專利名稱：：植物微rna及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明公開了新的微RNA(microRNA)和微RNA前體，還公開了包含這些新的miRNA,miRNA前體和對(duì)應(yīng)于miRNA的miRNA識(shí)別位點(diǎn)的重組DNA構(gòu)建體。本發(fā)明包括表現(xiàn)出非生物_脅迫_應(yīng)答表達(dá)的新的miRNA和miRNA前體。本發(fā)明還提供miRNA誘騙序列(decoysequence)，在其基因組中含有本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子，以及利用本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體來調(diào)控基因表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)描述了參與RNA介導(dǎo)的基因抑制的若干細(xì)胞途徑，其各自在特征性途徑和特異性組成上不同。有關(guān)綜述參見例如Brodersen和Voinnet(2006),TrendsGenetics,22268-280、以及Tomari和Zamore(2005)Genes&Dev.，19:517_529。siRNA途徑包括將雙鏈RNA(“RNA雙鏈體”)非定相切割(non-phasedcleavage)為小干擾RNA(siRNA)。微RNA途徑包括微RNA(miRNA)，是通常介于約19至約25個(gè)核苷酸(在植物中通常為約20-24個(gè)核苷酸)的非蛋白質(zhì)編碼RNA，其指導(dǎo)靶轉(zhuǎn)錄物的反式切割，負(fù)調(diào)節(jié)參與各種調(diào)節(jié)和發(fā)育途徑的基因表達(dá)。植物miRNA以一組特征來定義，包括由DCLl加工成約21個(gè)核苷酸的單個(gè)特異性miRNA的莖環(huán)前體，表達(dá)來自具有2個(gè)核苷酸的3’突出端(overhang)的RNA雙鏈體的一對(duì)miRNA和miRNA*，并能反式沉默特定靶標(biāo)。參見Bartel(2004)Cell，116:281_297；Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.,6376-385Jones-Rhoadesφ(2006)Annu.Rev.PlantBiol.,5719-53；Ambros等(2003)RNA，9:277_279。在反式作用siRNA(ta_siRNA)途徑中，miRNA的作用是在需要RNA依賴性RNA聚合酶來產(chǎn)生RNA雙鏈體的過程中指導(dǎo)siRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的同步加工；反式作用siRNA定義為缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)，缺乏啟動(dòng)雙鏈RNA產(chǎn)生的miRNA靶位點(diǎn)，需要DCL4和RNA依賴性RNA聚合酶(RDR6)并產(chǎn)生多個(gè)完美定相的(perfectlyphased)21個(gè)核苷酸小RNA(smallRNA)，其具有含2個(gè)核苷酸的3’突出端的完美匹配的雙鏈體(參見Allen等(2005)Cell,121:207_221)。微RNA(miRNA)是非蛋白質(zhì)編碼RNA，通常介于約19至約25個(gè)核苷酸(在植物中通常為約20-24個(gè)核苷酸)，其指導(dǎo)靶轉(zhuǎn)錄物的反式切割，負(fù)調(diào)節(jié)參與各種調(diào)節(jié)和發(fā)育途徑的基因表達(dá)(Bartel(2004)Cell,116:281_297)。在某些情況下，miRNA的作用是指導(dǎo)siRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的同步加工(參見Alien等(2005)Cell，121=207-221)0已經(jīng)鑒定出一些微RNA基因(MIR基因)并且在數(shù)據(jù)庫中是公眾可得的("miRBase，，,在microrna.Sanger,ac.uk/sequences在線可得)。本申請(qǐng)人已在2005年12月15日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)11/303,745中公開了新的MIR基因、成熟miRNA和miRNA識(shí)別位點(diǎn)，通過引用結(jié)合到本文中。其它MIR基因和成熟miRNA也描述于美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2005/0120415和2005/144669A1，通過引用結(jié)合到本文中。已經(jīng)報(bào)告MIR基因存在于基因間區(qū)域，在基因組中或單獨(dú)或成簇存在，但也可完整或部分地位于其它基因(蛋白質(zhì)編碼基因或非蛋白質(zhì)編碼基因)的內(nèi)含子中。有關(guān)miRNA生物起源的最新綜述，可參見Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.，6:376_385。至少在某些情況下，MIR基因轉(zhuǎn)錄可處于MIR基因自身啟動(dòng)子的啟動(dòng)控制之下。MIR基因轉(zhuǎn)錄可能通常由RNA聚合酶II介導(dǎo)(參見例如Aukerman和Sakai(2003)PlantCell,15:2730_2741；Parizotto等(2004)GenesDev.，18=2237-2242)，因此可適合已用于其它聚合酶II轉(zhuǎn)錄基因的基因沉默方法。初級(jí)轉(zhuǎn)錄物(其可以是多順反子)稱為“pri-miRNA”，即miRNA前體分子，其可以相當(dāng)大(數(shù)千堿基)并含有一個(gè)或多個(gè)局部雙鏈或“發(fā)夾”區(qū)以及通常具有mRNA的5’“帽子”和聚腺苷酸化尾。參見例如Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.，6:376_385中的圖1。在植物細(xì)胞中，認(rèn)為微RNA前體分子在細(xì)胞核中大量加工。pri-miRNA加工為更短的miRNA前體分子，其也包含莖環(huán)或折回結(jié)構(gòu)，稱為“pre-miRNA”。在植物中，miRNA和siRNA由不同切酶(DICER)樣(DCL)酶來形成，而在擬南芥屬(Arabidopsis)中，認(rèn)為核DCL酶(DCLl)是成熟miRNA形成所需的；參見例如Ambros等(2003)RNA，9:277_279，和Xie等(2004)PLoSBiol.，2:642_652。有關(guān)微RNA生物起源和功能的其它綜述可參見例如Bartel(2004)Cell,116:281_297；Murchison和Hannon(2004)Curr.Opin.CellBiol.，16-.223-229；Dugas和Bartel(2004)Curr.Opin.PlantBiol.，7:512_520。因此，可根據(jù)RNA(例如成熟miRNA或miRNA前體RNA分子的RNA序列)，或者根據(jù)DNA(例如對(duì)應(yīng)于成熟miRNARNA序列的DNA序列或者編碼MIR基因或MIR基因片段或miRNA前體的DNA序列)，對(duì)微RNA進(jìn)行描述。估計(jì)MIR基因家族在至少某些基因組中占并能影響或調(diào)節(jié)全部基因中大約三分之一的表達(dá)(參見例如Tomari等(2005)Curr.Biol.，15:R61_64；G.Tang(2005)TrendsBiochem.Sci.,30106-14；Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.，6:376_385)。因?yàn)樵诎▌?dòng)植物在內(nèi)的真核生物中，miRNA是重要的調(diào)節(jié)元件，所以miRNA的轉(zhuǎn)基因抑制可導(dǎo)致例如對(duì)重要生物學(xué)過程的了解或者允許操縱某些途徑(例如調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和細(xì)胞凋亡)，可用于例如生物技術(shù)應(yīng)用。參見例如0'Donnell等(2005)Nature，435:839_843；Cai等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:5570_5575；Morris和McManus(2005)Sci.STKE,pe41(stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans；2005/297/pe4Lpdf)。微RNA(MIR)基因具有許多標(biāo)志性特征，包括在植物物種中的保守性、穩(wěn)定的折回結(jié)構(gòu)和由切酶(Dicer)樣酶對(duì)特定miRNA/miRNA*雙鏈體進(jìn)行加工(Ambros等(2003)RNA，9:277_279)。這些特征已用于在植物中鑒定miRNA及其相應(yīng)基因(Xie等(2005)PlantPhysiol.，138=2145-2154；Jones-Rhoades禾口Bartel(2004)Mol.Cell,14:787_799；Reinhart等(2002)GenesDev.，161616-1626；Sunkar和Zhu(2004)PlantCell,16:2001_2019)。公眾可得的微RNA基因的目錄列在miRBase上(Griffiths-Jones等(2003)NucleicAcidsRes.,31:439_441)。MiRNA在擬南芥的非常特殊的細(xì)胞類型中表達(dá)(參見例如Kidner和Martienssen(2004)Nature,42881-84,Millar禾口Gubler(2005)PlantCell,17705-721)。抑制可限制在細(xì)胞類型的側(cè)面、邊緣或其它分界線，認(rèn)為它是合適細(xì)胞類型圖式形成和特化所必需的(參見例如Palatnik等(2003)Nature，425:257_263)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，含內(nèi)源miR171識(shí)別位點(diǎn)的GFP報(bào)道基因的抑制限制轉(zhuǎn)基因擬南芥特定細(xì)胞的表達(dá)(Parizotto等(2004)GenesDev.，18:2237_2242)。已經(jīng)證實(shí)miRNA的識(shí)別位點(diǎn)在mRNA的所有區(qū)域，包括5’非翻譯區(qū)、編碼區(qū)和3’非翻譯區(qū)，表明miRNA靶位點(diǎn)相對(duì)于編碼序列的位置可能并非一定會(huì)影響抑制(參見例如Jones-Rhoades和Bartel(2004)，Mol.Cell,14:787-799，Rhoades等(2002)Cell,110:513_520，Allen等(2004)Nat.Genet.,361282-1290，Sunkar和Zhu(2004)PlantCell,16:2001_2019)。本文所公開的成熟miRNA是從通常隸屬于在遠(yuǎn)緣植物物種中保守的規(guī)范家族(canonicalfamily)的MIR基因加工而來。這些MIR基因及其所編碼的成熟miRNA也可用于例如改變發(fā)育途徑，例如通過影響細(xì)胞分化或形態(tài)發(fā)生(參見例如Palatnik等(2003)Nature,425:257_263；Mallory等(2004)Curr.Biol.，141035-1046)，作為用于工程(非天然)miRNA的序列來源，這類工程miRNA經(jīng)設(shè)計(jì)成為沉默序列而不是天然miRNA序列所靶向的轉(zhuǎn)錄物(參見例如Parizotto等(2004)GenesDev.，18=2237-2242；另見美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2004/3411A1和2005/0120415，通過引用結(jié)合到本文中)并能使dsRNA穩(wěn)定化。MIR基因本身(或其天然5’非翻譯區(qū)或3’非翻譯區(qū)、或其天然啟動(dòng)子或參與其轉(zhuǎn)錄的其它元件)可作為靶基因用于基因抑制(例如通過本發(fā)明方法)，其中MIR基因所編碼的miRNA的抑制是所需的。MIR基因的啟動(dòng)子可具有非常特殊的表達(dá)圖式(expressionpattern)(例如細(xì)胞特異性、組織特異性或時(shí)間特異性)，因此可用于重組構(gòu)建體，來誘導(dǎo)與之操作性連接的DNA序列的這類特異性轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明提供從植物(包括作物，例如玉米、水稻和大豆)中鑒定出的新的微RNA和微RNA前體、以及重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含這些新的miRNA、miRNA前體、miRNA識(shí)別位點(diǎn)、miRNA誘騙序列和對(duì)應(yīng)于miRNA的miRNA啟動(dòng)子。也公開并要求保護(hù)在其基因組中含有本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子。還提供了用本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體進(jìn)行基因抑制的方法、以及提供具有所需表型的轉(zhuǎn)基因植物、尤其是在干旱、營(yíng)養(yǎng)缺乏、冷或熱脅迫等非生物脅迫條件下具有高產(chǎn)量(相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因植物而言)的轉(zhuǎn)基因植物的方法。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供重組DNA構(gòu)建體，其包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件選自(a)可轉(zhuǎn)錄為具有選自以下植物miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體的DNA元件:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中miRNA前體包含玉米、水稻或大豆的miRNA前體序列的至少90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段；(b)可轉(zhuǎn)錄為從選自以下植物miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)獲得的工程miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中工程miRNA前體包含修飾的成熟miRNA；(c)位于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)或其附近并可轉(zhuǎn)錄為包含miRNA識(shí)別位點(diǎn)的RNA的DNA元件，所述miRNA識(shí)別位點(diǎn)可被選自以下的成熟miRNA識(shí)別=SEQIDNO.1-1035,SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或者可被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識(shí)別SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；和(d)用于抑制從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內(nèi)源miRNA表達(dá)的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。本發(fā)明的另一方面提供包含任何本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。還提供含有本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的非天然轉(zhuǎn)基因植物，包括任何發(fā)育時(shí)期的植物，并包括由本文所公開的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物或再生植物的后代植物(其可以是近交或雜交后代植物)、或這類非天然轉(zhuǎn)基因植物的種子。也提供并要求保護(hù)在其基因組中具有本發(fā)明所提供的任何重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因種子。再一方面，本發(fā)明提供影響基因抑制的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供非天然轉(zhuǎn)基因植物，其包括由本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物或再生植物的后代植物；和(b)在非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄重組DNA構(gòu)建體；其中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA能夠在非天然轉(zhuǎn)基因植物中抑制至少一個(gè)靶基因，因此相對(duì)于在沒有所述重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄時(shí)的表達(dá)而言，至少一個(gè)靶基因被抑制。又一方面，本發(fā)明提供同時(shí)影響至少一個(gè)靶基因的基因抑制和至少一個(gè)目標(biāo)基因的基因表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供非天然轉(zhuǎn)基因植物，其包括由本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物或再生植物的后代植物，其中重組DNA構(gòu)建體還包含用于表達(dá)至少一個(gè)目標(biāo)基因的基因表達(dá)元件；和(b)在非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄重組DNA構(gòu)建體，其中，當(dāng)重組DNA構(gòu)建體在非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄時(shí)，產(chǎn)生能夠抑制至少一個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄RNA和編碼至少一個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄RNA，因此相對(duì)于在沒有所述重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄時(shí)的表達(dá)而言，至少一個(gè)靶基因被抑制，而且至少一個(gè)目標(biāo)基因同時(shí)表達(dá)。再一方面，本發(fā)明提供重組DNA構(gòu)建體，其包含對(duì)給定成熟miRNA無應(yīng)答的合成miRNA-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列，其中合成miRNA-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列是(a)由天然miRNA-應(yīng)答序列獲得，即通過缺失或修飾天然miRNA-應(yīng)答序列內(nèi)被特定成熟miRNA識(shí)別的所有天然miRNA識(shí)別位點(diǎn)，和(b)不被給定成熟miRNA識(shí)別。另一方面，本發(fā)明提供重組DNA構(gòu)建體，其包含表現(xiàn)出對(duì)非生物脅迫應(yīng)答的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子，例如，表現(xiàn)出特征為在營(yíng)養(yǎng)脅迫下抑制miRNA的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子，表現(xiàn)出特征為在水脅迫下抑制miRNA的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子，或者表現(xiàn)出特征為在溫度脅迫下抑制miRNA的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子。又一方面，本發(fā)明提供重組DNA構(gòu)建體，其可轉(zhuǎn)錄為包含至少一個(gè)miRNA誘騙序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，所述誘騙序列被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合，但不切割；包括在其基因組中具有該構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子，以及使用該構(gòu)建體的方法。本發(fā)明相關(guān)方面包括重組DNA構(gòu)建體和用于抑制內(nèi)源miRNA誘騙序列的方法。也公開了識(shí)別并結(jié)合其它小RNA(ta-siRNA、nat_siRNA和定相小RNA)但不被切割、因而降低小RNA活性的類似誘騙序列。本發(fā)明的其它具體實(shí)施方案在以下發(fā)明詳述中公開。附圖簡(jiǎn)述W010]圖1描繪了選自以下植物miRNA前體序列的折回結(jié)構(gòu)的非限制性實(shí)例SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，更準(zhǔn)確地講，具有SEQIDNO.1136的miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)，其包含2個(gè)短莖環(huán)、1個(gè)環(huán)和2個(gè)凸起(bulge)。miRNA前體通過inplanta方式加工為成熟miRNA(在該特定實(shí)例中，加工成具有SEQIDN0.32的成熟miRNA)。圖2和圖3描繪了用于抑制靶基因(例如內(nèi)源miRNA)表達(dá)的DNA元件的非限制性實(shí)例，如實(shí)施例3所述。W012]圖4描繪了從不同玉米組織分離的成熟miRNA的RNA印跡結(jié)果，如實(shí)施例4所述。W013]圖5描繪了探針組(probeset)序列的轉(zhuǎn)錄概況，包括具有對(duì)玉米雄性生殖組織(花粉)具有特異性的表達(dá)圖式的miRNA前體序列，如實(shí)施例4所述。W014]圖6描繪了用于大豆植物干旱期的從1.0(無影響或?qū)φ?至4.0的相對(duì)評(píng)分系統(tǒng)，如實(shí)施例5所述。W015]如實(shí)施例6所述，圖7A描繪了玉米miRM0N18前體(SEQIDN0.3936)的折回結(jié)構(gòu)，圖7B描繪了水稻miRM0N18前體(SEQIDN0.1763)的折回結(jié)構(gòu)，圖7C描繪了擬南芥(Arabidopsisthaliana)miR827前體(SEQIDN0.8743)的折回結(jié)構(gòu)。圖7D描繪了miR827(SEQIDNO.8744)和miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDN0.3227或SEQIDNO.8742)的比較，帶編號(hào)的箭頭標(biāo)明成熟miRNA的位置1、10和21；位置10的核苷酸還具有下劃線。圖8描繪了通過成熟miRM0N1821聚體的RNA印跡測(cè)定的miRM0N18的表達(dá)圖式(圖8A)和miRM0m8前體的轉(zhuǎn)錄概況分析(transcriptionprofiling)(圖8B)，如實(shí)施例6所述。W017]圖9描繪了在來自缺水(干旱)(圖9A)、低溫(圖9B)和缺氮條件(圖9C)下生長(zhǎng)的植物的玉米組織中玉米miRM0N18前體(SEQIDN0.3936)的表達(dá)分析，如實(shí)施例6所述。圖10描繪了玉米(Zeamaysvar.LH244)小RNA的RNA印跡結(jié)果，表明miRM0N18在玉米胚乳和籽粒中表達(dá)提高，在葉片中由缺氮誘導(dǎo)的強(qiáng)miRM0N18抑制(圖10A)，以及在磷充足條件下葉片組織中的強(qiáng)miRM0N18表達(dá)和在缺磷條件下miRM0N18抑制(圖10B)，如實(shí)施例6所述。圖11描繪了含有玉米SPX結(jié)構(gòu)域(如果存在的話，用下劃線標(biāo)明序列)和玉米MFS結(jié)構(gòu)域(用粗體字標(biāo)明序列)的新的玉米miRMONIS靶基因的多序列比對(duì)，如實(shí)施例7所述。圖12描繪了構(gòu)建用于已鑒定SPX基因的系統(tǒng)樹，如實(shí)施例7所述；已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)含有預(yù)測(cè)miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)(在來自并非擬南芥的物種的基因中)或預(yù)測(cè)miR827識(shí)別位點(diǎn)(在來自擬南芥的基因中)的基因用粗體字標(biāo)明。