaC15g、陳海水1000mL，pH7.5-8.0。(2)海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉20g，KN03lg，氯化鈉0.5g，磷酸氫二鉀0.5g，MgS04*7H200.5g，F(xiàn)eS04'H20O.Olg，瓊脂20g，海水1000mL，pH7.27,4。(3)PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g,水1000mL，pH自然。1.2供試病原菌玉米小斑病菌(丑—/鎖.a附ay血)、玉米圓斑病菌(//e/脂'w^7aspor/wmcar6owM附)、小麥赤霉病菌(F"S(3r/wmgra附/"earww)、棉花豐古萎病菌(Fwjan.wwo平/or簡(jiǎn)f.sp.vasinfectum)、小麥雪腐鐮刀病菌(Fwsa"'簡(jiǎn)m.va/e)、斑點(diǎn)落葉病菌(茲m7fl〃'aa/femato)、小麥根腐病菌(5—/腦i5WY^:/m'""a)、細(xì)鏈格孢病菌"/ter""n'flfe"w&)、番茄早疫病菌(J/ter"an'aso/a"/)共9禾中，由中國(guó)農(nóng)科院所植保所提供，淮海工學(xué)院海洋微生物實(shí)驗(yàn)室保存。1.3分離方法(1)富集培養(yǎng)從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有50mL的無(wú)菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養(yǎng)液中，190r/min，25"C條件下?lián)u床培養(yǎng)5天；(2)菌體的分離純化用移液槍取富集培養(yǎng)5天的培養(yǎng)液1.0mL加入到盛有9.0mL無(wú)菌海水的試管中，制備成10—'的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋?zhuān)謩e制備成10—2、10—3、10"、10,10,10—7的樣品稀釋液；然后分別取10—5、1(T和l(T7的樣品稀釋液0.2ml放到海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25。C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落；再分別挑取海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板上的菌落，用三區(qū)劃線的方法接種到海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板上，置于25'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復(fù)劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個(gè)純化的菌株分別轉(zhuǎn)接到海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基試管斜面中保存；(3)菌株的篩選采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，以供試的上述9種植物病原真菌(包括小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌)為受試菌，分別測(cè)定分離純化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作時(shí)在PDA培養(yǎng)基平板中央接種培養(yǎng)5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培養(yǎng)皿壁15mm處對(duì)稱(chēng)劃線接種分離純化得到的不同菌株，25。C倒置恒溫培養(yǎng)，觀察植物病原真菌菌落生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)5d后測(cè)量抑菌帶寬度；每個(gè)菌株為一處理，每處理重復(fù)3次；選取一株對(duì)前述小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌的抑菌帶寬度平均值大于15mm的菌株，記為BM-2菌株。篩選試驗(yàn)的具體結(jié)果如下上述步驟(2)分離純化得到的若干個(gè)菌株中有7株對(duì)上述9種植物病原真菌有較強(qiáng)的抑制作用，見(jiàn)表l。其中BM-2菌株的抑菌作用最強(qiáng)，其對(duì)多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)棉花枯萎病菌和小麥赤霉病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度分別達(dá)到了18.0mm和16.5mm，對(duì)番茄早疫病菌、玉米小斑病菌、玉米圓斑病菌的抑菌帶寬度都達(dá)到了10mm以上。表17菌林對(duì)9種病原真菌的抑制作用(ran)供試病原菌BM-2T-6XS-X5-3菌抹號(hào)D-3T-l-lMH-7XL-7小麥赤霉病菌16.50.08.07.00.00.07.5小麥根腐病菌5.53.03.54.02.03.02.0玉米圓斑病菌10.03.05.07.00.00.01.0番茄早疫病菌11.53.07.04.51.53.04.0棉花枯萎病菌18.00.00.011.50.05.06.0斑點(diǎn)落葉病菌9.54.54.04.00.02.03.5小麥雪腐鐮刀病菌9.00.00.06.00.04.00.0玉米小斑病菌10.59.01.55.50.03.56.092、BM-2菌株的鑒定試驗(yàn)。