圖13描繪了miRM0N18基因組序列(SEQIDNO.8800)，如實(shí)施例8所述。它顯示了以大寫字母表示的在核苷酸2173-2788的miRM0N18轉(zhuǎn)錄物、以小寫字母表示的在核苷酸211-2172的miRM0N18啟動(dòng)子元件、以小寫字母表示的在核苷酸2173-2308的前導(dǎo)元件、以下劃線加上小寫字母表示的在核苷酸2144-2147的規(guī)范TATA盒(末端是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的25個(gè)核苷酸)、以下劃線加上大寫字母表示的在核苷酸2419-2439的成熟miRM0N18和以下劃線加上大寫字母表示的在核苷酸2322-2341的miRM0N18*。圖14描繪了水稻序列0s02g45520(SEQIDNO.8784)和0s04g48390(SEQIDNO.8786)以及玉米序列MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的miRM0N18的預(yù)測(cè)切割，如實(shí)施例9所述。圖15描繪了miRM0m8前體(圖15A)和miRM0N18靶標(biāo)(圖15B)之間的負(fù)相關(guān)，如實(shí)施例9所述。圖15B顯示玉米序列MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)，表明在缺氮條件下比在氮充足條件下表達(dá)水平更高，即表達(dá)圖式與miRM0N18前體的表達(dá)圖式相反，如圖15A所示。圖16描繪了載體pM0N107261，其包含驅(qū)動(dòng)玉米miRM0N18轉(zhuǎn)錄物(例如SEQIDN0.8800核苷酸2173-2788)表達(dá)的CaMV35S啟動(dòng)子，如實(shí)施例10所述。圖17A描繪了玉米miR399前體的折回結(jié)構(gòu)；圖17B描繪了轉(zhuǎn)錄概況分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明Zm-miR399pri-miRNA在缺氮條件(黑柱)下受抑制，而在氮充足條件(白柱)下表達(dá)，如實(shí)施例11所述。圖18描繪了miR399誘騙序列的玉米cDNA序列與共有序列SEQIDN0.8834的比對(duì)，揭示出至少兩組基因含有miR399誘騙序列，如實(shí)施例11所述。圖19描繪了比較玉米miR399誘騙序列和miR399前體表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如實(shí)施例11所述。圖19A顯示組lmiR399誘騙基因MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)的轉(zhuǎn)錄概況，圖19B顯示組2miR399誘騙基因MRT4577_36567C.8(SEQIDNO.8829)的轉(zhuǎn)錄概況，表明這些miR399誘騙序列受到缺氮的下調(diào)。這些結(jié)果通過測(cè)定成熟miR399表達(dá)(圖19C)和miR399誘騙序列MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)表達(dá)(圖19D)的RNA印跡得以證實(shí)。圖20描繪了比較不同溫度條件下玉米內(nèi)源miR399誘騙cDNA序列和相應(yīng)玉米miR399前體的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄概況分析實(shí)驗(yàn)，如實(shí)施例11所述。在氮充足條件期間，在玉米葉片中，尤其是在白天時(shí)，組2miR399誘騙基因MRT4577_36567C.8(SEQIDNO.8829)表現(xiàn)出至少10倍以上的較高表達(dá)(圖20A)。在根(圖20B)和芽(圖20C)中，在延長(zhǎng)低溫處理后，這同一基因表現(xiàn)出至少2倍下調(diào)。圖21描繪了在玉米和大豆的不同組織中內(nèi)源miR399誘騙cDNA序列的表達(dá)，如實(shí)施例11所述。圖2IA描繪了以下序列的表達(dá)水平組1玉米miR399誘騙序列SEQIDN0.8827(MRT4577_47862C,代表為探針AlZM005814_at和AlZM005813_s_at)，和組2玉米miR399誘騙序列SEQIDN0.8829(MRT4577_36567C，代表為探針AlZM048024_at)、以及玉米pri-miR399序列SEQIDN0.8818(MRT4577_22487C.6代表為探針AlZM033468_at)。圖21B描繪了以下序列的表達(dá)水平大豆miR399誘騙序列SEQIDN0.8842(MRT3847_217257C.2,代表為探針AlGM031412_at)、SEQIDNO.8844(MRT3847_236871C.2,代表為探針AlGM053788_at)、SEQIDNO.8836(MRT3847_238967C.1，代表為探針AlGM035741_at)和SEQIDNO.8838(MRT3847_241832C.1，代表為探針AlGM069937_at)。圖22A描繪了大豆內(nèi)源miR319誘騙SEQIDNO.8847(MRT3847_41831C.6，代表為探針AlGM001017_at)在不同大豆組織中的轉(zhuǎn)錄概況分析數(shù)據(jù)；圖22B描繪了玉米內(nèi)源miR319誘騙SEQIDN0.8849(MRT4577_577703C.1，代表為探針AlZM012886_s_at)在不同玉米組織中的轉(zhuǎn)錄概況分析數(shù)據(jù)，如實(shí)施例11所述。發(fā)明詳述除非另有說明，否則所用的所有科技術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的含義。通常，所用的命名法和下述制造或?qū)嶒?yàn)室步驟都是本領(lǐng)域眾所周知的和常用的。常規(guī)方法用于這些步驟，例如本領(lǐng)域和各種通用參考文獻(xiàn)所提供的那些。除非另有說明，否則就本說明書而言的核酸序列是給定的，當(dāng)從左到右閱讀時(shí)，按5’一3’的方向。按照說明，核酸序列可以DNA或RNA形式提供；一個(gè)公開必定限定另一個(gè)，這是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。當(dāng)給出的術(shù)語為單數(shù)時(shí)，本發(fā)明人也以該術(shù)語的復(fù)數(shù)形式來考慮本發(fā)明所述方面。所用的命名法和下述實(shí)驗(yàn)室步驟是本領(lǐng)域眾所周知的和常用的。當(dāng)通過引用結(jié)合到本文中的參考文獻(xiàn)中所用的術(shù)語和定義有出入時(shí)，本申請(qǐng)所用的術(shù)語應(yīng)當(dāng)具有所給出的定義。所用的其它技術(shù)術(shù)語具有所屬領(lǐng)域公知的含義，如各種技術(shù)詞典所示例。本發(fā)明人并不受限于作用機(jī)制或作用方式。其中所提供的參考文獻(xiàn)僅用于說明性目的。重組DNA構(gòu)建體本發(fā)明提供重組DNA構(gòu)建體，其包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件選自(a)可轉(zhuǎn)錄為具有選自以下植物miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1036-2690,SEQIDN0.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408,SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中miRNA前體包含玉米、水稻或大豆的miRNA前體序列的至少90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段；(b)可轉(zhuǎn)錄為從選自以下植物miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)獲得的工程miRNA前體的DNA元件SEQIDN0.1036-2690,SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中工程miRNA前體包含修飾的成熟miRNA；(c)位于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)或其附近并可轉(zhuǎn)錄為包含miRNA識(shí)別位點(diǎn)的RNA的DNA元件，所述miRNA識(shí)別位點(diǎn)可被選自以下的成熟miRNA識(shí)別SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或者可被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識(shí)別SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；和(d)用于抑制從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內(nèi)源miRNA表達(dá)的DNA元件SEQIDN0.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDN0.8816-8819。在標(biāo)題“靶基因”下描述了其表達(dá)可使用本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體來調(diào)節(jié)的靶基因。至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件的實(shí)施方案和用途描述如下。(A)天然miRNA在非天然條件下的表達(dá)。在重組DNA構(gòu)建體的一個(gè)實(shí)施方案中，用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含可轉(zhuǎn)錄為具有選自以下植物miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中miRNA前體包含玉米、水稻或大豆的miRNA前體序列的至少90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)至少一個(gè)靶基因的抑制。至于“miRNA前體”是指比自miRNA前體加工而來的成熟miRNA大的轉(zhuǎn)錄RNA，其通常預(yù)測(cè)可形成含有非完美互補(bǔ)雙鏈RNA區(qū)的折回結(jié)構(gòu)。參見Bartel(2004)Cell,116281-297；Kim(2005)NatureRev.Mol.CellBiol.，6:376_385；Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.PlantBiol.,5719-53；Ambros等(2003)RNA,9:277_279。微RNA前體的實(shí)例包括但不限于初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)以及天然來自pri_miRNA的pre_miRNA；miRNA前體也包含非天然RNA序列，預(yù)測(cè)其可形成含有非完美互補(bǔ)雙鏈RNA區(qū)的折回結(jié)構(gòu)并一般通過一個(gè)或多個(gè)切割步驟在體內(nèi)加工為成熟miRNA。至于“miRNA前體序列”是指這樣的RNA序列其至少包含miRNA前體核苷酸，但也可包含額外核苷酸(致使miRNA前體包含玉米、水稻或大豆的miRNA前體序列至少90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段)。各miRNA前體自身形成折回結(jié)構(gòu)，其與由至少部分相應(yīng)miRNA前體序列所形成的折回結(jié)構(gòu)相同或幾乎相同。在這些實(shí)施方案中，miRNA前體不必包含選自以下植物miRNA前體序列中所含有的所有核苷酸:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，但優(yōu)選包含選自以下植物miRNA前體序列的至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%核苷酸的連續(xù)區(qū)段SEQIDN0.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，因此重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)至少一個(gè)靶基因的抑制。重組DNA構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄可調(diào)節(jié)含有與miRNA前體所編碼的成熟miRNA基本互補(bǔ)并被其識(shí)別的序列(“miRNA識(shí)別位點(diǎn)”)的任何基因(內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因)的表達(dá)。通常，重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致對(duì)含有被miRNA前體所編碼的成熟miRNA識(shí)別的miRNA識(shí)別位點(diǎn)的內(nèi)源基因的抑制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體還包含并非miRNA序列天然啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。這允許成熟miRNA在并不能天然表達(dá)的空間或時(shí)間或誘導(dǎo)條件下得以表達(dá)。例如，可將重組DNA構(gòu)建體設(shè)計(jì)成包含組成型啟動(dòng)子，因而能組成型地表達(dá)僅在黑暗條件下才能天然表達(dá)的成熟miRNA(即當(dāng)以處于天然啟動(dòng)子控制之下的內(nèi)源miRNA前體的形式表達(dá)時(shí))。在標(biāo)題“啟動(dòng)子”下描述了可與該重組DNA構(gòu)建體一起使用的啟動(dòng)子。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，重組DNA構(gòu)建體包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含可轉(zhuǎn)錄為miRNA前體的DNA元件，所述miRNA前體是由具有SEQIDN0.1136的玉米miRNA前體序列的約90%核苷酸組成的連續(xù)區(qū)段，并且預(yù)測(cè)其具有的折回結(jié)構(gòu)與具有SEQIDN0.1136的miRNA前體序列的折回結(jié)構(gòu)基本相同(即在相同或大致相同的位置上具有雙鏈RNA莖和單鏈環(huán)或凸起的區(qū)域)。具有SEQIDN0.1136的miRNA前體序列的折回結(jié)構(gòu)包含約118個(gè)核苷酸，其在折回結(jié)構(gòu)的閉合端的環(huán)上伸出兩個(gè)短莖環(huán)，并在折回結(jié)構(gòu)的主要雙鏈“莖”內(nèi)具有兩個(gè)小凸起(圖1)。通過inplanta方式自miRNA前體(其是包含具有SEQIDN0.1136的玉米miRNA前體序列的約90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段)加工而來的成熟miRNA，優(yōu)選與由具有SEQIDNO.1136的miRNA前體序列的折回結(jié)構(gòu)(即具有SEQIDNO.32的成熟miRNA)所編碼的相同。該重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄優(yōu)選導(dǎo)致對(duì)含有被具有SEQIDNO.32的成熟miRNA識(shí)別的miRNA識(shí)別位點(diǎn)的至少一個(gè)內(nèi)源基因的抑制。盡管具有SEQIDNO.1136的玉米miRNA前體序列在玉米籽粒組織、而不是在葉片中天然表達(dá)(參見表2)，但是重組DNA構(gòu)建體還可包含并非具有SEQIDNO.1136的miRNA前體序列的天然啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，例如組成型啟動(dòng)子，以允許具有SEQIDNO.32的成熟miRNA能在除籽粒組織之外的組織中轉(zhuǎn)錄。(B)成熟的工程miRNA的表達(dá)。在重組DNA構(gòu)建體的另一個(gè)實(shí)施方案中，用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含可轉(zhuǎn)錄為從選自以下植物miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)獲得的工程miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中工程miRNA前體包含修飾的成熟miRNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因或者所述植物的有害動(dòng)物或病原體的內(nèi)源基因，重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)至少一個(gè)靶基因的抑制。至于“工程”是指例如選自以下植物miRNA前體序列的天然miRNA前體序列中的核苷酸被改變(替換、缺失或添加):SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDN0.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，因而產(chǎn)生具有與天然miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)基本相同的折回結(jié)構(gòu)的工程miRNA前體，但其中由工程miRNA前體加工而來的成熟miRNA具有修飾序列(即不同于天然成熟miRNA的序列)，所述修飾序列經(jīng)設(shè)計(jì)用于抑制靶基因，該靶基因不同于被天然miRNA前體序列天然抑制的靶基因。用于測(cè)定天然miRNA前體序列中核苷酸改變以產(chǎn)生工程miRNA前體、用于制備本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的一個(gè)通用的非限制性方法包括下列步驟(a)選擇對(duì)靶基因具有特異性的至少18個(gè)核苷酸的例如玉米cDNA數(shù)據(jù)庫和基因組DNA數(shù)據(jù)庫的獨(dú)特靶序列，例如通過使用序列比對(duì)工具例如BLAST(參見例如Altschul等(1990)J.Mol.Biol.，215403-410；Altschul^(1997)NucleicAcidsRes.，25:3389_3402)，以鑒定靴轉(zhuǎn)錄直向同源物和對(duì)無關(guān)基因的任何潛在匹配，因而避免非靶序列的無意沉默。(b)分析靶基因中不需要的序列(例如與來自非目標(biāo)物種(尤其是動(dòng)物)的序列匹配)，并評(píng)價(jià)每個(gè)潛在19聚體區(qū)段的GC含量、Reynolds評(píng)分(參見Reynolds等(2004)NatureBiotechnol.,22326-330)和特征是自由能為負(fù)差異("ΔAG”)的功能不對(duì)稱(參見Khvorova等(2003)Cell,115209-216)。優(yōu)選選擇具有以下所有或大部分特征的19聚體(I)Reyn0Ids評(píng)分>4，(2)GC含量介于約40%至約60%，(3)負(fù)ΔAG,(4)末端腺苷，(5)缺乏連續(xù)4輪以上的同一核苷酸；(6)位置靠近靶基因的3’端；(7)與miRNA前體轉(zhuǎn)錄物的差異最小。優(yōu)選選擇多個(gè)(3個(gè)或更多)19聚體用于試驗(yàn)。(c)測(cè)定所選19聚體的反向互補(bǔ)，用于制備修飾的成熟miRNA；優(yōu)選位置20的額外核苷酸與所選靶序列匹配，優(yōu)選選擇位置21的核苷酸不配對(duì)，以防靶轉(zhuǎn)錄物上擴(kuò)散沉默。(d)測(cè)定工程miRNA前體，例如，在土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的瞬時(shí)煙草(Nicotianabenthamiana)測(cè)定，用于修飾的成熟miRNA表達(dá)和靶抑制。和(e)將最有效的工程miRNA前體克隆到構(gòu)建體中，用于玉米的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(參見標(biāo)題“制備和使用重組DNA構(gòu)建體”和“制備和使用非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和非天然轉(zhuǎn)基因植物”下的部分)。(C)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)與miRNA識(shí)別位點(diǎn)在重組DNA構(gòu)建體的另一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體還包含轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元，其中用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含位于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)或其附近并可轉(zhuǎn)錄為包含miRNA識(shí)別位點(diǎn)的RNA的DNA元件，所述miRNA識(shí)別位點(diǎn)可被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識(shí)別SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，并且至少一個(gè)靶基因包含轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元所編碼的轉(zhuǎn)基因，而且其中重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因在成熟miRNA并不能天然表達(dá)的植物細(xì)胞中得以表達(dá)。miRNA識(shí)別位點(diǎn)的優(yōu)選實(shí)施方案是預(yù)測(cè)可被選自以下成熟miRNA中的至少一個(gè)成熟miRNA識(shí)別的那些SEQIDN0.1-1035、SEQIDN0.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850,或者被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的至少一個(gè)成熟miRNA識(shí)別的那些SEQIDN0.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408,SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。使用以下文獻(xiàn)所述的序列互補(bǔ)法則等本領(lǐng)域已知方法，可完成對(duì)識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)Zhang(2005)NucleicAcidsRes.，33:W701_704和Rhoades等(2002)Cell,110513-520。對(duì)miRNA識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)允許鑒定和證實(shí)受到來自天然表達(dá)miRNA前體的miRNA調(diào)節(jié)的內(nèi)源基因；這可用于例如消除或修飾內(nèi)源基因內(nèi)的miRNA識(shí)別位點(diǎn)，以便使該基因的表達(dá)從由天然調(diào)節(jié)基因表達(dá)的內(nèi)源miRNA的調(diào)節(jié)中解脫出來。例如，可以增加涉及位置2至13的堿基(在具有連續(xù)21個(gè)核苷酸的miRNA識(shí)別位點(diǎn)中)的錯(cuò)配數(shù)，以防被miRNA識(shí)別并切割。這些重組DNA構(gòu)建體尤其可用于轉(zhuǎn)基因在特定的空間、時(shí)間或誘導(dǎo)模式下的inPlanta表達(dá)，而無需具有該特定表達(dá)圖式的啟動(dòng)子。這些重組DNA構(gòu)建體允許例如由組成型啟動(dòng)子或表達(dá)超出所需細(xì)胞或組織類型的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的基因的限制性表達(dá)。限制性表達(dá)可以是在空間或時(shí)間上受限制，例如局限在特定組織或細(xì)胞類型或形式，或局限在特定發(fā)育期、生殖期、生長(zhǎng)期或季節(jié)期。當(dāng)在特定條件下(例如在擁擠、異株克生作用(allelopathicinteraction)或有害動(dòng)物或病原體侵染等生物脅迫下，或者在冷或熱脅迫、干旱脅迫、營(yíng)養(yǎng)脅迫、重金屬或鹽脅迫等非生物脅迫下)表達(dá)miRNA時(shí)，相應(yīng)miRNA識(shí)別位點(diǎn)可用于條件特異性抑制，即在特定條件下抑制轉(zhuǎn)基因。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體可用于在非水脅迫條件下在植物中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，其中本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體編碼(a)轉(zhuǎn)基因，其處于組成型啟動(dòng)子控制之下，和(b)miRNA識(shí)別位點(diǎn)，其由僅在水脅迫條件下才特異性表達(dá)的成熟miRNA識(shí)別。在另一個(gè)非限制性實(shí)例中，本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體可用于在植物受到有害動(dòng)物傷害的條件下在植物根部限制性表達(dá)殺蟲蛋白，其中本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體編碼(a)表達(dá)殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因，其處于由創(chuàng)傷特異性誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的控制之下，和(b)miRNA識(shí)別位點(diǎn)，其被在非根組織中表達(dá)的成熟miRNA識(shí)別。轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因和任選額外序列，例如但不限于啟動(dòng)子、啟動(dòng)子增強(qiáng)子、終止子、信使RNA穩(wěn)定或去穩(wěn)定序列(參見例如Newman等(1993)PlantCell,5701-714；Green(1993)PlantPhysiol.，1021065-1070；禾ΠOhme-Takagi等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,9011811-11815)、用于將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄物定位或轉(zhuǎn)運(yùn)至特定場(chǎng)所(例如線粒體、質(zhì)體、核仁、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)的序列、或轉(zhuǎn)基因所需加工相關(guān)的其它序列。轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元所編碼的轉(zhuǎn)基因可包含任何一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因，包括編碼序列、非編碼序列或這兩者。目標(biāo)基因可包含“靶基因”下所列出的任何基因，其優(yōu)選的實(shí)例包括轉(zhuǎn)錄因子編碼基因和酶編碼基因的可翻譯(編碼)序列，所述酶參與目標(biāo)分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂質(zhì)、糖類和其它碳水化合物、生物聚合物和次級(jí)代謝物(包括生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級(jí)代謝物))的生物合成或分解代謝。(D)對(duì)內(nèi)源或天然miRNA的抑制。在重組DNA構(gòu)建體的又一個(gè)實(shí)施方案中，用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含用于對(duì)從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內(nèi)源miRNA表達(dá)進(jìn)行抑制的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，而且該內(nèi)源基因的表達(dá)在發(fā)生內(nèi)源miRNA天然表達(dá)的植物細(xì)胞中被抑制，因此重組DNA構(gòu)建體在細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)源基因在細(xì)胞中的表達(dá)。用于抑制表達(dá)的DNA元件包含以下至少一個(gè)(a)包含至少一個(gè)反義DNA區(qū)段的DNA，該反義DNA區(qū)段對(duì)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的；(b)包含多拷貝的至少一個(gè)反義DNA區(qū)段的DNA，該反義DNA區(qū)段對(duì)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的；(c)包含至少一個(gè)有義DNA區(qū)段的DNA，該有義DNA區(qū)段是靶基因的至少一個(gè)區(qū)段；(d)包含多拷貝的至少一個(gè)有義DNA區(qū)段的DNA，該有義DNA區(qū)段是靶基因的至少一個(gè)區(qū)段；(e)可轉(zhuǎn)錄為RNA并通過形成雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA，并且該DNA包含至少一個(gè)反義DNA區(qū)段和至少一個(gè)有義DNA區(qū)段，該反義DNA區(qū)段對(duì)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的，而該有義DNA區(qū)段是靶基因的至少一個(gè)區(qū)段；(f)可轉(zhuǎn)錄為RNA并通過形成一個(gè)雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA,并且該DNA包含多個(gè)連續(xù)反義DNA區(qū)段和多個(gè)連續(xù)有義DNA區(qū)段，這些反義DNA區(qū)段對(duì)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的，而這些有義DNA區(qū)段是靶基因的至少一個(gè)區(qū)段；(g)可轉(zhuǎn)錄為RNA并通過形成多個(gè)雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA，并且該DNA包含多個(gè)反義DNA區(qū)段和多個(gè)有義DNA區(qū)段，這些反義DNA區(qū)段對(duì)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的，而這些有義DNA區(qū)段是靶基因的至少一個(gè)區(qū)段，并且其中多個(gè)反義DNA區(qū)段和多個(gè)有義DNA區(qū)段以一系列反向重復(fù)序列方式排列；(h)包含從植物miRNA獲得的核苷酸的DNA；⑴包含siRNA的核苷酸的DNA；(j)可轉(zhuǎn)錄為能結(jié)合配體的RNA適配子(aptamer)的DNA；和(k)可轉(zhuǎn)錄為能結(jié)合配體的RNA適配子的DNA，和可轉(zhuǎn)錄為能調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)RNA的DNA，其中調(diào)節(jié)依賴于調(diào)節(jié)RNA的構(gòu)象，而調(diào)節(jié)RNA的構(gòu)象受到RNA適配子結(jié)合狀態(tài)的變構(gòu)影響。用于抑制表達(dá)的DNA元件在實(shí)施例3中進(jìn)一步描述并如圖2和圖3所示。在某些實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含這樣的DNA其設(shè)計(jì)成可轉(zhuǎn)錄為單鏈RNA或至少部分雙鏈RNA(例如以“相吻莖環(huán)(kissingstem-loop)”排列)、或可轉(zhuǎn)錄為假定二級(jí)結(jié)構(gòu)或三維構(gòu)型(例如靶基因或適配子的反義序列的大環(huán))的RNA，該RNA賦予轉(zhuǎn)錄物額外的所需特性，例如穩(wěn)定性提高、體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)或者細(xì)胞特異性或組織特異性提高。在一個(gè)實(shí)例中，間隔區(qū)可轉(zhuǎn)錄為能連接連續(xù)RNA區(qū)段第一系列和第二系列的穩(wěn)定環(huán)(參見例如DiGiusto和King(2004)J.Biol.Chem.，279:46483_46489)。在另一個(gè)實(shí)例中，重組DNA構(gòu)建體包含可轉(zhuǎn)錄為包含RNA適配子(例如可結(jié)合細(xì)胞特異性配體的適配子)在內(nèi)的RNA的DNA，允許針對(duì)重組RNA雙鏈體的細(xì)胞特異性或組織特異性尋靶(targetting)。通過常用技術(shù)制備重組DNA構(gòu)建體，例如在標(biāo)題“制備和使用重組DNA構(gòu)建體”下描述的那些并示例于工作實(shí)施例。重組DNA構(gòu)建體尤其可用于制備非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、非天然轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因種子，如以下“轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物”中所討論。通過以下“微RNA誘騙序列”中詳述的替代方法可控制miRNA對(duì)其靶基因的作用。靶基因本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體可設(shè)計(jì)為抑制任何靶基因。靶基因可以是可翻譯(編碼)序列，或者可以是非編碼序列(例如非編碼的調(diào)節(jié)序列)或者這兩者，并且可包含至少一個(gè)選自以下的基因真核靶基因、非真核靶基因、微RNA前體DNA序列和微RNA啟動(dòng)子。靶基因?qū)τ谄渲兄亟MDNA構(gòu)建體可轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞(例如植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞)而言可以是天然(內(nèi)源)的，或者對(duì)于其中重組DNA構(gòu)建體可轉(zhuǎn)錄的動(dòng)植物的有害動(dòng)物或病原體而言可以是天然的。靶基因可以是外源基因，例如植物中的轉(zhuǎn)基因。靶基因可以是抑制所靶向的天然基因，有或沒有同時(shí)表達(dá)外源轉(zhuǎn)基因，例如通過在重組DNA構(gòu)建體或在分離的重組DNA構(gòu)建體中包含基因表達(dá)元件。例如，最好用外源轉(zhuǎn)基因同源物取代天然基因。靶基因可包含單個(gè)基因或單個(gè)基因的一部分(其可靶向抑制)、或者可包含例如靶基因的多個(gè)連續(xù)區(qū)段、靶基因的多個(gè)非連續(xù)區(qū)段、靶基因的多個(gè)等位基因或者來自一種或多種物種的多個(gè)靶基因。靶基因可包含來自任何物種(包括但不限于細(xì)菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，例如作物、觀賞植物和非馴化植物即野生植物；無脊椎動(dòng)物，例如節(jié)肢動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、線蟲和軟體動(dòng)物；和脊椎動(dòng)物，例如兩棲類、魚類、鳥類、馴化或野生哺乳動(dòng)物，甚至人)的任何序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶基因?qū)τ谄渲兄亟MDNA構(gòu)建體可轉(zhuǎn)錄的植物而言是外源的，但對(duì)于植物的有害動(dòng)物或病原體(例如病毒、細(xì)菌、真菌、卵菌和無脊椎動(dòng)物，其中無脊椎動(dòng)物例如昆蟲、線蟲和軟體動(dòng)物)而言是內(nèi)源的。靶基因可包含多個(gè)靶基因、或者一個(gè)或多個(gè)基因的多個(gè)區(qū)段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因是植物的無脊椎動(dòng)物害蟲或病原體基因。這些實(shí)施方案尤其可用于提供對(duì)一種或多種植物有害動(dòng)物或病原體具有抗性的非天然轉(zhuǎn)基因植物，例如，對(duì)線蟲(例如大豆胞囊線蟲或根結(jié)線蟲)的抗性或?qū)οx的抗性。靶基因可以是可翻譯(編碼)序列，或者可以是非編碼序列(例如非編碼的調(diào)節(jié)序列)或者這兩種。靶基因的非限制性實(shí)例包括非翻譯(非編碼)序列，例如但不限于5’非翻譯區(qū)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、或其它非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)、3’非翻譯區(qū)、終止子和內(nèi)含子。靶基因包括編碼以下RNA的基因微RNA、小干擾RNA、核糖體或核酶的RNA成分、核仁小RNA和其它非編碼RNA(參見例如在rfam.wustl.edu上為公眾提供的非編碼RNA序列；Erdmann等(2001)NucleicAcidsRes.,29189-193；Gottesman(2005)TrendsGenet.，21:399_404；Griffiths-Jones等(2005)NucleicAcidsRes.，33:121_124)。靴基因的一個(gè)具體實(shí)例包含微RNA識(shí)別位點(diǎn)(也就是說，在RNA鏈上的位點(diǎn)，該位點(diǎn)可結(jié)合成熟miRNA并誘導(dǎo)切割)。靶基因的另一個(gè)具體實(shí)例包含對(duì)非天然轉(zhuǎn)基因植物的有害動(dòng)物或病原體而言是天然的微RNA前體序列，也就是說，編碼微RNA的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物、或由該初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工而來的RNA中間產(chǎn)物(例如核局限的pri-miRNA或pre-miRNA，其可從核輸出至細(xì)胞質(zhì))。參見例如Lee等(2002)EMBOJournal,214663-4670；Reinhart等(2002)Genes&Dev.，16161611626；Lund等(2004)Science，303:95_98；和Millar和Waterhouse(2005)Funct.Integr.Genomics，5129-135。靶基因也可包含轉(zhuǎn)錄因子編碼基因和酶編碼基因的可翻譯(編碼)序列，所述酶參與目標(biāo)分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂質(zhì)、糖類和其它碳水化合物、生物聚合物和次級(jí)代謝物(包括生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級(jí)代謝物)的生物合成或分解代謝。在多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶基因是植物有害動(dòng)物或病原體的必需基因。必需基因包括有害動(dòng)物或病原體發(fā)育為能育的生殖成體所需要的基因。必需基因包含當(dāng)沉默或受到抑制時(shí)能導(dǎo)致生物體(作為成體或處于任何發(fā)育期，包括配子)死亡或者導(dǎo)致生物體無法成功繁殖(例如雄性或雌性親本不育或者合子、胚胎或幼蟲致死)的基因。有關(guān)線蟲必需基因的描述可參見例如Kemphues,K."EssentialGenes(必需基因)，，(2005年12月24日)，WormBook主編，TheC.eIegansResearchCommunity,WormBook,doi/10.1895/wormbook.1.57.1，可得自以下網(wǎng)址www.wormbook.org。線蟲必需基因的非限制性實(shí)例包括精子主要蛋白、RNA聚合酶II和幾丁質(zhì)合酶(參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書US20040098761Al)；額外的大豆胞囊線蟲必需基因在以下文獻(xiàn)中提供美國(guó)專利申請(qǐng)11/360,355(2006年2月23日申請(qǐng))，通過引用結(jié)合到本文中。有關(guān)昆蟲基因的描述公眾可從以下數(shù)據(jù)庫中得到果蠅基因組數(shù)據(jù)庫(Drosophilagenomedatabase，可得自以下網(wǎng)址flybase.bio.indiana.edu/)。已經(jīng)通過基于細(xì)胞培養(yǎng)的RNA干擾篩選，分析了大部分預(yù)測(cè)果蠅基因的功能，結(jié)果鑒定出438個(gè)必需基因；參見Boutros等(2004)Science,303:832_835，支持性材料可得自以下網(wǎng)址www.sciencemag.org/cgi/content/ful1/303/5659/832/DC1。有關(guān)細(xì)菌和真菌必需基因的描述可得自必需基因數(shù)據(jù)庫(DatabaseofEssentialGenes，簡(jiǎn)稱"DEG”，可得自以下網(wǎng)址tubic.tju.edu.cn/deg/)；參見Zhang等(2004)NucleicAcidsRes.,32:D271_D272。植物有害無脊椎動(dòng)物包括但不限于有害線蟲、有害軟體動(dòng)物(鼻涕蟲和蝸牛)。目標(biāo)植物病原體包括真菌、卵菌、細(xì)菌(例如引起葉斑病、枯萎病、冠癭病和細(xì)菌性萎蔫病的細(xì)菌)、柔膜細(xì)菌和病毒(例如引起花葉病、脈結(jié)病、斑駁(flecking)、斑點(diǎn)(spotting)或異常生長(zhǎng)的病毒)。另見G.N.Agrios，“PlantPathology”(第4版)，AcademicPress,SanDiego，1997，第635頁，對(duì)真菌、細(xì)菌、柔膜細(xì)菌(包括支原體和螺原體)、病毒、線蟲、寄生性高等植物和有鞭毛的原生動(dòng)物的有關(guān)描述，所有這些都是目標(biāo)植物有害動(dòng)物或病原體。另見由美國(guó)植物病理學(xué)會(huì)植物病害通用名稱標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CommitteeonStandardizationofCommoηNamesforPlantDiseasesofTheAmericanPhytopathologicalSociety)編寫的以下文獻(xiàn)中不斷更新的植物害蟲和病原體和病害名錄AmericanPhytopathologicalSociety“CommonNamesofPlantDiseases",CommitteeonStandardizationofCommonNamesforPlantDiseasesofTheAmericanPhytopathologicalSociety編，1978-2005,可得自以下網(wǎng)址:www.apsnet.org/online/common/top.asp。特別有興趣的真菌性植物病原體的非限制性實(shí)例包括例如引起以下病害的真菌白粉病、銹病、葉斑病和葉枯病、猝倒病、根腐病、頸腐病、棉鈴腐病、莖潰瘍病、樹枝潰瘍病(twigcanker)、維管萎蔫病(Vascularwilt)、黑穗病或霉病，包括但不限于鐮孢(Fusariumspp.)、層銹菌(Phakosporaspp.)、絲核菌(Rhizoctoniaspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)、赤霉(Gibberellaspp.)、梨抱(Pyriculariaspp.)禾口鏈格孢(Alternariaspp.)。真菌性植物病原體的具體實(shí)例包括豆薯層銹菌(Phakosporapachirhizi)(亞洲大豆銹病)、高粱柄銹菌(Pucciniasorghi)(玉米普通銹病)、多堆柄銹菌(Pucciniapolysora)(玉米南方銹病)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)禾口其它鐮抱(Fusariumspp·)、鏈格抱(Alternariaspp·)、青霉(Penicilliumspp·)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、大斑病突臍螺孢菌(Exserohilumturcicum)(玉米大斑病)、玉蜀黍雙極蠕孢(Bipolarismaydis(玉米小斑病)、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)(玉米黑粉病)、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)(玉米赤霉(Gibberellazeae))、輪狀鐮孢(Fusariumverticilliodes)(串珠狀赤霉(Gibberellamoniliformis))、±曾生鐮孢(F.proliferatum)(藤倉赤霉中間變種(G.fujikuroivar.intermedia))、半粘鐮孢(F.subglutinans)(半粘赤霉(G.subglutinans))、玉米色二孢(Diplodiamaydis)、絲軸團(tuán)散黑粉菌(Sporisoriumholci-sorghi)、禾生朿Ij盤抱(Colletotrichumgraminicola)、i；SE^it(Setosphaeriaturcica)(Aureobasidiumzeae)、_菜核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)以及美國(guó)專利6，194，636的表4和表5中提供的各種真菌種類，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。植物病原體的非限制性實(shí)例包括起先歸類為真菌、但最近歸類為卵菌的病原體。特別有興趣的卵菌性植物病原體的具體實(shí)例包括腐霉屬(Pythium)(例如瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum))和疫霉屬(Phytophthora)(例如致病疫霉(Phytophthorainfestans)、大豆疫霉(Phytophthorasojae))的成員和引起霜霉病的生物體(例如粉霜霉(Peronosporafarinosa))。細(xì)菌性病原體的非限制性實(shí)例包括引起黃化病的支原體和螺原體(例如引起玉米矮縮病的孔氏螺原體(Spiroplasmakunkelii))、真細(xì)菌例如燕麥假單胞胃(Pseudomonasavenae)>τ^IixIfilif(Pseudomonasandropogonis)>Εξ文氏菌(Erwiniastewartii)、丁香假單胞菌丁香致病變種(Pseudomonassyringaepv.syringae)、苛養(yǎng)木桿菌(Xylellafastidiosa)以及美國(guó)專利6，194，636的表3中所列舉的各種細(xì)菌種類，所述專利文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。特別有興趣的病毒性植物病原體的非限制性實(shí)例包括玉米矮縮花葉病毒(MDMV)、甘蔗花葉病毒(SCMV，以前稱為MDMVB株)、小麥條紋花葉病毒(WSMV)、玉米褪綠矮縮病毒(MCDV)、大麥黃矮病毒(BYDV)、香蕉簇頂病毒(BBTV)以及美國(guó)專利6，194，636的表2中所列舉的各種病毒，所述專利文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。無脊椎動(dòng)物害蟲的非限制性實(shí)例包括胞囊線蟲(Heteroderaspp.)尤其是大豆胞囊線蟲(Heteroderaglycines)、根結(jié)線蟲(Meloidogynespp·)、紐帶線蟲(Hoplolaimusspp.)、矮化線蟲(Tylenchorhynchusspp.)、螺旋線蟲(Helicotylenchusspp.)、根腐線蟲(短體線蟲(Pratylenchusspp·))、環(huán)線蟲(Criconemaspp·)、真滑刃線蟲(Aphelenchusspp.)或滑刃線蟲(Aphelenchoidesspp.)、玉米根蟲、盲蝽(Lygusspp.)、蚜蟲和類似吸食樹汁的昆蟲例如根瘤蚜(葡萄根瘤蚜(Daktulosphairavitifoliae))、玉米螟、切根蟲、粘蟲、葉蟬、日本金龜子、草蜢(蝗蟲)和其它有害鞘翅目、雙翅目和鱗翅目。