2.1培養(yǎng)基鑒定試驗(yàn)中所涉及的高氏1號(hào)培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖天門(mén)冬素瓊脂培養(yǎng)基、瓦氏肉汁瓊脂培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基、尿素培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基、糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基、石蕊牛奶培養(yǎng)基和苯丙氨酸培養(yǎng)基均為常規(guī)培養(yǎng)基，但在配制時(shí)用相應(yīng)量的海水替換水。2.2形態(tài)特征及培養(yǎng)特征觀察2.2.1形態(tài)特征觀察采用扦片法。在高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線接種BM-2菌株，將滅菌的蓋玻片以大約45。角扦入瓊脂內(nèi)(扦在接種線上)，將扦片平板28"C下倒置培養(yǎng)，根據(jù)觀察的目的，分別在培養(yǎng)3d、5d、7d時(shí)，用鑷子小心拔出蓋玻片，擦去背面培養(yǎng)物，將有菌的一面朝上放在載玻片上，直接鏡檢蓋玻片上BM-2菌株的形態(tài)特征。取扦片及印片經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察，結(jié)果顯示該菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲均生長(zhǎng)旺盛，分枝多；孢子絲為直線形和波曲形，無(wú)輪生。孢子絲成熟后形成的孢子鏈成串珠狀。2.2.2培養(yǎng)特征觀察主要觀察孢子、氣生菌絲體、基內(nèi)菌絲體的顏色和可溶性色素的有無(wú)。將BM-2菌株分別接種在高氏I號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖天門(mén)冬素瓊脂培養(yǎng)基、瓦氏10肉汁瓊脂培養(yǎng)基上，28。C培養(yǎng)715d，觀察記錄菌株在各種培養(yǎng)基上孢子、氣生菌絲、基內(nèi)菌絲體的顏色以及可溶性色素是否產(chǎn)生等特征。結(jié)果菌株BM-2在高氏I號(hào)、瓦氏肉汁、葡萄糖天門(mén)冬素、無(wú)機(jī)鹽淀粉等瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在馬鈴薯培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較差。在不同的培養(yǎng)基上氣生菌絲的顏色變化不大，基內(nèi)菌絲顏色變化較大，無(wú)可溶性色素產(chǎn)生。結(jié)果見(jiàn)表2。表2BM-2菌株的培養(yǎng)特征<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>"++++":生長(zhǎng)良好；"+++":生長(zhǎng)一般；"+":生長(zhǎng)差。2.3生理生化試驗(yàn)生理生化試驗(yàn)包括明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、纖維素分解試驗(yàn)、油脂水解試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試驗(yàn)、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)和葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗(yàn)等多項(xiàng)試驗(yàn)。生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。__表3BM-2菌林的生理生化特性_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>糖醇發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，綜合見(jiàn)表4。糖醇發(fā)酵試驗(yàn)中產(chǎn)酸呈陽(yáng)性的說(shuō)明待測(cè)菌能分解該糖或醇產(chǎn)生酸因而使指示劑溴甲酚紫顯現(xiàn)出黃色，糖醇發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)酸呈陰性的說(shuō)明待測(cè)菌不能分解該糖醇產(chǎn)生酸因而不使指示劑顯現(xiàn)黃色；糖醇發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)氣呈陽(yáng)性說(shuō)明待測(cè)菌能分解該糖或醇產(chǎn)生氣體。表4BM-2菌株糖醇發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>麥芽糖+-乳糖++蔗糖++甘露糖++D-果糖+-棉子糖_-D-木糖+_L-鼠李糖+-纖維二糖+-甘露醇+-肌醇-+D-山梨醇+-根據(jù)形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，査閱《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》，BM-2菌株符合鏈霉菌科鏈霉菌屬的特征。2.4BM-2菌株16SrDNA基因的序列分析2.4.1BM-2菌株液體培養(yǎng)BM-2菌株經(jīng)斜面活化后，將孢子用無(wú)菌水洗下制成孢子懸液，濃度約為1(^個(gè)/mL，接種于液體海水高氏1號(hào)培養(yǎng)基(250mL三角瓶裝液量30mL)，28°C180卬m搖床培養(yǎng)3d。2.4.2DNA的提取采用CTAB裂解法。2.4.3PCR擴(kuò)增擴(kuò)增引物序列為fDl:16SF:5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'rDl:16SR:5'-ACGGTTACCTTACCTTGTTACGACTT-3'由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。