無脊椎動(dòng)物害蟲的具體實(shí)例包括能夠侵染作物根系的害蟲，例如北方玉米根蟲(Diabroticabarberi)、艮&(Diabroticaundecimpunctata)λMy^iIS-^(Diabroticavirgifera)、玉米根蟲牙(Anuraphismaidiradicis)、黑色切根蟲(球菜夜蛾(Agrotisipsilon))、透翅緩夜蛾(Crymodesdevastator)、暗黑切根蟲(Fsltiaducens)、泥背切根蟲(Agrotisgladiaria)、金針蟲(Melanotusspp.,Aeolusmellillus)、小麥金針蟲(Aeolusmancus)、砂地金針蟲(Horistonotusuhlerii)、玉米象甲(Sphenophorusmaidis)、梯牧草象甲(Sphenophoruszeae)、早熟禾象甲(Sphenophorusparvulus)、南方玉米象甲(Sphenophoruscallosus)、M蟲曹(金龜子(Phyllophagaspp.))、玉米禾中蟲竜(灰地禾中蟲竜(Deliaplatura))、葡萄肖葉甲(Colaspisbrunnea)、玉米籽步甲(Stenolophuslecontei)和玉米籽細(xì)步甲(Cliviniaimpressifrons)，以及美國(guó)專利6，194，636的表6中所列舉的寄生性線蟲，所述專利文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。特別有興趣的無脊椎動(dòng)物害蟲，尤其是但不限于南半球地區(qū)(包括美洲中南部地區(qū))包括蚜蟲、玉米根蟲、貪夜蛾、夜蛾(noctuideae)、馬鈴薯瓢蟲、草盲蝽(Lygusspp.)、任何半翅目、同翅目或異翅目、任何鱗翅目、任何鞘翅目、線蟲、切根蟲、谷實(shí)夜蛾(earworms)、粘蟲、螟蟲、卷葉螟等。本發(fā)明具體涵蓋的節(jié)肢動(dòng)物害蟲包括各種切根蟲，包括切根蟲(Agrotisrepleta)、黑色切根蟲(球菜夜蛾(Agrotisipsilon))、切根蟲(Aniclaignicans)、?；懈x(Feltiasubterranea)、"gusanoaspero"(Agrotismalefida)；地中海粉螟(Anagastakuehniella)、方頸扁甲(Cathartusquadricollis)、跳甲(Chaetocnemaspp)、米蛾(Corcyracephalonica)、玉米根蟲或“vaquitadeSanAntonio，，(Diaboticaspeciosa)、甘蔴螟(Diatraeasaccharalis)、南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)、褐臭蟲舂(Euschistusspp.)、谷實(shí)夜蛾(Helicoverpazea)、扁平谷盜(Laemophloeusminutus)、稻毛脛夜蛾(Mocislatipes)、鋸谷盜(Oryzaephilussurinamensis)Λ紫斑谷蟲冥(Pyralisfarinalis)Λ貞谷蟲冥(Plodiainterpunctella)、玉米葉蟲牙(Rhopalosiphummaidis)、福土蟲舂(brownburrowingbug)或"chinchesubterranea"(Scaptocoriscastanea)、*二&蟲牙(Schizaphisgraminum)、米象(Sitophiluszeamais)、麥蛾(Sitotrogacerealella)、草地粘蟲(Spodopterafrugiperda)、大谷盜(Tenebroidesmauritanicus)、二斑卩十蟲葡(Tetranychusurticae)、赤擬谷盜(Triboleumcastaneum)、棉葉波紋夜蛾(Alabamaargillacea)、棉鈴象甲(Anthonomusgrandis)、豐帛蟲^(Aphisgossypii)Li^H(Bemisiatabaci)Λ^|ij5；(Frankliniellaspp·)、棉鈴蟲(谷實(shí)夜蛾(Helicoverpazea))、"orugabolillera，，(例如Helicoverpageletopoeon)、煙夜蛾(Heliothisvirescens)、禾§綠蟲舂Nezaraviridula)、棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)、舌甘菜夜蛾(Spodopteraexigua)、葉螨(Tetranychusspp·)、蔥薊馬(Thripstabaci)、溫室白粉風(fēng)(Trialeurodesvaporarium)、大豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、斑點(diǎn)玉米葉甲(spottedmaizebeetle)或“astilomoteado，，(Astylusatromaculatus)、“orugadelaalfalfa，，(Coliaslesbia)、"chinchemarr0n，，或"chinchedeIoscuernos，，(Dichelopsfurcatus)、”alquichechico”(Edessamiditabunda)Λblisterbeetles(Epicautaspp.)、"barrenadordelbrote，，(Epinotiaaporema)、"orugaverdedelyuyocolorado，，(Loxostegebifidalis)、根結(jié)線蟲、"orugacuarteadora，，(Mocisrepanda)、南方綠盲蟲舂(Nezaraviridula)、”chinchedelaalfalfa，，(Piezodorusguildinii)、苜猜綠夜蛾(Plathypenascabra)、大豆尺夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、尺夜蛾”isocamedidoradelgirasol，，(Rachiplusianu)、黃毛燈蛾(Spilosomavirginica)、黃條粘蟲(Spodopteraornithogalli)、各種象蟲(象蟲科(Curculionidae))、各種金針蟲(叩甲科(Elateridae))和各種蠐螬(金龜子科(Scarabaeidae))。本發(fā)明所具體包括的有害線蟲包括以下植物的有害線蟲玉米(針剌線蟲(Belonolaimusspp.)、毛剌線蟲(Trichodorusspp·)、長(zhǎng)針線蟲(Longidorusspp·)、維線蟲(Dolichodorusspp·)、優(yōu)線蟲(Anguinaspp.)、短體線蟲、根結(jié)線蟲、胞囊線蟲)、大豆(大豆胞囊線蟲、根結(jié)線蟲、針刺線蟲)、香蕉(相似穿孔線蟲(Radopholussimilis)、根結(jié)線蟲、螺旋線蟲)、甘蔗(甘蔗胞囊線蟲(Heteroderasacchari)、短體線蟲、根結(jié)線蟲)、橙子(半穿刺線蟲(Tylenchulusspp.)、穿孔線蟲(Radopholusspp.)、針刺線蟲、短體線蟲、劍線蟲(Xiphinemaspp·))、咖啡(根結(jié)線蟲、短體線蟲)、椰子(傘滑刃線蟲(Bursaphelenchusspp·))、番茄(根結(jié)線蟲、針刺線蟲、根瘤線蟲(Nacobbusspp.)、葡萄(根結(jié)線蟲、劍線蟲、半穿刺線蟲、小環(huán)線蟲(Criconemellaspp.)、檸檬和酸橙(半穿刺線蟲、穿孔線蟲、針刺線蟲、短體線蟲、劍線蟲、可可(根結(jié)線蟲、腎形小盤旋線蟲(Rotylenchulusreniformis)、菠蘿(根結(jié)線蟲、短體線蟲、腎形小盤旋線蟲、木瓜(根結(jié)線蟲、腎形小盤旋線蟲)、葡萄柚(半穿刺線蟲、穿孔線蟲、針刺線蟲、短體線蟲、劍線蟲)和蠶豆(根結(jié)線蟲)。來自有害動(dòng)物的靶基因可包括精子主要蛋白、α微管蛋白、β微管蛋白、液泡ATP酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、RNA聚合酶II、幾丁質(zhì)合酶、細(xì)胞色素、miRNA、miRNA前體分子、miRNA啟動(dòng)子等物質(zhì)的無脊椎動(dòng)物基因，以及其它基因例如以下文獻(xiàn)中公開的那些美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2006/0021087Al、PCT專利申請(qǐng)PCT/US05/11816和美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2004/0098761Al中的表II，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。來自病原體的靶基因可包括病毒翻譯起始因子、病毒復(fù)制酶、miRNA、miRNA前體分子、真菌微管蛋白、真菌液泡ATP酶、真菌幾丁質(zhì)合酶、真菌MAP激酶、真菌PaclTyr/Thr磷酸酶、參與營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸?shù)拿?例如氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)、參與真菌細(xì)胞壁生物合成的酶、角質(zhì)酶、黑素生物合成酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠酶、果膠裂合酶、纖維素酶、蛋白酶等物質(zhì)的基因，與植物無毒性基因相互作用的基因，以及其它參與病原體在受感染植物中的侵襲和復(fù)制的基因。因此，靶基因?qū)τ谄渲兄亟MDNA構(gòu)建體可轉(zhuǎn)錄的植物而言不一定是內(nèi)源的。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體可在植物中轉(zhuǎn)錄并用于抑制可侵染植物的病原體或有害動(dòng)物的基因。合適靶基因的具體的非限制性實(shí)例也包括氨基酸分解代謝基因(例如但不限于編碼賴氨酸-酮戊二酸還原酶(LKR)和酵母氨酸脫氫酶(SDH)的玉米LKR/SDH基因、及其同源物)、玉米醇溶蛋白基因、參與脂肪酸合成(例如植物微粒體脂肪酸去飽和酶和植物?；?ACP硫酯酶，例如但不限于美國(guó)專利號(hào)6，426，448,6,372，965和6，872，872公開的那些)的基因、參與多步生物合成途徑的基因，其中可能有興趣調(diào)節(jié)一種或多種中間產(chǎn)物的水平，例如編碼聚羥基鏈烷酸酯生物合成酶的基因(參見例如美國(guó)專利號(hào)5，750，848)；和編碼細(xì)胞周期控制蛋白的基因，例如編碼具有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑樣活性的蛋白質(zhì)的基因(參見例如在國(guó)際專利申請(qǐng)公布號(hào)W005007829A2中公開的基因)。靶基因可包括編碼不想要的蛋白質(zhì)(例如變應(yīng)原或毒素)的基因，或編碼不想要的化合物(例如不想要的味道或氣味成分)生物合成酶的基因。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是非天然轉(zhuǎn)基因植物或該植物的組織，該植物通過抑制變應(yīng)原性蛋白或毒素而得以改良，例如變應(yīng)原性降低的花生、大豆或小麥籽粒。靶基因可包括參與水果成熟的基因，例如多聚半乳糖醛酸酶的基因。靶基因可包括這樣的基因其表達(dá)優(yōu)選局限于特定細(xì)胞或組織或發(fā)育期，或者其表達(dá)優(yōu)選是瞬時(shí)的，也就是說，其中組成型或一般性抑制、或遍及許多組織的抑制，并非是想要的。因此，合適靶基因的其它實(shí)例包括蛋白質(zhì)編碼基因，當(dāng)其在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)，使得轉(zhuǎn)基因植物對(duì)有害動(dòng)物或病原體具有抗性(參見例如美國(guó)專利號(hào)5，763，245中公開的膽固醇氧化酶基因)；其表達(dá)受到有害動(dòng)物或病原體誘導(dǎo)的基因；和可誘導(dǎo)或恢復(fù)能育性的基因(參見例如美國(guó)專利號(hào)6，759，575所述的芽孢桿菌RNA酶抑制劑/芽孢桿菌RNA酶(barstar/barnase)基因)；本段落所引用的所有專利都通過引用全部結(jié)合到本文中。重組DNA構(gòu)建體可設(shè)計(jì)成對(duì)靶基因的抑制更具特異性，例如通過將重組DNA構(gòu)建體設(shè)計(jì)成編碼成熟miRNA，使其包含與非靶基因序列基本不相同(或不互補(bǔ))的區(qū)域。非靶基因可包含不會(huì)沉默或抑制的任何基因，無論是在含有重組DNA構(gòu)建體的植物中還是在可能接觸到重組DNA構(gòu)建體的生物體中。非靶基因序列可包含來自任何物種(包括但不限于細(xì)菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，例如作物、觀賞植物和非馴化植物即野生植物；無脊椎動(dòng)物，例如節(jié)肢動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、線蟲和軟體動(dòng)物；和脊椎動(dòng)物，例如兩棲類、魚類、鳥類、馴化或野生哺乳動(dòng)物，甚至人)的任何序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶基因?qū)τ诮o定物種而言是內(nèi)源基因，這些給定物種例如給定植物(例如但不限于農(nóng)業(yè)或商業(yè)上重要的植物，包括單子葉植物和雙子葉植物)，而非靶基因可以是例如非靶物種(例如另一種植物)的基因，或是病毒、真菌、細(xì)菌、無脊椎動(dòng)物或脊椎動(dòng)物、甚至人的基因。一個(gè)非限制性實(shí)例是這樣的其中重組DNA構(gòu)建體設(shè)計(jì)為抑制靶基因而不抑制非靶基因，該靶基因?qū)σ环N物種(例如西方玉米根蟲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte))而言是內(nèi)源基因，而該非靶基因是例如來自相關(guān)、甚至密切相關(guān)物種(例如北方玉米根蟲(DiabroticabarberiSmithandLawrence)或南方玉米IHji,(Diabroticaundecimpunctata))白勺―因。在其它實(shí)施方案(例如其中最好能抑制跨越多個(gè)物種的靶基因)中，最好能設(shè)計(jì)重組DNA構(gòu)建體，使其抑制這多個(gè)物種(在其中靶基因是沉默的)共同的靶基因序列。因此，可選擇對(duì)一個(gè)分類單元具有特異性(例如對(duì)一個(gè)屬、一個(gè)科或者甚至更大的分類單元(例如一個(gè)門，例如節(jié)肢動(dòng)物門)具有特異性)、但對(duì)其它分類單元(例如植物或脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物)不具特異性的RNA雙鏈體。在該實(shí)施方案的一個(gè)非限制性實(shí)例中，可選擇用于基因沉默的重組DNA構(gòu)建體，從而靶向致病真菌(例如鐮孢菌)，而不靶向來自有益真菌的任何基因序列。在該實(shí)施方案的另一個(gè)非限制性實(shí)例中，可選擇在玉米根蟲中用于基因沉默的重組DNA構(gòu)建體對(duì)葉甲屬(Diabrotica)所有成員具有特異性。在該實(shí)施方案的又一個(gè)實(shí)例中，可選擇這類靶向葉甲屬的重組DNA構(gòu)建體，使其不靶向來自有益鞘翅目(例如捕食性瓢蟲(coccinellidbeetle)，通常稱為瓢蟲)或其它有益昆蟲種類的任何基因序列。用于沉默靶基因的本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的所需特異性程度取決于各種因素。這些因素可包括重組DNA構(gòu)建體所編碼的成熟微RNA的大小和核酸序列、以及降低這種成熟miRNA對(duì)非靶基因的抑制潛力的相對(duì)重要性。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，當(dāng)預(yù)期這種成熟miRNA大小為21個(gè)堿基對(duì)時(shí)，一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括編碼成熟miRNA并用于沉默靶基因的DNA，其中成熟miRNA包含與非靶基因序列基本不相同的序列，例如與非靶基因序列的21個(gè)連續(xù)核苷酸只有少于18、或少于17、或少于16、或少于15的匹配。在某些實(shí)施方案中，最好設(shè)計(jì)用于沉默靶基因的重組DNA構(gòu)建體，使其包含預(yù)測(cè)不會(huì)產(chǎn)生不想要的多肽的區(qū)域，例如通過篩選重組DNA構(gòu)建體中的可編碼不想要多肽的序列或其密切同源物。不想要的多肽包括但不限于與已知變應(yīng)原性多肽同源的多肽和與已知多肽毒素同源的多肽。編碼這些不想要的潛在變應(yīng)原性肽的公眾可得的序列可得自例如食物變應(yīng)原研究禾口來源項(xiàng)目(FoodAllergyResearchandResourceProgram,FARRP)的變應(yīng)原數(shù)據(jù)庫(可得自allergenonline.com)或食品安全數(shù)據(jù)庫生物技術(shù)信；^(BiotechnologylnformationforFoodSafetyDatabases)(可得自www.iit.edu/sgendel/fa.htm)(另外參見例如Gendel(1998)Adv.FoodNutr.Res.,42:63_92)。不想要的序列也可包括例如注釋為已知毒素或潛在或已知變應(yīng)原并在例如以下公眾可得的數(shù)據(jù)庫中具有的多肽序列GenBank，EMBL，SwissProt等等，其可通過Entrez系統(tǒng)(www.ncbi.nih.gov/Entrez)來搜索。不想要的潛在變應(yīng)原性肽序列的非限制性實(shí)例包括大豆的大豆球蛋白，花生的油質(zhì)蛋白和凝集素，小麥的麥谷蛋白，牛乳的酪蛋白，乳清蛋白和乳球蛋白，以及各種貝類的原肌球蛋白(allergenonline.com)。不想要的潛在毒性肽的非限制性實(shí)例包括破傷風(fēng)梭菌(Clostridiumtetani)的破傷風(fēng)毒素tetA、金黃色葡萄球菌的腹瀉毒素、以及毒物(例如來自芋螺(Conusspp.)的芋螺毒素和來自節(jié)肢動(dòng)物和爬行動(dòng)物的神經(jīng)毒素(www.ncbi.nih.gov/Entrez)0在一個(gè)非限制性實(shí)例中，可篩選重組DNA構(gòu)建體，以消除編碼以下多肽的可轉(zhuǎn)錄序列，所述多肽與已知變應(yīng)原或毒素具有超過8個(gè)連續(xù)氨基酸的完美同源性，或者與超過至少80個(gè)氨基酸具有至少35%同一性；這樣的篩選可以在任何和所有可能讀框上以兩個(gè)方向進(jìn)行，在以AUG(在相應(yīng)DNA中為ATG)開頭的潛在可讀框上，或在所有可能讀框上，無論它們是否以AUG(或ATG)開頭。當(dāng)有“命中”或匹配時(shí)，也就是說，當(dāng)鑒別出編碼與已知變應(yīng)原或毒素具有超過8個(gè)連續(xù)氨基酸的完美同源性(或與超過至少80個(gè)氨基酸具有至少35%同一性)的潛在多肽的序列時(shí)，可避免、消除或修飾對(duì)應(yīng)于該命中的核酸序列，當(dāng)選擇序列用于RNA進(jìn)行沉默靶基因時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣設(shè)計(jì)重組DNA構(gòu)建體，使其不含以AUG(在相應(yīng)DNA中為ATG)開頭的潛在可讀框?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，來達(dá)到避免、消除或修飾不想要的序列。在某些情況下，結(jié)果可以是據(jù)信在自然界不存在的新的序列，例如，可通過將“干凈”序列一起連接成待用于RHA雙鏈體的新的嵌合序列，從而避免某些序列。申請(qǐng)人:知道，在某些微RNA介導(dǎo)的基因沉默中，不完美匹配的miRNA序列在基因沉默中可能是有效的。例如，已經(jīng)知道在鄰近miRNA互補(bǔ)位點(diǎn)中心的錯(cuò)配，比起更遠(yuǎn)位置的錯(cuò)配而言，對(duì)miRNA的基因沉默的影響更強(qiáng)一些。參見例如Mallory等(2004)EMB0J.,233356-3364中的圖4。在另一個(gè)實(shí)例中，已經(jīng)報(bào)道，錯(cuò)配堿基對(duì)的位置和形成錯(cuò)配的核苷酸特征，這兩者都影響給定siRNA沉默靶基因的能力，而且腺嘌呤-胞嘧啶錯(cuò)配，除了G:U擺動(dòng)堿基對(duì)之外，具有良好耐受性(參見Du等(2005)NucleicAcidsRes.,331671-1677)。因此，給定鏈的重組DNA構(gòu)建體不必與規(guī)定靶基因總是具有100%序列同一性，但一般會(huì)優(yōu)選與規(guī)定靶基因具有基本的序列同一性，例如與規(guī)定靶基因具有約95%、約90%、約85%或約80%序列同一性。對(duì)于互補(bǔ)性的描述，重組DNA構(gòu)建體的一條鏈優(yōu)選設(shè)計(jì)成與規(guī)定目標(biāo)(例如目標(biāo)信使RNA或目標(biāo)非編碼RNA)具有基本互補(bǔ)性，例如與規(guī)定目標(biāo)具有約95%、約90%、約85%或約80%互補(bǔ)性。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，在編碼21個(gè)核苷酸的成熟miRNA的重組DNA構(gòu)建體的情況下，所編碼的成熟miRNA可設(shè)計(jì)為與靶RNA的21個(gè)連續(xù)核苷酸基本、但并非完美互補(bǔ)；優(yōu)選位置21的核苷酸與靶RNA中的相應(yīng)位置不配對(duì)，以避免傳遞性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能判斷，相對(duì)于其它標(biāo)準(zhǔn)的重要性而言，篩選預(yù)測(cè)對(duì)靶基因具有更高特異性或預(yù)測(cè)不產(chǎn)生不想要的多肽的區(qū)域的重要性，所述其它標(biāo)準(zhǔn)例如但不限于與規(guī)定靶基因具有的％序列同一性或預(yù)測(cè)給定序列的基因沉默效率。例如，編碼成熟miRNA的本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體可設(shè)計(jì)為在若干物種中都具有活性，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定，在重組DNA構(gòu)建體中包含編碼對(duì)若干目標(biāo)物種具有特異性的成熟miRNA的DNA更為重要，而篩選預(yù)測(cè)具有更高基因沉默效率的區(qū)域或篩選預(yù)測(cè)能產(chǎn)生不想要的多肽的區(qū)域則沒那么重要。啟動(dòng)子通常，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體包含在植物細(xì)胞起作用、并與可轉(zhuǎn)錄DNA元件操作性連接的啟動(dòng)子。在不同實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、空間特異性啟動(dòng)子、時(shí)間特異性啟動(dòng)子、發(fā)育特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。適用于本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的非組成型啟動(dòng)子包括空間特異性啟動(dòng)子、時(shí)間特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?？臻g特異性啟動(dòng)子可包括細(xì)胞器特異性啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或器官特異性啟動(dòng)子(例如質(zhì)體特異性啟動(dòng)子、根特異性啟動(dòng)子、花粉特異性啟動(dòng)子或種子特異性啟動(dòng)子，用于分別抑制第一靶RNA在質(zhì)體、根部、花粉或種子中的表達(dá))。在許多情況下，種子特異性啟動(dòng)子、胚特異性啟動(dòng)子、糊粉特異性啟動(dòng)子或胚乳特異性啟動(dòng)子尤為有用。時(shí)間特異性啟動(dòng)子可包括在植物生長(zhǎng)周期的某些發(fā)育階段期間、或在不同晝夜時(shí)間中、或在一年的不同季節(jié)中能啟動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括由例如但不限于以下生物脅迫或非生物脅迫的化學(xué)物或環(huán)境條件誘導(dǎo)的啟動(dòng)子例如缺水即干旱、熱、冷、高或低營(yíng)養(yǎng)或鹽水平、高或低光照水平、或者有害動(dòng)物或病原體侵染。表達(dá)特異性動(dòng)子也可包括通常為組成型表達(dá)、但以不同程度或“強(qiáng)度”表達(dá)的啟動(dòng)子，包括通常認(rèn)為是“強(qiáng)啟動(dòng)子”或“弱啟動(dòng)子”的啟動(dòng)子。