按表5反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增表5PCR擴(kuò)增體系(25fU體系)試劑含量(P1)dNTP(10mMeach)0.510xbuffer2.5Mg2+(20mM)2.5引物1(25jiM)0.5引物2(25jiM)0.5模板DNA1.0Taq酶(5U/y1)0.3ddH2017.2擴(kuò)增條件為95"C預(yù)變性5min;94。C變性lmin，65。C退火lmin，72。C延伸3min，3個(gè)循環(huán)；94。C變性lmin，63。C退火lmin，72。C延伸3min，3個(gè)循環(huán)；94。C變性lmin，61。C退火lmin，72"延伸3min，3個(gè)循環(huán);94。C變性lmin，59。C退火lmin，72"C延伸3min，3個(gè)循環(huán)；94。C變性lmin，57。C退火lmin，72。C延伸3min，3個(gè)循環(huán)；94。C變性lmin，55。C退火lmin，72。C延伸3min，3個(gè)循環(huán)；94。C變性lmin，54。C退火lmin，72。C延伸3min，20個(gè)循環(huán)；72'C再次延伸10min;4'C永久保存。2.4.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及其序列測(cè)定采用LO^瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。點(diǎn)樣量為5)al。將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得序列已于2009年2月4日在Genebank公開(kāi)(登錄號(hào)為FJ595715)。在GenBank中對(duì)所得序列進(jìn)行BLAST分析，BM-2菌株的16SrDNA基因序列與5^印tomyc"sp.(FJ001761)同源性達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化測(cè)定結(jié)果，認(rèn)為BM-2菌株屬于鏈霉菌(S^e/tom_ycassp.)3、BM-2菌株抑菌試驗(yàn)。3.1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用(1)無(wú)菌發(fā)酵液的制備。將BM-2菌株接種到海水高氏1號(hào)培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)4d，用5mL無(wú)菌海水沖洗下菌體，接種到裝有50mL液體海水高氏1號(hào)培養(yǎng)基的250mL三角瓶?jī)?nèi)，25°C，190r/min振蕩培養(yǎng)5d，培養(yǎng)液于4。C，5000r/min離心10min，去除菌體，上清液用直徑0.22fim的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾，得到無(wú)菌發(fā)酵液。(2)無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)9種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用測(cè)定。在PDA培養(yǎng)基平板中央接種直徑為5mm的受試植物病原真菌菌苔，距皿邊緣15mm處，對(duì)稱(chēng)打直徑為5mm的孔，三個(gè)孔內(nèi)滴200^UBM-2菌株的無(wú)菌發(fā)酵液，另一孔作為對(duì)照，內(nèi)滴等量的液體海水高氏1號(hào)培養(yǎng)基，25"C恒溫培養(yǎng)5d后，觀察受試植物病原真菌的菌落生長(zhǎng)狀況，測(cè)量抑菌帶寬度。重復(fù)3次。BM-2菌株的發(fā)酵液的抑菌范圍廣，抗菌作用強(qiáng)，對(duì)所有供試病原真菌都具有較強(qiáng)的抑制作用，其中對(duì)小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌的抑菌帶寬度分別達(dá)到了25.1mm和20mm，表現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。表6BM-2菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原真菌的抑制作用供試病原菌抑菌帶寬度(mm)小麥赤霉病菌25.1小麥根腐病菌6.5玉米圓斑病菌14.0番茄早疫病菌11.5棉花枯萎病菌20.0斑點(diǎn)落葉病菌10.5雪腐鐮刀病菌10.0玉米小斑病菌12.5細(xì)鏈格孢菌10.53.2無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)細(xì)鏈格孢菌分生孢子萌發(fā)的影響(1)細(xì)鏈格孢菌分生孢子懸浮液的制備。將培養(yǎng)7d的細(xì)鏈格孢菌用無(wú)菌水洗下孢子，用4層紗布過(guò)濾去除菌絲，濾液在室溫下3500r/min離心5min，沉淀為孢子，用BM-2菌株的無(wú)菌發(fā)酵液配制成濃度為1()S個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液，以液體海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基為對(duì)照。(2)孢子萌發(fā)率的測(cè)定。取0.1ml孢子懸浮液涂布在無(wú)菌玻片上，置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，25。C下黑暗恒溫培養(yǎng)，分別于l、2、3、4、5、6h觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率，測(cè)量芽管長(zhǎng)度。如6h對(duì)照的孢子萌發(fā)率低于90%，則繼續(xù)定時(shí)觀察，同時(shí)觀察無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原真菌孢子及芽管的破壞作用。