特別有興趣的啟動(dòng)子包括以下非限制性實(shí)例從土壤桿菌(Agrobacterium)T-DNA分離的章魚堿(opaline)合酶啟動(dòng)子；花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；增強(qiáng)型啟動(dòng)子元件或嵌合啟動(dòng)子元件，例如連接增強(qiáng)子元件(來自玉米熱激蛋白70的內(nèi)含子)的增強(qiáng)型花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子；根特異性啟動(dòng)子，例如美國(guó)專利5，837，848；6，437，217和6，426，446中公開的那些；美國(guó)專利6，433，252中公開的玉米L3油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子；美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2004/0216189中公開的用于編碼質(zhì)體局限性醛縮酶的植物核基因的啟動(dòng)子；美國(guó)專利6，084，089中公開的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專利號(hào)6，140，078中公開的鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專利6，294，714中公開的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；美國(guó)專利6，252，138中公開的病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；和美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2004/0123347A1中公開的缺水誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，所有上述專利和專利公布說明書公開的啟動(dòng)子及其應(yīng)用，尤其是在植物中的重組DNA構(gòu)建體功能，所述文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中。啟動(dòng)子元件可包括并非天然啟動(dòng)子或啟動(dòng)子元件或其同源物、但可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的核酸序列。這類“基因獨(dú)立性”調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括天然存在的RNA序列或人工設(shè)計(jì)的RNA序列，其可包含配體結(jié)合區(qū)或適配子和調(diào)節(jié)區(qū)(其可以是順式作用的)。參見例如Isaacs等(2004)Nat.Biotechnol.，22:841_847;Bayer和Smolke(2005)NatureBiotechnol.,23:337_343；Mandal禾口Breaker(2004)NatureRev.Mol.CellBiol.，5451-463；Davidson禾口Ellington(2005)TrendsBiotechnol.,23109-112；Winkler等(2002)Nature，419:952-956;Sudarsan等(2003)RNA，9:644_647；禾口Mandal禾口Breaker(2004)NatureStruct.Mol.Biol.,11:29_35。可選擇或設(shè)計(jì)這些“核糖核酸調(diào)節(jié)物(riboregulator)”具體的空間或時(shí)間特異性，例如僅在給定濃度的合適配體存在(或不存在)時(shí)才調(diào)節(jié)外源基因的翻譯。制備和使用重組DNA構(gòu)津體可通過適合預(yù)定用途的任何方法來制備本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體，考慮到例如所需表達(dá)類型和在構(gòu)建體用來轉(zhuǎn)錄的植物中使用的方便性。制備和使用DNA構(gòu)建體和載體的通用方法是本領(lǐng)域眾所周知的，詳述于例如包括以下在內(nèi)的手冊(cè)和實(shí)驗(yàn)室指南=Sambrook和Russell,"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，(第3版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,20010構(gòu)建DNA構(gòu)建體和載體并用于轉(zhuǎn)化的有用技術(shù)的實(shí)例公開于美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2004/0115642A1，通過引用結(jié)合到本文中。也可使用GATEWAY克隆技術(shù)(可得自InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)來構(gòu)建DNA構(gòu)建體，該技術(shù)使用來自噬菌體λ載體構(gòu)建的整合酶(Integrase)Aitt系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性重組酶LR克隆反應(yīng)，代替限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶。LR克隆反應(yīng)公開于美國(guó)專利5，888，732和6，277，608和美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2001/283529,2001/282319和2002/0007051，所有這些文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中。GATEWAY克隆技術(shù)指導(dǎo)手冊(cè)(也由Invitrogen提供)提供了將任何所需DNA常規(guī)克隆到含有可操作植物表達(dá)元件的載體中的簡(jiǎn)明指導(dǎo)。另一種載體構(gòu)建的替代方法使用不依賴連接的克隆，如以下文獻(xiàn)所公開=Aslandis等(1990)NucleicAcidsRes.，18:6069_6074和Rashtchian等(1992)Biochem.，206:91_97，其中將具有單鏈5’端和3’端的DNA片段連接到所需載體中，然后可以在體內(nèi)擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體的DNA序列包含對(duì)于植物已經(jīng)經(jīng)過密碼子優(yōu)化的序列，其中重組DNA構(gòu)建體在所述植物中表達(dá)。例如，可通過本領(lǐng)域已知方法，使在植物中表達(dá)的重組DNA構(gòu)建體具有經(jīng)密碼子優(yōu)化的所有或部分序列(例如第一基因抑制元件或基因表達(dá)元件)，用于在植物中表達(dá)。參見例如美國(guó)專利5，500,365中有關(guān)植物密碼子優(yōu)化的描述，通過引用結(jié)合到本文中；另見DeAmicis和Marchetti(2000)NucleicAcidsRes.,28:3339-3346。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物本發(fā)明另一方面提供非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包含本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體，如以上標(biāo)題“重組DNA構(gòu)建體”下所述。還提供含有本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的非天然轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物包括任何發(fā)育期的植物，并包括由本文所公開的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物或再生植物的后代植物(其可以是近交或雜交后代植物)、或這類轉(zhuǎn)基因植物的種子。也提供并要求保護(hù)在其基因組中具有本發(fā)明所提供的重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因種子?？赏ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的方法制備本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、非天然轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因種子，如以下標(biāo)題“制備和使用非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和非天然轉(zhuǎn)基因植物”下所述。非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可包括分離的植物細(xì)胞(例如單獨(dú)的植物細(xì)胞或在人工培養(yǎng)基中或人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞)，或可包括未分化組織(例如愈傷組織或任何聚集的植物細(xì)胞)中的植物細(xì)胞。非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可包括至少一種分化組織中的植物細(xì)胞，所述分化組織選自葉(例如葉柄和葉片)、根、莖(例如塊莖、根狀莖、匍匐莖、鱗莖和球莖)、莖稈(例如木質(zhì)部、韌皮部)、木材、種子、果實(shí)(例如堅(jiān)果、谷物、肉質(zhì)果)和花(例如雄蕊、花絲、花藥、花粉、心皮、雌蕊、子房、胚珠)。本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或非天然轉(zhuǎn)基因植物可以是任何合適的目標(biāo)植物細(xì)胞或植物。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞都包含在本發(fā)明之內(nèi)。特別優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。在多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非天然轉(zhuǎn)基因植物是可收獲種子的能育的轉(zhuǎn)基因植物，而且本發(fā)明還要求保護(hù)這些轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子，其中種子優(yōu)選也含有本發(fā)明的重組構(gòu)建體。制備和使用非天然轉(zhuǎn)基因棺物細(xì)胞和非天然轉(zhuǎn)基因棺物盡管本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體用于產(chǎn)生本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、非天然轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因種子，但轉(zhuǎn)化可包括任何眾所周知的并已證明的方法和組成。用于植物轉(zhuǎn)化的合適方法其實(shí)包括將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的任何方法，例如通過直接遞送DNA(例如通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、通過電穿孔、通過用碳化硅纖維攪拌、以及通過DNA包被顆粒加速(accelerationofDNAcoatedparticles))、通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、通過病毒或其它載體等。一種植物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法是微彈轟擊，例如以下文獻(xiàn)所述美國(guó)專利5，015，580(大豆)、5，550，318(玉米)、5，538，880(玉米)、6，153，812(小麥)、6，160，208(玉米)、6，288，312(水稻)和6，399，861(玉米)和6，403，865(玉米)，所有這些文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中。植物轉(zhuǎn)化的另一種優(yōu)選方法是土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可通過含二元Ti質(zhì)粒系統(tǒng)的土壤桿菌轉(zhuǎn)化的方法，得到本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中土壤桿菌攜帶第一Ti質(zhì)粒和含有野生型Ti質(zhì)粒的至少一個(gè)T-DNA邊界的第二嵌合質(zhì)粒、在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中具有功能并與本發(fā)明基因抑制構(gòu)建體操作性連接的啟動(dòng)子。參見例如美國(guó)專利5，159，135所述的二元系統(tǒng)，通過引用結(jié)合到本文中。另見DeFramond(1983)Biotechnology,1262~269；和Hoekema等，(1983)Nature,303:179。在這樣的二元系統(tǒng)中，可在合適的替代宿主(例如大腸桿菌)中方便地構(gòu)建含有T-DNA邊界的較小質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)移至土壤桿菌中。用于土壤桿菌介導(dǎo)的植物(尤其是作物)轉(zhuǎn)化的具體方法包括例如以下文獻(xiàn)中公開的方法美國(guó)專利5,004,863,5,159，135和5，518，908(棉花)；5，416，011、5，569，834、5，824，877和6，384，301(大豆)；5，591，616和5，981，840(玉米)；5,463,174(蕓薹屬)和美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2004/0244075(玉米)，所有這些文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中。對(duì)于以下雙子葉植物和單子葉植物等許多植物而言都報(bào)道了類似方法花生(Cheng等(1996)PlantCellRep.,15653)；蘆筍(Bytebier等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,845345)；大麥(Wan和Lemaux(1994)PlantPhysiol.，10437)；水稻(Toriyama等(1988)Bio/Technology,610；Zhang等(1988)PlantCellRep.，7379；小麥(Vasil等(1992)Bio/Technology,10667；Becker等(1994)PlantJ.，5299),苜蓿(Masoud等(1996)Transgen.Res.，5313)；和番茄(Sun等(2006)PlantCellPhysiol.,47:426_431)。另見美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2003/0167537A1中有關(guān)轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsisthaliana)植物的載體、轉(zhuǎn)化方法和生產(chǎn)的描述，其中轉(zhuǎn)錄因子由CaMV35S啟動(dòng)子組成型表達(dá)，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。也可通過用其它載體的轉(zhuǎn)化而得到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物，所述其它載體例如但不限于病毒載體(例如煙草蝕紋病毒(tobaccoetchpotyvirus，TEV)、大麥條狀花葉病毒(BSMV)、以及Edwardson和Christie(〃ThePotyvirusGroup:MonographNo.16,1991,Agric.Exp.Station,Univ.ofFlorida)中所述的有關(guān)病毒、質(zhì)粒、粘粒、YAC(酵母人工染色體)、BAC(細(xì)菌人工染色體)或任何其它合適的克隆載體，當(dāng)用于例如以下合適轉(zhuǎn)化方案時(shí)細(xì)菌感染(例如用如上所述的土壤桿菌)、二元細(xì)菌人工染色體構(gòu)建體、DNA的直接遞送(例如通過PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、脫水/抑制介導(dǎo)的DNA攝取、電穿孔、用碳化硅纖維攪拌和微彈轟擊)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，各種轉(zhuǎn)化方法都可用于或經(jīng)修改用于自許多目標(biāo)植物物種產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選在組織培養(yǎng)基和受控環(huán)境中實(shí)施能提供含穩(wěn)定整合的重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化方法。“培養(yǎng)基”是指用于在體外(即在完整的活生物體之外)培養(yǎng)細(xì)胞的多種營(yíng)養(yǎng)混合物。受體細(xì)胞靶標(biāo)包括但不限于分生組織細(xì)胞、愈傷組織、未成熟胚或部分胚、以及配子細(xì)胞例如小孢子、花粉、精子和卵細(xì)胞?？稍偕鸀槟苡参锏娜魏渭?xì)胞都可作為有用的受體細(xì)胞，用于本發(fā)明的實(shí)踐。愈傷組織可來自各種組織來源，包括但不限于未成熟胚或部分胚、幼苗頂端分生組織、小孢子等。能夠增殖為愈傷組織的這些細(xì)胞可作為受體細(xì)胞，用于遺傳轉(zhuǎn)化。用于制備本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)用的轉(zhuǎn)化方法和材料(例如各種培養(yǎng)基和受體靶細(xì)胞、未成熟胚的轉(zhuǎn)化、以及其后的能育轉(zhuǎn)基因植物的再生)都公開于例如美國(guó)專利6，194，636和6，232，526和美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2004/0216189，通過引用結(jié)合到本文中。轉(zhuǎn)基因植物包括轉(zhuǎn)基因植物組織或部分，例如轉(zhuǎn)基因砧木或轉(zhuǎn)基因嫁接或接穗材料，其可與非轉(zhuǎn)基因植物組織或部分組合使用。在通常的轉(zhuǎn)化實(shí)踐中，在任何一個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，DNA僅能導(dǎo)入到少量靶細(xì)胞中。標(biāo)記基因通常用于提供鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的有效系統(tǒng)，這樣的細(xì)胞是通過接受轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體并將它整合到其基因組中而得到的。優(yōu)選的標(biāo)記基因提供賦予選擇劑(例如抗生素或除草劑)抗性的選擇標(biāo)記。植物細(xì)胞對(duì)其具有抗性的任何抗生素或除草劑都可以是有用的選擇劑。使?jié)撛诘霓D(zhuǎn)化細(xì)胞接觸選擇劑。在存活細(xì)胞群體中的細(xì)胞就是賦予抗性的基因整合并以允許細(xì)胞存活的足夠量表達(dá)的細(xì)胞。還可進(jìn)一步測(cè)定細(xì)胞，以證實(shí)重組DNA的穩(wěn)定整合。常用的選擇標(biāo)記基因包括賦予抗生素抗性或除草劑抗性的基因，這些抗生素例如卡那霉素或巴龍霉素(nptll)、潮霉素B(aphIV)和慶大霉素(aac3和aacC4)，這些除草劑例如草銨膦(bar或pat)和草甘膦(EPSPS)。有用的選擇標(biāo)記基因和選擇劑的實(shí)例可參見美國(guó)專利5，550，318,5,633，435,5,780，708和6，118，047，所有這些文獻(xiàn)都通過引用結(jié)合到本文中。也可使用篩選標(biāo)記或報(bào)道基因，例如提供可目測(cè)鑒定轉(zhuǎn)化子的能力的標(biāo)記。有用的篩選標(biāo)記的非限制性實(shí)例包括例如表達(dá)這樣的蛋白質(zhì)的基因該蛋白質(zhì)通過作用于發(fā)色底物(例如葡糖醛酸糖苷酶(GUS)(uidA)或螢光素酶(luc))而產(chǎn)生可檢測(cè)顏色，或者它自身是可檢測(cè)的，例如綠色熒光蛋白(GFP)(gfp)或免疫原性分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道，許多其它有用標(biāo)記或報(bào)道基因都可使用。重組構(gòu)建體在本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄而表達(dá)靶基因(或同時(shí)表達(dá)目標(biāo)基因)，可通過蛋白質(zhì)檢測(cè)方法(例如蛋白質(zhì)印跡、ELISA和其它免疫化學(xué)方法)、酶活性測(cè)定或核酸檢測(cè)方法(例如DNA印跡、RNA印跡、PCR、RT-PCR、熒光原位雜交)等任何合適的方法，來檢測(cè)或測(cè)定所述靶基因表達(dá)上的變化。根據(jù)大量可用的手冊(cè)，這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的；參見例如Jos印hSambrook和Davidff.Russell,"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，(第3版)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,2001；FrederickM.Ausubel^(lle^)"ShortProtocolsinMolecularBiology"(H5版)JohnWiley和Sons，2002JohnM.Walker(編著)“ProteinProtocolsHandbook，，(第2片反),HumanaPress,2002；禾口LeandroPena(編著)“TransgenicPlants:MethodsandProtocols，，，HumanaPress,2004。重組DNA在本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄而表達(dá)靶基因(或同時(shí)表達(dá)目標(biāo)基因)，還可通過其它合適的方法來檢測(cè)或測(cè)定所述靶基因表達(dá)上的變化，包括測(cè)定能直接或間接指示靶基因在重組DNA可轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)基因植物(相對(duì)于不轉(zhuǎn)錄重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物)中的表達(dá)(或目標(biāo)基因的同時(shí)表達(dá))的任何其它性狀，例如總體或顯微形態(tài)學(xué)性狀、生長(zhǎng)率、產(chǎn)量、生殖或補(bǔ)充(recruitment)率、對(duì)有害動(dòng)物或病原體的抗性、或?qū)ι锘蚍巧锩{迫(例如缺水脅迫、鹽脅迫、營(yíng)養(yǎng)脅迫、熱或冷脅迫)的耐性。這些方法可用于直接測(cè)定表型性狀或間接測(cè)定(例如在植物中，這些測(cè)定包括植物部分測(cè)定例如葉或根的測(cè)定，以測(cè)定非生物脅迫耐性)。通過例如表達(dá)或抑制其它基因，可將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體與賦予額外性狀(例如就轉(zhuǎn)化植物而言，包括除草劑抗性、抗蟲性、低溫發(fā)芽耐性、缺水耐性等性狀)的其它重組DNA疊加在一起(stack)。用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)增減的構(gòu)建體公開于美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2004/0126845A1，通過引用結(jié)合到本文中?？墒斋@能育轉(zhuǎn)基因植物的種子并用于培育后代，包括在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物的雜交后代。因此，除了用重組DNA構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化植物之外，可通過將具有重組DNA的第一植物與缺乏構(gòu)建體的第二植物雜交，制備本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物。例如，可將重組DNA導(dǎo)入適于轉(zhuǎn)化的植物系中以產(chǎn)生非天然轉(zhuǎn)基因植物，其可與第二植物系雜交，將重組DNA漸滲入所得后代中?？蓪y帶一個(gè)重組DNA(導(dǎo)致靶基因表達(dá)變化)的本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物與具有賦予一種或多種額外性狀(例如但不限于除草劑抗性、抗蟲性或抗病性、環(huán)境脅迫抗性、營(yíng)養(yǎng)含量改變和產(chǎn)量提高)的其它重組DNA的植物系雜交，產(chǎn)生具有同時(shí)賦予所需靶序列表達(dá)行為和額外性狀的重組DNA的后代植物。通常，在合并性狀的育種中，提供額外性狀的轉(zhuǎn)基因植物是雄性品系，而攜帶基礎(chǔ)性狀的轉(zhuǎn)基因植物是雌性品系。這種雜交后代發(fā)生分離，使得某些植物攜帶同時(shí)具有雙親性狀的DNA，而某些只攜帶一方親本性狀的DNA；可通過與親本重組DNA締合的標(biāo)記來鑒定這類植物?？蓪y帶同時(shí)具有雙親性狀的DNA的后代植物與雌性親本系多次回交，例如通常6-8代，產(chǎn)生具有與一個(gè)原始轉(zhuǎn)基因親本系基本相同的基因型的后代植物，如果沒有其它轉(zhuǎn)基因親本系的重組DNA的話。本發(fā)明的再一方面是自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因種子培育而來的非天然轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明涵蓋自含有重組DNA的轉(zhuǎn)基因種子直接培育而來的非天然轉(zhuǎn)基因植物以及植物后代，包括近交或雜交植物系，其通過將自轉(zhuǎn)基因種子直接培育而來的轉(zhuǎn)基因植物與并非由同一轉(zhuǎn)基因種子培育而來的第二植物雜交而制備。雜交可包括例如以下步驟(a)按照本發(fā)明，種植第一親本植物(例如非轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因)和轉(zhuǎn)基因的第二親本植物的種子；(b)將第一和第二親本植物的種子培育為長(zhǎng)花的植物；(c)用第二親本的花粉給第一親本的花授粉；和(d)在攜帶能育花的親本植物上收獲長(zhǎng)出的種子。最好是將重組DNA漸滲入原種中，例如通過回交，將一個(gè)來源的特定所需性狀轉(zhuǎn)移到缺乏該性狀的近交或其它植物中。這可通過例如以下步驟來完成將優(yōu)良近交系(“A”)(回歸親本)與攜帶具有目標(biāo)性狀的合適基因(例如按照本發(fā)明制備的構(gòu)建體)的供體近交系(“B”)(非回歸親本)第一次雜交。在第一次雜交的所得后代中選出具有從非回歸親本“B”轉(zhuǎn)移的所需性狀的后代，所選后代再與優(yōu)良回歸親本“A”回交。經(jīng)過選擇所需性狀的5代以上回交后，后代在控制所轉(zhuǎn)移性狀的基因座上是半合子，但在大多數(shù)或幾乎所有其它基因上都類似于優(yōu)良親本?；亟坏牡淖詈笠淮约荷L(zhǎng)出的后代，對(duì)所轉(zhuǎn)移(即一次或多次轉(zhuǎn)化事件)的基因而言是純系。經(jīng)過一序列育種操縱，所選DNA構(gòu)建體可從一個(gè)品系移至完全不同的另一品系，而無需進(jìn)一步重組操縱。因此可產(chǎn)生近交植物，其可真實(shí)育種用于一個(gè)或多個(gè)DNA構(gòu)建體。通過將不同近交植物雜交，可得到具有不同DNA構(gòu)建體組合的大量不同雜種。按照這種方式，可產(chǎn)生具有通常與雜交有關(guān)的所需農(nóng)藝學(xué)特性(“雜交優(yōu)勢(shì)”)以及由一種或多種DNA構(gòu)建體賦予的所需特性的植物。遺傳標(biāo)記可用于幫助將本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)DNA構(gòu)建體從一個(gè)遺傳背景漸滲到另一個(gè)。相對(duì)于常規(guī)育種而言，有助于選擇的標(biāo)記具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗捎糜诒苊庖虮硇妥儺惗鸬腻e(cuò)誤。此外，遺傳標(biāo)記可提供數(shù)據(jù)，無論原種種質(zhì)(elitegermplasm)在具體雜交的單個(gè)后代中的相對(duì)程度如何。例如，當(dāng)具有所需性狀并具有非農(nóng)藝學(xué)所需遺傳背景的植物與原種親本雜交時(shí)，遺傳標(biāo)記可用于選擇不僅具有目標(biāo)性狀、而且具有相當(dāng)大比例的所需種質(zhì)的后代。這樣，將一種或多種性狀的基因漸滲到特定遺傳背景所需的傳代次數(shù)最小。采用標(biāo)記有助于在本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物的育種中進(jìn)行選擇，有用的分子標(biāo)記的種類例如但不限于SSR和SNP，可參見PCT申請(qǐng)公布說明書W002/062129和美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2002/0133852,2003/0049612和2003/0005491，各自通過引用全部結(jié)合到本文中。在某些本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和非天然轉(zhuǎn)基因植物中，最好同時(shí)表達(dá)(或抑制)目標(biāo)基因，同時(shí)也調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。因此，在某些實(shí)施方案中，非天然轉(zhuǎn)基因植物含有重組DNA，所述重組DNA還包含基因表達(dá)(或抑制)元件，用于表達(dá)至少一個(gè)目標(biāo)基因，而靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)優(yōu)選受到至少一個(gè)目標(biāo)基因在轉(zhuǎn)基因植物中同時(shí)表達(dá)(或抑制)的影響。因此，如本文所述，通過采用本領(lǐng)域已知的或本文所公開的任何合適的瞬時(shí)或穩(wěn)定、整合或非整合的轉(zhuǎn)化方法，可得到本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或非天然轉(zhuǎn)基因植物。重組DNA構(gòu)建體可在任何植物細(xì)胞或組織中或者在完整植物的任何發(fā)育期轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)基因植物可來自任何單子葉植物或雙子葉植物，例如但不限于具有商業(yè)或農(nóng)業(yè)價(jià)值的植物，例如作物(尤其是作為人類食物或動(dòng)物飼料的作物)、生產(chǎn)木材或紙漿的樹木、蔬菜植物、水果植物和觀賞植物。目標(biāo)植物的非限制性實(shí)例包括谷類作物(例如小麥、燕麥、大麥、玉米、黑麥、小黑麥、水稻、稷、高粱、奎藜籽(quinoa)、莧菜和蕎麥)；飼料作物(例如飼用禾草和飼用雙子葉植物，包括苜蓿、野豌豆、三葉草等)；油料作物(例如棉花、紅花、向日葵、大豆、甘蘭型油菜(亦稱雙低油菜，canola)、白菜型油菜(rapeseed)、亞麻、花生和油棕)；樹堅(jiān)果(例如核桃、腰果、榛子、山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、棗椰、橄欖、甜菜、茶和咖啡；木材用樹或紙漿用樹；蔬菜作物例如豆類(例如菜豆、豌豆、兵豆、苜蓿、花生)、萵苣、蘆筍、朝鮮薊、芹菜、胡蘿卜、蘿卜、蕓薹類(例如甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、芥菜和其它葉用蕓薹類、椰菜、花椰菜、孢子甘藍(lán)、蕪菁、球莖甘藍(lán))、食用葫蘆科類(例如黃瓜、甜瓜、夏西葫蘆、冬西葫蘆)、食用蔥屬(例如洋蔥、大蒜、韭菜、火蔥、細(xì)香蔥)、茄科(Solanaceae)的食用成員(例如番茄、茄子、馬鈴薯、辣椒、燈籠果(groundcherry))、和藜科(Chenopodiaceae)的食用成員(例如甜菜、牛皮菜、菠菜、奎藜籽、莧菜)；水果作物例如蘋果、梨、柑橘類水果(例如橙子、酸橙、檸檬、葡萄柚等)、核果類(例如杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠蘿、葡萄、獼猴桃、木瓜、鱷梨和漿果類；和觀賞植物，包括觀賞用花卉植物、觀賞用喬木和灌木、觀賞用地被植物和觀賞草。優(yōu)選的雙子葉植物包括但不限于甘蘭型油菜、椰菜、甘藍(lán)、胡蘿卜、花椰菜、白菜、黃瓜、干豆類、茄子、茴香、四季豆、葫蘆、萵苣、甜瓜、秋葵、豌豆、辣椒、西葫蘆(pumpkin)、蘿卜、菠菜、南瓜(squash)、西瓜、棉花、馬鈴薯、奎藜籽、莧菜、蕎麥、紅花、大豆、甜菜和向日葵。優(yōu)選的單子葉植物包括但不限于小麥、燕麥、大麥、玉米(包括甜玉米和其它品種)、黑麥、小黑麥、水稻、觀賞用禾草和飼用禾草、高粱、稷、洋蔥、韭菜和甘蔗，更優(yōu)選玉米、小麥和水稻。植物轉(zhuǎn)化的最終目標(biāo)是得到對(duì)人類有用的植物。就此而言，本發(fā)明的非天然轉(zhuǎn)基因植物可用于對(duì)生產(chǎn)者或消費(fèi)者視為有價(jià)值的任何實(shí)際目的。例如，人們可以希望收獲轉(zhuǎn)基因植物本身，或收獲轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子(用于種植)，或者可以用轉(zhuǎn)基因植物或其種子來生產(chǎn)各種產(chǎn)品，例如油、淀粉、乙醇或其它發(fā)酵產(chǎn)品、動(dòng)物飼料或人類食物、醫(yī)藥和各種工業(yè)產(chǎn)品。例如，玉米可廣泛用于食品及飼料業(yè)、以及工業(yè)應(yīng)用。有關(guān)玉米用途的進(jìn)一步討論可參見例如美國(guó)專利號(hào)6，194，636,6,207，879,6,232，526,6,426，446,6,429，357、6，433，252,6,437，217和6，583，338，通過引用結(jié)合到本文中，以及PCT公布說明書TO95/06128和W002/057471。因此，本發(fā)明也提供由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物或種子制備而來的商品，包括但不限于收獲的葉、根、苗、塊莖、莖、果實(shí)、種子或其它植物部分、食物、油類、提取物、發(fā)酵或消化產(chǎn)物、碾碎或完整的谷物或植物種子、或任何食品或非食品(包含由本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物或種子制備而來的商品)。本文所涵蓋的對(duì)一種或多種商品中本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)核酸序列的檢測(cè)，是該商品含有或源自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物或種子的實(shí)際證據(jù)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，相對(duì)于缺乏重組DNA構(gòu)建體的植物而言，由本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的非天然轉(zhuǎn)基因植物(即在其基因組中含有本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物)具有至少一個(gè)額外改變的性狀，其選自以下性狀(a)提高非生物脅迫耐性；(b)提高生物脅迫耐性；(c)改變初級(jí)代謝產(chǎn)物組成；(d)改變次級(jí)代謝產(chǎn)物組成；(e)改變微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(f)提高產(chǎn)量；(g)提高氮或其它營(yíng)養(yǎng)物的利用能力；(h)改變農(nóng)藝學(xué)特性；(i)改變生長(zhǎng)或生殖特性；和(j)提高收獲、貯存或加工品質(zhì)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，非天然轉(zhuǎn)基因植物的特性是提高對(duì)非生物脅迫的耐性(例如對(duì)缺水或干旱、熱、冷、非優(yōu)化營(yíng)養(yǎng)或鹽水平、非優(yōu)化光照水平的耐性)或者對(duì)生物脅迫(例如擁擠、異株克生作用或受傷)的耐性；改變初級(jí)代謝產(chǎn)物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖或碳水化合物)組成；改變次級(jí)代謝產(chǎn)物(例如生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級(jí)代謝物)組成；改變微量元素(例如鐵、鋅)、類胡蘿卜素(例如胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)或其它類胡蘿卜素和葉黃素)或維生素(例如生育酚)組成；提高產(chǎn)量(例如在非脅迫條件下產(chǎn)量提高或在生物或非生物脅迫下產(chǎn)量提高)；提高氮或其它營(yíng)養(yǎng)物的利用能力；改變農(nóng)藝學(xué)特性(例如延遲成熟；延遲衰老；更早熟或更晚熟；改善耐蔭性；提高根莖倒伏的抗性；提高對(duì)莖的“greensnap”的抗性；光周期反應(yīng)的改變)；改變生長(zhǎng)或生殖特性(例如有意矮化；有意雄性不育，用于例如例如改進(jìn)雜交步驟；營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)率提高；提高發(fā)芽率；提高雄性或雌性生育力)；提高收獲、貯存或加工品質(zhì)(例如提高貯存期間對(duì)有害動(dòng)物的抗性，提高對(duì)破損的抗性、提高對(duì)消費(fèi)者的吸引)；或這些性狀的任何組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因種子或由非天然轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子具有改變的初級(jí)代謝產(chǎn)物(例如脂肪酸、油、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖或碳水化合物)組成，改變的次級(jí)代謝產(chǎn)物(例如生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級(jí)代謝物)組成，改變的微量元素(例如鐵、鋅)、類胡蘿卜素(例如胡蘿卜素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)或其它類胡蘿卜素和葉黃素)或維生素(例如生育酚)組成，提高的收獲、貯存或加工品質(zhì)，或這些狀性的組合。例如，最好改變作物(例如甘蘭型油菜、棉花、紅花、大豆、甜菜、向日葵、小麥、玉米或水稻)種子的氨基酸(例如賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或總蛋白)、油(例如脂肪酸組成或總油)、碳水化合物(例如單糖或淀粉)、微量元素、類胡蘿卜素或維生素含量，優(yōu)選還包括提高種子收獲、貯存或加工品質(zhì)，并因此提供改良的種子，用于動(dòng)物飼料或人類食物。在另一個(gè)實(shí)例中，最好改變轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物種子的天然成分的含量，例如以降低具有低水平賴氨酸、甲硫氨酸或色氨酸的蛋白質(zhì)含量，或提高所需氨基酸或脂肪酸的含量，或降低變應(yīng)原性蛋白或糖蛋白(例如花生變應(yīng)原，包括arah1；小麥變應(yīng)原，包括醇溶蛋白和麥谷蛋白；大豆變應(yīng)原，包括P34變應(yīng)原、球蛋白、大豆球蛋白和伴大豆球蛋白(conglycinins)或有毒代謝產(chǎn)物(例如木薯中產(chǎn)生氰基的糖苷，茄科成員中的龍葵(solanum)生物堿)的含量?；蛞种频姆椒ū景l(fā)明再一方面提供影響基因抑制的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供非天然轉(zhuǎn)基因植物，其包括由本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物、或再生植物的后代植物(如以上標(biāo)題“轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物”下所述)；和(b)在非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄重組DNA構(gòu)建體；其中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生在非天然轉(zhuǎn)基因植物中能夠抑制至少一個(gè)靶基因的RNA，因此相對(duì)于在沒有轉(zhuǎn)錄重組DNA構(gòu)建體時(shí)的表達(dá)而言，至少一個(gè)靶基因被抑制。至少一個(gè)靶基因是至少一個(gè)選自以下的基因?qū)D(zhuǎn)基因植物而言是天然的基因，轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)基因，以及對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的病毒、細(xì)菌、真菌或無脊椎動(dòng)物害蟲或病原體而言是天然的基因。合適的靶基因如以上標(biāo)題“靶基因”下所述。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶基因是單個(gè)靶基因。在其它實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶基因是多個(gè)靶基因。靶基因抑制包括非特異性抑制，例如組成型表達(dá)抑制，以及特異性表達(dá)抑制，例如空間特異性基因抑制、時(shí)間特異性基因抑制、發(fā)育特異性基因抑制或誘導(dǎo)型基因抑制。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)，可達(dá)到對(duì)至少一個(gè)靶基因抑制的特異性，例如通過選擇具有所需特異性表達(dá)圖式的啟動(dòng)子，或者通過選擇具有所需特異性表達(dá)圖式的成熟miRNA識(shí)別的微RNA識(shí)別位點(diǎn)。通過本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄是組成型的即是非特異性的，例如在組成型啟動(dòng)子控制之下。在其它實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄在特定空間、時(shí)間或誘導(dǎo)條件下發(fā)生。例如，重組DNA構(gòu)建體可包含空間特異性啟動(dòng)子、時(shí)間特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)特異性啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)例中，重組DNA構(gòu)建體可包含核糖體開關(guān)(riboswitch)(可轉(zhuǎn)錄為能結(jié)合配體的RNA適配子的DNA，和可轉(zhuǎn)錄為能調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)RNA的DNA，其中調(diào)節(jié)依賴于調(diào)節(jié)RNA的構(gòu)象，而調(diào)節(jié)RNA的構(gòu)象受到RNA適配子結(jié)合狀態(tài)的變構(gòu)影響)，因此允許重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄受到RNA適配子結(jié)合狀態(tài)和配體存在(或不存在)的控制。本發(fā)明還提供同時(shí)影響至少一個(gè)靶基因的基因抑制和至少一個(gè)目標(biāo)基因的基因表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供非天然轉(zhuǎn)基因植物，其包括由本發(fā)明非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物或再生植物的后代植物(如以上標(biāo)題“轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物”下所述)，其中重組DNA構(gòu)建體還包含用于表達(dá)至少一個(gè)目標(biāo)基因的基因表達(dá)元件；和(b)在非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄重組DNA構(gòu)建體，其中當(dāng)重組DNA構(gòu)建體在非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄時(shí)，產(chǎn)生能夠抑制至少一個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄RNA和編碼至少一個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄RNA，其中相對(duì)于在沒有所述重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄時(shí)的表達(dá)而言，至少一個(gè)靶基因被抑制，而且至少一個(gè)目標(biāo)基因同時(shí)表達(dá)。目標(biāo)基因可包含來自任何物種(包括但不限于細(xì)菌和病毒等非真核生物；真菌；植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，例如作物、觀賞植物和非馴化植物即野生植物；無脊椎動(dòng)物，例如節(jié)肢動(dòng)物、環(huán)節(jié)動(dòng)物、線蟲和軟體動(dòng)物；和脊椎動(dòng)物，例如兩棲類、魚類、鳥類和哺乳動(dòng)物)的任何編碼或非編碼序列。由基因表達(dá)元件所表達(dá)的非編碼序列的非限制性實(shí)例包括但不限于5’非翻譯區(qū)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其它非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)、3’非翻譯區(qū)、終止子、內(nèi)含子、微RNA、微RNA前體DNA序列、小干擾RNA、核糖體或核酶的RNA成分、核仁小RNA、能結(jié)合配體的RNA適配子、和其它非編碼RNA。目標(biāo)基因的非限制性實(shí)例還包括但不限于可翻譯(編碼)序列，例如編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因和編碼參與目標(biāo)分子(例如氨基酸、脂肪酸和其它脂質(zhì)、糖和其它碳水化合物、生物聚合物和次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級(jí)代謝物)的生物合成或分解代謝的酶的基因。目標(biāo)基因?qū)τ谄渲斜景l(fā)明重組DNA構(gòu)建體可轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞(例如植物細(xì)胞)而言可以是天然的基因，或者可以是非天然的基因。目標(biāo)基因可以是標(biāo)記基因，例如，編碼抗生素抗性、抗真菌劑抗性或除草劑抗性的選擇標(biāo)記基因，或編碼易于檢測(cè)的性狀(例如在植物細(xì)胞中，八氫番茄紅素合酶或賦予植物特定色素的其它基因)的標(biāo)記基因，或編碼可檢測(cè)分子的基因，所述可檢測(cè)分子例如熒光蛋白、螢光素酶或可分別通過蛋白質(zhì)或核酸檢測(cè)方法而檢測(cè)的獨(dú)特多肽或核酸“標(biāo)簽”)。選擇標(biāo)記是特別用于鑒定本發(fā)明構(gòu)建體的成功加工中的目標(biāo)基因。目標(biāo)基因包括在以上標(biāo)題“靶基因”下描述為靶基因的那些基因。由基因表達(dá)元件表達(dá)的目標(biāo)基因可包含至少一個(gè)選自以下的基因真核靶基因、非真核靶基因和微RNA前體DNA序列。目標(biāo)基因可包含單個(gè)基因或多個(gè)基因(例如多拷貝的單基因、單基因的多個(gè)等位基因、或包含來自多個(gè)物種的基因的多個(gè)基因)。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因表達(dá)元件可包含自我水解的肽序列，例如位于編碼一種或多種多肽的多個(gè)序列之間(參見例如來自病毒、錐蟲和細(xì)菌等不同物種的2A和“2A樣”自我切割序列，公開于Donnelly等(2001)，J.Gen.Virol.,82:1027_1041)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，基因表達(dá)元件可包含核糖體“skip”序列，例如位于編碼一種或多種多肽的多個(gè)序列之間(參見例如口蹄疫病毒(FMDV)2A核糖體“skip”序列，公開于Donnelly等(2001)，J.Gen.Virol.,821013-1025)。非生物-脅迫-應(yīng)答MIRNA本發(fā)明另一方面涉及表現(xiàn)出對(duì)非生物脅迫應(yīng)答的表達(dá)圖式的miRNA，例如表現(xiàn)出特征為被營(yíng)養(yǎng)脅迫而調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)圖式的miRNA，表現(xiàn)出特征為被水脅迫而調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)圖式的miRNA，或表現(xiàn)出特征為被溫度脅迫而調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)圖式的miRNA。