孢子萌發(fā)率(％)=孢子萌發(fā)數(shù)/調(diào)查孢子總數(shù)BM-2菌株的發(fā)酵液對(duì)細(xì)鏈格孢菌的分生孢子的萌發(fā)有一定的抑制作用，處理后的孢子萌發(fā)率降低，芽管伸長(zhǎng)緩慢。BM-2菌株的發(fā)酵液對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用強(qiáng)，處理后的孢子萌發(fā)率明顯降低，6h孢子萌發(fā)率僅為30%，芽管生長(zhǎng)慢，6h芽管長(zhǎng)度為140um，而對(duì)照的萌發(fā)率高，6h孢子萌發(fā)率達(dá)到96%,芽管生長(zhǎng)速度快，6h芽管長(zhǎng)度達(dá)到了280um。顯微觀察結(jié)果表明處理孢子的原生質(zhì)濃縮，細(xì)胞壁變薄，芽管生長(zhǎng)較慢。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，處理孢子的芽管開(kāi)始畸形，出現(xiàn)扭曲，粗短，孢子體形異常，甚至串珠狀膨大。而對(duì)照組的芽管細(xì)長(zhǎng)，分枝多，很少有泡囊出現(xiàn)。3.3無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)5種細(xì)菌的抑菌作用(1)5種細(xì)菌大腸桿菌(五sc/zen'c/n'aco/0、枯草芽孢桿菌CBac///2^s由z'fe)、金黃色葡萄球菌(5"啤/z盧"occt^awrg—、嗜水氣單胞菌(爿er纖o"os/^(irap/zz7a)、耳卩爾森菌(7erw'm'asp.)。大腸桿菌(五"/zen'c/z/aco//)、枯草芽孢桿菌CSac"/ussw6"fc)、金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococcusawews)用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)。嗜水氣單胞菌(^erawo"oy/^Jrap/n'/a)、耶爾森菌(F簡(jiǎn)'w'flsp.)用2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏0.3g、蛋白胨l.Og、氯化鈉0.5g、瓊脂20g，水1000mL。2216E培養(yǎng)基蛋白胨5g、酵母膏l(xiāng)g、瓊脂20g、陳海水1000mL，pH8.0。(3)BM-2菌株發(fā)酵液對(duì)5種細(xì)菌的抑菌作用測(cè)定方法。采用打孔擴(kuò)散法。將在細(xì)菌培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)24h的5種細(xì)菌用0.85%的無(wú)菌生理鹽水洗下，制備成濃度為5X106個(gè)/mL菌懸液，取0.2mL菌懸液滴在平板培養(yǎng)基表面中央，用無(wú)菌涂布棒平涂布均勻。用直徑5mm的打孔器在距離培養(yǎng)皿邊緣1.5cm處的含菌平板四周打孔，每孔分別注入BM-2菌株的發(fā)酵液50yL，以等量的無(wú)菌海水高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基為對(duì)照。2『C培養(yǎng)箱中恒溫，培養(yǎng)24h后觀察測(cè)定抑菌圈直徑，結(jié)果見(jiàn)表7。表7BM-2菌林發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌的抑菌作用測(cè)定結(jié)果枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌嗜水氣單胞菌17耶爾森菌_^_從表7可以看出，BM-2菌株發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜水氣單胞菌有很強(qiáng)的抑制作用，但對(duì)金黃色葡萄球菌和耶爾森菌的抑制作用較弱。4、BM-2菌株抑菌物質(zhì)產(chǎn)生條件優(yōu)化4.1培養(yǎng)基對(duì)BM-2菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響。配制6種不同的液體培養(yǎng)基(見(jiàn)表8，用陳海水配制)，分裝到250ml的三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝入50ml。接種量為7%，在28。C、轉(zhuǎn)速為190r/min的條件下，培養(yǎng)5d，每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)，測(cè)定不同培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌效果，根據(jù)抑菌效果確定最適培養(yǎng)基。表8培養(yǎng)基配方沐養(yǎng)A培養(yǎng)基組分(1000ml)編號(hào)i可-溶性淀粉20g,~~灘酸鉀lg,~"氯化鈉0.5g,磷酸氫二鐘0.5g,硫酸鎂0.5g~葡糖糖5g,淀粉40g,魚(yú)粉5g，黃豆餅粉10g,磷酸氫二鐘3g,碳酸鈣4g,氯化鈣5g3淀粉14g,乳糖16g,黃豆粉16g，磷酸氫二鐘3g,碳酸媽4g，，氯化鉀0.4g4葡糖糖4g,魚(yú)粉5g，黃豆餅粉10g,磷酸氫二鉀3g,碳酸鈣4g,氯化鈣5g黃豆餅粉10g,淀粉10g,玉米粉15g,魚(yú)粉5g，蛋白胨2g,葡萄糖5g，硝酸郜0.5g,破酸鉀4g玉米粉40g>麩皮10g,麩質(zhì)粉5g>硫酸銨lg,磷酸氫二鉀lg,碳酸鉤4g，葡萄糖10g結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基組成對(duì)麗-2菌株發(fā)酵液的抑菌活性有較大影響，3號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌作用最強(qiáng)，發(fā)酵液的抑菌帶寬度最大，為9.0ran，其次為1、6號(hào)培養(yǎng)基，認(rèn)為3號(hào)培養(yǎng)基為供試的培養(yǎng)基中BM-2菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最適培養(yǎng)基。4.2BM-2菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化。根據(jù)篩選出的產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最適培養(yǎng)基配方，進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。4.2.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BM-2菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響。配制最適培養(yǎng)基，分裝到250ml的三角瓶中，每瓶裝入50ml。接種量為7%，放入振蕩培養(yǎng)箱中，在28。C、180r/min條件下，分別培養(yǎng)ld、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d，每個(gè)培養(yǎng)時(shí)間做3個(gè)平行，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液抑菌效果，根據(jù)抑菌效果確定最適培養(yǎng)時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BM-2菌株發(fā)酵液的抑菌作用影響較大，在前3d發(fā)酵液抑菌活性較低，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌活性增強(qiáng)，培養(yǎng)時(shí)間為5d時(shí)，發(fā)酵液的抑菌帶寬度最大，達(dá)到7.0mm，因此確定BM-2菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)最佳時(shí)間為5d。4.2.2培養(yǎng)溫度對(duì)BM-2菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響。配制最適培養(yǎng)基，分裝到250ml的三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝入50ml。接種量7%，轉(zhuǎn)速為180r/min，分別在15。C，20°C,25°C，28°C，30°C，35°C，37。C條件下培養(yǎng)5d。每個(gè)溫度做3個(gè)平行，測(cè)定發(fā)酵液的抑菌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BM-2菌株在15t^37。C之間培養(yǎng)時(shí)，其發(fā)酵液均具有抑菌作用，培養(yǎng)溫度為28。C時(shí)，發(fā)酵液的抑菌帶寬度最大，達(dá)到13mm，因此BM-2菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)最佳溫度為28°C。4.2.3pH對(duì)BM-2菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響。配制最適培養(yǎng)基，分別調(diào)pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，每個(gè)pH值做3個(gè)平行。接種量為7%，28°C、180r/min條件下培養(yǎng)5d，測(cè)定不同pH值發(fā)酵液的抑菌效果。測(cè)定不同pH下BM-2菌株發(fā)酵液的抑菌帶寬度結(jié)果表明pH為7.5時(shí)抑菌帶寬度最大，可達(dá)13.0mm，為產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的最佳pH。4.2.4接種量對(duì)BM-2菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響。配制最適培養(yǎng)基，接種量分別為.-1%、3%、5%、7%、9%、11%、13°/。、15%，每個(gè)接種量重復(fù)3次。放入28'C、180r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d，測(cè)定不同接種量發(fā)酵液的抑菌效果。接種量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BM-2在接種量為7%時(shí)抑菌效果最好。4.2.5裝瓶量對(duì)BM-2菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響。配制最適培養(yǎng)基，在250ml三角瓶中裝液量分別為30、40、50、60、70、80、90、100ml，每個(gè)裝瓶量做3個(gè)平行，接種量為7%，28°C，180r/min條件下振蕩培養(yǎng)5d，分別測(cè)定發(fā)酵液的抑菌效果。測(cè)定不同裝瓶量下BM-2菌株發(fā)酵液的抑菌帶寬度，結(jié)果表明裝瓶量在30mrS0ml時(shí)抑菌帶寬度不斷增大，裝瓶量為80ml時(shí)抑菌帶最寬，此后增加裝液量，抑菌效果逐漸減弱，因此裝瓶量為80ml時(shí)為最佳裝瓶量。4.2.6鹽度對(duì)BM-2菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響。在最適培養(yǎng)基中加入NaCl，分別配制含1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%NaCl培養(yǎng)基，接種量為7%，28°C、180r/min振蕩培養(yǎng)5d，測(cè)定不同NaCl含量培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Nad含量為1%3%時(shí)，隨著鹽濃度的提高，抑菌作用逐漸增強(qiáng)，濃度超過(guò)3%時(shí)抑菌作用下降，Nacl含量為3。