實(shí)施例6-11描述了在作物中鑒定的新的miRNA，其俗名為miRMONIS，其表現(xiàn)出特征為在營(yíng)養(yǎng)脅迫(即缺氮、缺磷或氮磷同時(shí)缺乏)下抑制miRNA的表達(dá)圖式。成熟miRMONIS是序列為UUAGAUGACCAUCAGCAAACA的21個(gè)核苷酸的miRNA，是從水稻(SEQIDNO.393)、玉米(SEQIDNO.3227)和大豆(SEQIDNO.8742)的小RNA文庫中克隆而來的。在水稻(SEQIDNO.1763)和玉米(SEQIDNO.3936)中鑒定出前體序列。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體在以上標(biāo)題“重組DNA構(gòu)建體”下有詳細(xì)描述，可用于本文所公開的任何miRNA，例如選自以下的成熟miRNA:SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921,SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560,SEQIDN08742,SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的描述也可一般性用于本發(fā)明的實(shí)施方案，其可更具體地涉及具有特定表達(dá)圖式的miRNA，例如本節(jié)所描述的營(yíng)養(yǎng)_脅迫_應(yīng)答的植物miRNA(例如miRM0N18和實(shí)施例所述的其它miRNA)。以下描述涉及miRM0N18，但也可用于被非生物脅迫調(diào)節(jié)的其它miRNA，尤其是表現(xiàn)出特征為在營(yíng)養(yǎng)脅迫下抑制miRNA的表達(dá)圖式的miRNA，表現(xiàn)出特征為在水脅迫下抑制miRNA的表達(dá)圖式的miRNA，或表現(xiàn)出特征為在溫度脅迫下抑制miRNA的表達(dá)圖式的miRNA；被非生物脅迫調(diào)節(jié)的miRNA的非限制性實(shí)例包括miR399和miR319。因此，本發(fā)明提供重組DNA構(gòu)建體，其包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件選自(a)可轉(zhuǎn)錄為具有選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體并加工為具有序列UUAGAUGACCAUCAGCAAACA(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)的成熟miRM0N18miRNA的DNA元件；(b)可轉(zhuǎn)錄為從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列折回結(jié)構(gòu)獲得的工程miRNA前體的DNA元件，其中工程miRNA前體包含修飾的成熟miRM0N18miRNA;(c)位于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)或其附近并可轉(zhuǎn)錄為包含miRNA識(shí)別位點(diǎn)的RNA的DNA元件，所述miRNA識(shí)別位點(diǎn)可被從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA識(shí)別；和(d)用于抑制從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0m8前體序列獲得的內(nèi)源miRNA表達(dá)的DNA元件。這些涉及miRM0N18的實(shí)施方案詳述如下。(A)天然miRM0N18在非天然條件下的表達(dá)。本發(fā)明提供重組DNA構(gòu)建體，其包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含可轉(zhuǎn)錄為具有選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體并加工為具有SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742序列的成熟miRM0N18miRNA的DNA元件，并且至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，并且其中重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)至少一個(gè)靶基因的抑制。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，miRNA前體包含miRM0N18前體序列的至少90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段。這些構(gòu)建體尤其可用于以并非天然miRM0N18表達(dá)圖式的表達(dá)圖式來表達(dá)miRM0N18(例如在不同組織、在不同時(shí)間或以不同表達(dá)水平)。miRM0N18前體不必包含選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列中所含有的所有核苷酸，但優(yōu)選包含選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列的至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%核苷酸的連續(xù)區(qū)段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，miRNA前體包含選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列的至少90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段。無論所使用的具體核苷酸序列如何，miRM0N18前體構(gòu)成與由選自SEQIDN0.1763和SEQIDNO.3936的miRMONIS前體序列構(gòu)成的折回結(jié)構(gòu)相同或近似相同的折回結(jié)構(gòu)并經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)步驟在體內(nèi)加工為具有SEQIDNO.393,SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742序列的成熟miRM0m8miRNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶基因是包含至少一個(gè)miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)(靶位點(diǎn))的植物內(nèi)源基因，而且重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)至少一個(gè)靶基因的抑制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，因此重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)至少一個(gè)靶基因的抑制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體還包含并非天然miRMONIS啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。這允許在不能天然表達(dá)的空間或時(shí)間或誘導(dǎo)條件下表達(dá)成熟miRM0N18miRNA。例如，重組DNA構(gòu)建體可設(shè)計(jì)為包含組成型啟動(dòng)子，因而可組成型表達(dá)成熟miRMONIS，其表達(dá)圖式的特征為在營(yíng)養(yǎng)脅迫(即缺氮、缺磷或氮磷同時(shí)缺乏)下抑制miRNA；這將會(huì)導(dǎo)致miRM0N18靶基因的組成型抑制。在另一個(gè)實(shí)例中，重組DNA構(gòu)建體可設(shè)計(jì)為包含誘導(dǎo)型根特異性啟動(dòng)子，因此當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)在根中表達(dá)成熟miRMONIS；這將會(huì)導(dǎo)致在誘導(dǎo)時(shí)在根組織對(duì)miRMONIS靶基因的抑制?？捎糜谠撝亟MDNA構(gòu)建體的啟動(dòng)子在標(biāo)題“啟動(dòng)子”下有描述。(B)來自miRM0N18的成熟的工程miRNA的表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含可轉(zhuǎn)錄為從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列折回結(jié)構(gòu)獲得的工程miRNA前體的DNA元件，其中工程miRNA前體包含修飾的成熟miRM0N18miRNA，其中至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因或者所述植物的有害動(dòng)物或病原體的內(nèi)源基因，而且其中重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)至少一個(gè)靶基因的抑制。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因或者所述植物的有害動(dòng)物或病原體的內(nèi)源基因，而且重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)至少一個(gè)靶基因的抑制。合適的靶基因描述于以上標(biāo)題“靶基因”下。至于“工程”是指選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的天然miRMONIS前體序列中的核苷酸被改變(替換、缺失或添加)，因而產(chǎn)生具有與天然miRMONIS前體序列折回結(jié)構(gòu)基本相同的折回結(jié)構(gòu)的工程miRNA前體，但其中由工程miRM0N18前體加工而來的成熟miRNA具有修飾序列(即不同于天然成熟miRM0N18的序列)，所述修飾序列可設(shè)計(jì)為抑制靶基因，該靶基因不同于被天然miRMONIS前體序列天然抑制的靶基因。用于測(cè)定天然miRMONIS前體序列中核苷酸改變以產(chǎn)生工程miRNA前體的一個(gè)通用的非限制性方法描述于以上標(biāo)題“成熟的工程miRNA的表達(dá)”下。(C)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件，并且還包含轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元，其中用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含位于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)或其附近并可轉(zhuǎn)錄為包含miRNA識(shí)別位點(diǎn)的RNA的DNA元件，所述miRNA識(shí)別位點(diǎn)可被具有SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742序列的成熟miRM0N18miRNA識(shí)別，或者被從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRM0N18miRNA識(shí)別，并且至少一個(gè)靶基因包含轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元所編碼的轉(zhuǎn)基因，而且其中重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因在成熟miRMONlSmiRNA并不能天然表達(dá)的植物細(xì)胞中得以表達(dá)。使用以下文獻(xiàn)所述的序列互補(bǔ)法則等本領(lǐng)域已知方法，可完成對(duì)miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)=Zhang(2005)NucleicAcidsRes.,33:W701-704和Rhoades等(2002)Cell，110:513_520；以下工作實(shí)施例中提供了miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)的非限制性實(shí)例。對(duì)miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)允許鑒定和證實(shí)受到來自天然表達(dá)miRM0N18前體的成熟miRM0N18調(diào)節(jié)的內(nèi)源基因；這可用于例如消除或修飾內(nèi)源基因內(nèi)的miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)，以便將該基因的表達(dá)從由天然調(diào)節(jié)基因表達(dá)的內(nèi)源miRMONIS的調(diào)節(jié)中解脫出來。在一個(gè)實(shí)施方案中，可增加miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)與成熟miRM0N18之間的錯(cuò)配數(shù)(尤其是對(duì)應(yīng)于成熟miRM0N18的位置2至13的錯(cuò)配)，以防被內(nèi)源miRM0N18識(shí)別并切割。這些重組DNA構(gòu)建體尤其可用于根據(jù)miRMONIS的內(nèi)源表達(dá)而限制的轉(zhuǎn)基因的inplanta表達(dá)，也就是說，當(dāng)例如在營(yíng)養(yǎng)脅迫(即缺氮、缺磷或氮磷同時(shí)缺乏)下miRMONIS被抑制時(shí)，表達(dá)轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)還可通過使用合適啟動(dòng)子來控制。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體可用于在缺氮(或缺磷)條件下在植物根部表達(dá)轉(zhuǎn)基因，其中本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體編碼(a)轉(zhuǎn)基因，其處于根特異性啟動(dòng)子控制之下，和(b)miRNA識(shí)別位點(diǎn)，其由僅在缺氮(或磷)條件下才被特異性抑制的成熟miRMONIS識(shí)別。轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因和任選額外序列，例如但不限于啟動(dòng)子、啟動(dòng)子增強(qiáng)子、終止子、信使RNA穩(wěn)定或去穩(wěn)定序列(參見例如Newman等(1993)PlantCell,5701-714；Green(1993)PlantPhysiol.，1021065-1070；禾ΠOhme-Takagi等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,9011811-11815)、用于將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄物定位或轉(zhuǎn)運(yùn)至特定場(chǎng)所(例如線粒體、質(zhì)體、核仁、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)的序列、或轉(zhuǎn)基因所需加工相關(guān)的其它序列。轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元所編碼的轉(zhuǎn)基因可包含任何一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因，包括編碼序列、非編碼序列或這兩者。目標(biāo)基因可包含“靶基因”下所列出的任何基因，其優(yōu)選的實(shí)例包括轉(zhuǎn)錄因子編碼基因和酶編碼基因的可翻譯(編碼)序列，所述酶參與目標(biāo)分子(例如但不限于氨基酸、脂肪酸和其它脂質(zhì)、糖類和其它碳水化合物、生物聚合物和次級(jí)代謝物(包括生物堿類、萜類、聚酮類、非核糖體肽和混合生物合成來源的次級(jí)代謝物))的生物合成或分解代謝。(D)對(duì)內(nèi)源或天然miRMONIS的抑制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含用于對(duì)從選自SEQIDN0.1763和SEQIDN0.3936的miRM0N18前體序列獲得的內(nèi)源成熟miRM0N18miRNA表達(dá)進(jìn)行抑制的DNA元件，其中至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，而且其中該內(nèi)源基因的表達(dá)在發(fā)生內(nèi)源成熟miRM0N18miRNA天然表達(dá)的植物細(xì)胞中被抑制，而且其中重組DNA構(gòu)建體在細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)源基因在細(xì)胞中的表達(dá)。這些構(gòu)建體尤其可用于抑制天然或內(nèi)源miRMONIS，因此允許具有一個(gè)或多個(gè)miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)的基因表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因并包含一個(gè)或多個(gè)miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)，而且內(nèi)源基因的表達(dá)在發(fā)生成熟miRM0N18的天然表達(dá)的植物細(xì)胞中被抑制，因此重組DNA構(gòu)建體在細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)源靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)。用于抑制表達(dá)的DNA元件包含以下至少一個(gè)(a)包含至少一個(gè)反義DNA區(qū)段的DNA，該反義DNA區(qū)段對(duì)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的；(b)包含多拷貝的至少一個(gè)反義DNA區(qū)段的DNA，該反義DNA區(qū)段對(duì)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的；(c)包含至少一個(gè)有義DNA區(qū)段的DNA，該有義DNA區(qū)段是靶基因的至少一個(gè)區(qū)段；(d)包含多拷貝的至少一個(gè)有義DNA區(qū)段的DNA，該有義DNA區(qū)段是靶基因的至少一個(gè)區(qū)段；(e)可轉(zhuǎn)錄為RNA并通過形成雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA，并且該DNA包含至少一個(gè)反義DNA區(qū)段和至少一個(gè)有義DNA區(qū)段，該反義DNA區(qū)段對(duì)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的，而該有義DNA區(qū)段是靶基因的至少一個(gè)區(qū)段；(f)可轉(zhuǎn)錄為RNA并通過形成一個(gè)雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA,并且該DNA包含多個(gè)連續(xù)反義DNA區(qū)段和多個(gè)連續(xù)有義DNA區(qū)段，這些反義DNA區(qū)段對(duì)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的，而這些有義DNA區(qū)段是靶基因的至少一個(gè)區(qū)段；(g)可轉(zhuǎn)錄為RNA并通過形成多個(gè)雙鏈RNA而抑制靶基因的DNA，并且該DNA包含多個(gè)反義DNA區(qū)段和多個(gè)有義DNA區(qū)段，這些反義DNA區(qū)段對(duì)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的，而這些有義DNA區(qū)段是靶基因的至少一個(gè)區(qū)段，并且其中多個(gè)反義DNA區(qū)段和多個(gè)有義DNA區(qū)段以一系列反向重復(fù)序列方式排列；(h)包含從植物miRNA獲得的核苷酸的DNA；⑴包含siRNA的核苷酸的DNA;(j)可轉(zhuǎn)錄為能結(jié)合配體的RNA適配子的DNA；和(k)可轉(zhuǎn)錄為能結(jié)合配體的RNA適配子的DNA，和可轉(zhuǎn)錄為能調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)RNA的DNA，其中調(diào)節(jié)依賴于調(diào)節(jié)RNA的構(gòu)象，而調(diào)節(jié)RNA的構(gòu)象受到RNA適配子結(jié)合狀態(tài)的變構(gòu)影響。用于抑制表達(dá)的DNA元件在實(shí)施例3中進(jìn)一步描述并如圖2和圖3所示。通過以下“微RNA誘騙序列”中詳述的替代方法可控制miRNA對(duì)其靶基因的作用。在某些實(shí)施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含這樣的DNA其設(shè)計(jì)成可轉(zhuǎn)錄為單鏈RNA或至少部分雙鏈RNA(例如以“相吻莖環(huán)”排列)、或可轉(zhuǎn)錄為假定二級(jí)結(jié)構(gòu)或三維構(gòu)型(例如靶基因或適配子的反義序列的大環(huán))的RNA，該RNA賦予轉(zhuǎn)錄物額外的所需特性，例如穩(wěn)定性提高、體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)或者細(xì)胞特異性或組織特異性提高。在一個(gè)實(shí)例中，間隔區(qū)可轉(zhuǎn)錄為能連接連續(xù)RNA區(qū)段第一系列和第二系列的穩(wěn)定環(huán)(參見例如DiGiusto和King(2004)J.Biol.Chem.，279:46483_46489)。在另一個(gè)實(shí)例中，重組DNA構(gòu)建體包含可轉(zhuǎn)錄為包含RNA適配子(例如可結(jié)合細(xì)胞特異性配體的適配子)在內(nèi)的RNA的DNA，允許針對(duì)重組RNA雙鏈體的細(xì)胞特異性或組織特異性尋靶。(E)miRNA-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因，包括miRM0N18-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因。也公開并要求保護(hù)重組DNA構(gòu)建體，其包含對(duì)給定成熟miRNA無應(yīng)答的合成miRNA-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列，其中合成miRNA-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列是(a)由天然miRNA-應(yīng)答序列獲得，即通過缺失或修飾天然miRNA-應(yīng)答序列內(nèi)被給定成熟miRNA識(shí)別的所有天然miRNA識(shí)別位點(diǎn)，和(b)不被給定成熟miRNA識(shí)別。非限制性實(shí)施方案包括重組DNA構(gòu)建體，其包含對(duì)選自以下的成熟miRNA無應(yīng)答的合成miRNA-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560,SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或者對(duì)從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA無應(yīng)答SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中合成miRNA-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列是(a)由天然miRNA-應(yīng)答序列獲得，即通過缺失或修飾天然miRNA-應(yīng)答序列內(nèi)被給定成熟miRNA識(shí)別的所有天然miRNA識(shí)別位點(diǎn)，和(b)不被給定成熟miRNA識(shí)別。使用以下文獻(xiàn)所述的序列互補(bǔ)法則等本領(lǐng)域已知方法，可完成對(duì)識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)=Zhang(2005)NucleicAcidsRes.，33:W701_704和Rhoades等(2002)Cell，110:513_520。