/。時(shí)抑菌效果最好。4.2.7轉(zhuǎn)速對(duì)BM-2菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的影響。配制最適培養(yǎng)基，接種量為7%，將搖床轉(zhuǎn)速分別調(diào)節(jié)為160，170，180，190，200，210，220r/min，每個(gè)轉(zhuǎn)速做3個(gè)平行，28。C培養(yǎng)5d，測(cè)定不同轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵液的抑菌效果。20測(cè)定不同搖床轉(zhuǎn)速下發(fā)酵液的抑菌帶寬度結(jié)果表明BM-2菌株在轉(zhuǎn)速為190r/min時(shí)，其發(fā)酵液的抑菌帶寬度最大，說(shuō)明抑菌效果最好。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速高于或低于190r/mi時(shí)，抑菌作用逐漸降低。因此認(rèn)為該菌株的最佳搖床轉(zhuǎn)速為190r/min。上述試驗(yàn)對(duì)BM-2菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，認(rèn)為BM-2菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的最適培養(yǎng)基為淀粉14g、乳糖16g、黃豆粉16g、磷酸氫二鉀3g、碳酸鈣4g、氯化鉀0.4g、氯化鈉30g，水1000ml，pH為7.5;發(fā)酵條件為接種量為7%，裝瓶量為80ml(250ml三角瓶)，搖床轉(zhuǎn)速為190r/min，最適溫度為28匸，培養(yǎng)時(shí)間為5d。具體實(shí)施例方式以下進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)其權(quán)利的限制。實(shí)施例1。一種來(lái)自海洋的鏈霉菌BM-2(&r印fcw^cessp.BM-2)的分離培養(yǎng)方法，其步驟如下(1)富集培養(yǎng)從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有50mL的無(wú)菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養(yǎng)液中，190r/min，25。C條件下?lián)u床培養(yǎng)5天；(2)菌體的分離純化用移液槍取富集培養(yǎng)5天的培養(yǎng)液1.0mL加入到盛有9.0mL無(wú)菌海水的試管中，制備成10—'的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋?zhuān)謩e制備成10—2、10-3、10-4、10-5、10-fi、10—7的樣品稀釋液；然后分別取10—5、10—6和10—^勺樣品稀釋液0.2ml放到海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25t:的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落；再分別挑取海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板上的菌落，用三區(qū)劃線的方法接種到海水高氏l號(hào)培養(yǎng)基平板上，置于25i:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復(fù)劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個(gè)純化的菌株分別轉(zhuǎn)接到海水高氏1號(hào)培養(yǎng)基試管斜面中保存；(3)菌株的篩選采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，以供試的植物病原真菌小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌為受試菌，分別測(cè)定分離純化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作時(shí)在PDA培養(yǎng)基平板中央接種培養(yǎng)5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培養(yǎng)皿壁15mm處對(duì)稱(chēng)劃線接種分離純化得到的不同菌株，25。C倒置恒溫培養(yǎng)，觀察植物病原真菌菌落生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)5d后測(cè)量抑菌帶寬度；每個(gè)菌株為一處理，每處理重復(fù)3次；選取一株對(duì)前述2種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于15mm的菌株，記為BM-2菌株；(4)菌株的鑒定將BM-2菌株于25'C下培養(yǎng)5天，觀察記錄菌落和細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，并進(jìn)行16SrDNA測(cè)序分析；根據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果初步認(rèn)為菌株BM-2屬于鏈霉菌屬；16SrDNA的同源性分析表明，BM-2菌株最接近于5V^towyc"sp.，二者的16SrDNA序列相似性為99%，BM-2菌株為鏈霉菌(^SVe/tow;;c"sp.)。本實(shí)施例培養(yǎng)方法所得的鏈霉菌BM-2sp.BM-2)具有抑制9種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的作用，而且對(duì)其中的細(xì)鏈格孢菌分生孢子的萌發(fā)有抑制作用；還具備對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌很強(qiáng)的抑制作用。實(shí)施例2。實(shí)施例1所述的來(lái)自海洋的鏈霉菌BM-2(5^印towyc"sp.BM-2)的分離培養(yǎng)方法中，所得的鏈霉菌BM-2菌株的發(fā)酵條件為最適培養(yǎng)基為淀粉14g、乳糖16g、黃豆粉16g、磷酸氫二鉀3g、碳酸鈣4g、氯化鉀0.4g、氯化鈉30g，水1000ml，pH為7.5;發(fā)酵條件為接種量7%，裝瓶量250ml三角瓶80ml/瓶，搖床轉(zhuǎn)速190r/min，最適溫度28。C，培養(yǎng)時(shí)間5d。權(quán)利要求1、一種來(lái)自海洋的鏈霉菌BM-2(Streptomycessp.BM-2)的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，其步驟如下(1)富集培養(yǎng)從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有50mL的無(wú)菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養(yǎng)液中，190r/min，25℃條件下?lián)u床培養(yǎng)5天；(2)菌體的分離純化用移液槍取富集培養(yǎng)5天的培養(yǎng)液1.0mL加入到盛有9.0mL無(wú)菌海水的試管中，制備成10-1的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋?zhuān)謩e制備成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的樣品稀釋液；然后分別取10-5、10-6和10-7的樣品稀釋液0.2ml放到海水高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落；再分別挑取海水高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上的菌落，用三區(qū)劃線的方法接種到海水高氏1號(hào)培養(yǎng)基平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復(fù)劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個(gè)純化的菌株分別轉(zhuǎn)接到海水高氏1號(hào)培養(yǎng)基試管斜面中保存；(3)菌株的篩選采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，以供試的植物病原真菌小麥赤霉病菌和棉花枯萎病菌為受試菌，分別測(cè)定分離純化得到的不同菌株的抗植物病原真菌活性；操作時(shí)在PDA培養(yǎng)基平板中央接種培養(yǎng)5d的植物病原真菌，在植物病原真菌四周距培養(yǎng)皿壁15mm處對(duì)稱(chēng)劃線接種分離純化得到的不同菌株，25℃倒置恒溫培養(yǎng)，觀察植物病原真菌菌落生長(zhǎng)狀況，培養(yǎng)5d后測(cè)量抑菌帶寬度；每個(gè)菌株為一處理，每處理重復(fù)3次；選取一株對(duì)前述2種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于15mm的菌株，記為BM-2菌株；(4)菌株的鑒定將BM-2菌株于25℃下培養(yǎng)5天，觀察記錄菌落和細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，并進(jìn)行16SrDNA測(cè)序分析；根據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果初步認(rèn)為菌株BM-2屬于鏈霉菌屬；16SrDNA的同源性分析表明，BM-2菌株最接近于Streptomycessp.，二者的16SrDNA序列相似性為99％，BM-2菌株為鏈霉菌(Streptomycessp.)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的來(lái)自海洋的鏈霉菌BM-2(&reptomyc^sp.BM-2)的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的鏈霉菌BM-2菌株的發(fā)酵條件為最適培養(yǎng)基為淀粉14g、乳糖16g、黃豆粉16g、磷酸氫二鉀3g、碳酸鈣4g、氯化鉀0.4g、氯化鈉30g，水1000ml，pH為7.5;發(fā)酵條件為接種量7%，裝瓶量250ml三角瓶80ml/瓶，搖床轉(zhuǎn)速l術(shù)/min，最適溫度28'C，培養(yǎng)時(shí)間5d。3、權(quán)利要求1或2所述的鏈霉菌BM-2(6Vreptow少c"sp.BM-2)的抑制植物病原真菌的用途，以及抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌的用途。全文摘要本發(fā)明是一種來(lái)自海洋的鏈霉菌BM-2(Streptomycessp.BM-2)的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，其步驟如下它包括富集培養(yǎng)、菌體的分離純化、菌株的篩選和菌株的鑒定等步驟，根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)結(jié)果以及16SrDNA的同源性分析表明分離培養(yǎng)的菌株為鏈霉菌BM-2(Streptomycessp.BM-2)。該鏈霉菌BM-2具有抑制多種植物病原真菌及抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和嗜水氣單胞菌的作用。文檔編號(hào)A01N63/04GK101497867SQ20091002516公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2009年2月18日優(yōu)先權(quán)日2009年2月18日發(fā)明者吳少杰,張曉君,暴增海,李福后,王偉霞,馬桂珍申請(qǐng)人:淮海工學(xué)院