一個(gè)非限制性優(yōu)選實(shí)施方案是重組DNA構(gòu)建體，其包含合成miRMONIS-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列，其中合成miRM0N18-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列是(a)由天然miRMONIS-應(yīng)答序列獲得，即通過缺失或修飾天然miRM0N18-應(yīng)答序列內(nèi)的所有天然miRM0N18miRNA識(shí)別位點(diǎn)(也就是說，缺失或修飾被具有SEQIDNO.393,SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742序列的成熟miRM0N18miRNA識(shí)別或者被從選自SEQIDNO.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRM0N18miRNA識(shí)別的任何識(shí)別位點(diǎn))，和(b)不被成熟miRM0N18miRNA識(shí)別。(F)非生物-脅迫-應(yīng)答的miRNA啟動(dòng)子，包括miRM0N18啟動(dòng)子。也公開并要求保護(hù)重組DNA構(gòu)建體，其包含表現(xiàn)出特征為被非生物脅迫而調(diào)節(jié)的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子，例如，表現(xiàn)出特征為被營(yíng)養(yǎng)脅迫而調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子，表現(xiàn)出特征為被水脅迫而調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子，或表現(xiàn)出特征為被溫度脅迫而調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子。優(yōu)選的實(shí)施方案包括重組DNA構(gòu)建體，其包含表現(xiàn)出特征為被營(yíng)養(yǎng)脅迫而調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子，其中營(yíng)養(yǎng)脅迫包括選自缺氮和缺磷的至少一種營(yíng)養(yǎng)缺乏。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是被缺氮抑制的miRNA啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是被缺無機(jī)磷抑制的miRNA啟動(dòng)子。在又一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是被同時(shí)缺氮和缺磷抑制的miRNA啟動(dòng)子。在再一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是被缺氮或缺磷上調(diào)的miRNA啟動(dòng)子。特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括重組DNA構(gòu)建體，其包含表現(xiàn)出特征為在營(yíng)養(yǎng)脅迫下抑制miRNA的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子，其中營(yíng)養(yǎng)脅迫包括選自缺氮和缺磷的至少一種營(yíng)養(yǎng)缺乏，并且其中啟動(dòng)子包含以下至少一個(gè)(a)在葉組織中表現(xiàn)出在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制的玉米miRNA啟動(dòng)子；(b)在葉組織中表現(xiàn)出在磷充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制的玉米miRNA啟動(dòng)子；(c)具有SEQIDNO.8804序列的miRM0N18啟動(dòng)子；(d)與SEQIDNO.8804區(qū)段具有至少85%同一性的至少約50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段。也優(yōu)選這樣的實(shí)施方案其中啟動(dòng)子與以下至少一個(gè)操作性連接(a)基因抑制元件，和(b)基因表達(dá)元件；優(yōu)選這些實(shí)施方案可用于在植物中表達(dá)重組DNA構(gòu)建體。非限制性實(shí)例包括具有SEQIDN0.8800的核苷酸211-2172序列的啟動(dòng)子；與SEQIDN0.8800的核苷酸211-2172具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%同一性的至少約50、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400、或至少500個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，其中所述片段在至少一種植物組織中具有啟動(dòng)子活性，其特征為在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制；而且至少約50、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400、或至少500個(gè)連續(xù)核苷酸的片段與SEQIDN0.8804具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%同一性，其中所述片段在至少一種植物組織中具有啟動(dòng)子活性，其特征為在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制。(G)非生物-脅迫-應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和植物。還公開和要求保護(hù)非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包含該標(biāo)題(“非生物-脅迫-應(yīng)答的miRNA”)下所公開的任何重組DNA構(gòu)建體。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括由包含重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的非天然轉(zhuǎn)基因植物，該重組DNA構(gòu)建體包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含可轉(zhuǎn)錄為具有選自SEQIDN0.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800的miRM0N18前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體的DNA元件，其中miRNA前體包含miRM0N18前體序列的至少90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段并加工為具有序列UUAGAUGACCAUCAGCAAACA(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)的成熟miRMON18miRNA，而且至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因并包含SPX結(jié)構(gòu)域，而且其中重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)至少一個(gè)靶基因的抑制；通常重組DNA構(gòu)建體還包含并非天然miRM0N18啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，以驅(qū)動(dòng)成熟miRM0N18的表達(dá)。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括由包含重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的非天然轉(zhuǎn)基因植物，該重組DNA構(gòu)建體包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含用于對(duì)從選自SEQIDNO.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800的miRM0N18前體序列獲得的內(nèi)源成熟miRM0N18miRNA表達(dá)進(jìn)行抑制的DNA元件，其中至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因并包含SPX結(jié)構(gòu)域，而且內(nèi)源基因的表達(dá)在發(fā)生內(nèi)源成熟miRM0N18miRNA天然表達(dá)的植物細(xì)胞中被抑制，而且其中重組DNA構(gòu)建體在細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)源基因在細(xì)胞中的表達(dá)。用于抑制內(nèi)源成熟miRM0N18miRNA表達(dá)的合適DNA元件描述于以上標(biāo)題“對(duì)內(nèi)源或天然miRM0N18的抑制”下。微RNA誘騙序列植物微RNA通過以下方式調(diào)節(jié)其靶基因識(shí)別并結(jié)合靶轉(zhuǎn)錄物中幾乎完美互補(bǔ)的序列(miRNA識(shí)別位點(diǎn))，再通過RNA酶III酶(例如Agol)切割轉(zhuǎn)錄物。在植物中，給定miRNA識(shí)別位點(diǎn)與相應(yīng)成熟miRNA之間的某些錯(cuò)配是不能忍受的，尤其是成熟miRNA位置10和11的錯(cuò)配核苷酸。以5’至3’方向給出成熟miRNA內(nèi)的位置；為了清楚起見，圖7D描繪了miRNA、miR827(SEQIDNO.8744)和miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)的實(shí)例，帶編號(hào)的箭頭標(biāo)明成熟miRNA的位置1、10和21；位置10的核苷酸還具有下劃線。在成熟miRNA的位置10和11上通常需要給定miRNA識(shí)別位點(diǎn)與相應(yīng)成熟miRNA之間的完美互補(bǔ)。參見例如Franco-Zorrilla等(2007)NatureGenetics,391033-1037；和Axtell等(2006)Cell,127:565_577。植物miRNA的這一特征可用于達(dá)到預(yù)測(cè)“微RNA誘騙序列”的法則，也就是說，該序列可被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合而導(dǎo)致miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間的堿基配對(duì)，因而形成因miRNA誘騙序列與成熟miRNA間存在錯(cuò)配而不被切割的抗切割RNA雙鏈體。錯(cuò)配包括規(guī)范錯(cuò)配(例如G-A、C-U、C-A)以及G::U擺動(dòng)配對(duì)和得失位(indels)(核苷酸插入或缺失)。一般而言，這些法則定義(1)所需錯(cuò)配，和(2)允許但并非必需的錯(cuò)配。所需錯(cuò)配包括(a)miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間在內(nèi)源成熟miRNA位置9、10或11上的至少1個(gè)錯(cuò)配，或者，(b)在對(duì)應(yīng)于內(nèi)源成熟miRNA的位置9、10或11的miRNA誘騙序列的位置上的1、2、3、4或5個(gè)插入(即額外核苷酸)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在(a)miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間在內(nèi)源成熟miRNA的位置10和/或11上的至少1個(gè)錯(cuò)配，或(b)在對(duì)應(yīng)于內(nèi)源成熟miRNA的位置10和/或11的miRNA誘騙序列的位置上的至少1個(gè)插入。允許但并非必需的錯(cuò)配包括(a)miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間在內(nèi)源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個(gè)錯(cuò)配，和(b)miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間在內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位(即21個(gè)核苷酸的成熟miRNA的位置21)上的0、1、2或3個(gè)錯(cuò)配，其中在內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個(gè)錯(cuò)配都鄰近至少一個(gè)互補(bǔ)堿基對(duì)(即使得在內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上有不超過2個(gè)連續(xù)錯(cuò)配)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在內(nèi)源成熟miRNA的位置1、2、3、4、5、6、7和8上不存在錯(cuò)配(即所有都是互補(bǔ)堿基對(duì))。miRNA誘騙序列可以是任何長(zhǎng)度，只要能被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合，形成抗切割的RNA雙鏈體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，miRNA誘騙序列包含約18至約36個(gè)核苷酸。特別要求保護(hù)的實(shí)施方案包括18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30和31個(gè)核苷酸的miRNA誘騙序列。在非限制性實(shí)例中，具有在成熟miRNA位置10上的4個(gè)核苷酸插入的所需錯(cuò)配和在成熟miRNA位置20上的1個(gè)核苷酸插入的允許錯(cuò)配的miRNA誘騙序列(對(duì)于21個(gè)核苷酸的成熟miRNA)總共具有26個(gè)核苷酸；具有在成熟miRNA位置11上的5個(gè)核苷酸插入的所需錯(cuò)配以及在成熟miRNA位置20上的1個(gè)規(guī)范錯(cuò)配和在成熟miRNA位置23上的1個(gè)核苷酸插入的允許錯(cuò)配的miRNA誘騙序列(對(duì)于25個(gè)核苷酸的成熟miRNA)總共具有31個(gè)核苷酸。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括重組DNA構(gòu)建體，其可轉(zhuǎn)錄為包含至少一個(gè)miRNA誘騙序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，該miRNA誘騙序列可被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合、但不切割(例如不被淘金者蛋白(Argonaute)或AGO樣蛋白切割)，其中內(nèi)源miRNA是選自以下的至少一種miRNA(a)選自以下成熟miRNA的成熟miRNA=SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921,SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560,SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或(b)從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDN0.8816-8819；而且miRNA誘騙序列包含約19個(gè)至約36個(gè)連續(xù)RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA誘騙序列被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合，導(dǎo)致miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間的堿基配對(duì)，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一個(gè)錯(cuò)配，或在所述miRNA誘騙序列對(duì)應(yīng)于所述內(nèi)源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一個(gè)插入，(b)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個(gè)錯(cuò)配，和(c)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3個(gè)錯(cuò)配，其中在所述內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個(gè)所述錯(cuò)配都鄰近至少一個(gè)互補(bǔ)堿基對(duì)。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體包含至少一個(gè)miRNA誘騙序列，并且包含多個(gè)miRNA誘騙序列(可以是單miRNA誘騙序列的多拷貝，或不同miRNA誘騙序列的拷貝，或這兩者的組合)。在一個(gè)實(shí)例中，多拷貝的miRNA誘騙序列在重組DNA構(gòu)建體中串聯(lián)排列，該設(shè)計(jì)用于降低相應(yīng)成熟miRNA的活性。在另一個(gè)實(shí)例中，通過表達(dá)可轉(zhuǎn)錄為多個(gè)不同miRNA誘騙序列的單個(gè)嵌合重組DNA構(gòu)建體，來降低不同的成熟miRNA的活性。miRNA誘騙序列的表達(dá)可被不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，這些啟動(dòng)子包括但不限于組織特異性啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、時(shí)間特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，例如在標(biāo)題“啟動(dòng)子”下描述的任何啟動(dòng)子。miRNA誘騙序列可位于轉(zhuǎn)錄物的不同位置。在也可轉(zhuǎn)錄為編碼序列、非編碼序列(例如miRNA)或這兩者的重組DNA構(gòu)建體中，miRNA誘騙序列優(yōu)選位于內(nèi)含子內(nèi)或聚腺苷酸化信號(hào)之后，以允許編碼序列、非編碼序列或這兩者的正常轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，類似誘騙序列可用于調(diào)節(jié)參與雙鏈RNA介導(dǎo)的基因抑制的其它小RNA的活性，包括反式作用小干擾RNA(ta-siRNA)、天然反義轉(zhuǎn)錄siRNA(nat-siRNA)和定相小RNA(可參見以下文獻(xiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)11/897，611，2007年8月31日申請(qǐng)，其通過引用結(jié)合到本文中)。基本上采用與預(yù)測(cè)miRNA誘騙序列相同的法則，來預(yù)測(cè)這些類似ta-siRNA誘騙序列、nat-siRNA誘騙序列和定相小RNA誘騙序列，并且具有與miRNA誘騙序列類似的用途。miRNA誘騙序列可以是天然存在的序列或人工序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)miRNA誘騙序列包含天然存在的miRNA誘騙序列，例如，通過生物信息學(xué)而鑒定的內(nèi)源miRNA誘騙序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)miRNA誘騙序列包含合成miRNA誘騙序列，例如，經(jīng)從頭開始設(shè)計(jì)為結(jié)合給定成熟miRNA并形成抗切割RNA雙鏈體的序列。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是重組DNA構(gòu)建體，其可轉(zhuǎn)錄為包含至少一個(gè)miRM0N18誘騙序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，該miRM0N18誘騙序列可被內(nèi)源成熟miRM0N18識(shí)別并結(jié)合、但不切割(例如不被淘金者蛋白(Argonaute)或AGO樣蛋白切割)，其中內(nèi)源miRMONIS是選自以下的至少一個(gè)(a)成熟miRM0N18，或(b)從植物miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA；和包含約19個(gè)至約36個(gè)連續(xù)RNA核苷酸的RNA序列的miRM0N18誘騙序列，其中miRM0N18誘騙序列可被內(nèi)源成熟miRM0N18識(shí)別并結(jié)合，導(dǎo)致miRM0N18誘騙序列與內(nèi)源成熟miRM0N18之間的堿基配對(duì)，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRM0N18之間在內(nèi)源成熟miRM0N18位置9、10或11上的至少一個(gè)錯(cuò)配，或在miRM0N18誘騙序列對(duì)應(yīng)于內(nèi)源成熟miRM0N18位置10-11的位置上的至少一個(gè)插入，(b)miRM0N18誘騙序列與內(nèi)源成熟miRM0N18在內(nèi)源成熟miRM0N18位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個(gè)錯(cuò)配，和(c)miRM0N18誘騙序列與內(nèi)源成熟miRM0N18之間在內(nèi)源成熟miRM0N18位置12至最后一位上的0、1、2或3個(gè)錯(cuò)配，其中在內(nèi)源成熟miRM0N18位置12至最后一位上的每個(gè)錯(cuò)配都鄰近至少一個(gè)互補(bǔ)堿基對(duì)；而且其中至少一個(gè)miRMONIS誘騙序列被成熟miRM0N18miRNA識(shí)別并結(jié)合、但不切害I]。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，成熟miRM0N18具有SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.874的序列，或者是從選自SEQIDN0.1763和SEQIDNO.3936的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA。本發(fā)明還提供在選自缺氮和缺磷的至少一種營(yíng)養(yǎng)缺乏下提供產(chǎn)量提高的非天然轉(zhuǎn)基因作物的方法，該方法包括在非天然轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)可轉(zhuǎn)錄為包含至少一個(gè)miRM0N18誘騙序列的RNA轉(zhuǎn)錄物的重組DNA構(gòu)建體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是重組DNA構(gòu)建體，其可轉(zhuǎn)錄為包含至少一個(gè)miRM0N18誘騙序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，該miRMONIS誘騙序列可被內(nèi)源成熟miR399識(shí)別并結(jié)合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO樣蛋白切割)，其中內(nèi)源miR399是選自以下的至少一個(gè)(a)成熟miR399，或(b)從選自SEQIDNO.8816-8819的miR399前體序列獲得的成熟miRNA；而且miR399誘騙序列包含約19個(gè)至約36個(gè)連續(xù)RNA核苷酸的RNA序列，其中miR399誘騙序列被內(nèi)源成熟miR399識(shí)別并結(jié)合，導(dǎo)致miR399誘騙序列與內(nèi)源成熟miR399之間的堿基配對(duì)，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)miR399誘騙序列與內(nèi)源成熟miR399之間在所述內(nèi)源成熟時(shí)1399位置9、10或11上的至少一個(gè)錯(cuò)配，或在miR399誘騙序列對(duì)應(yīng)于內(nèi)源成熟miR399位置10-11的位置上的至少一個(gè)插入，(b)miR399誘騙序列與內(nèi)源成熟miR399之間在內(nèi)源成熟miR399位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個(gè)錯(cuò)配，和(c)miR399誘騙序列與內(nèi)源成熟miR399之間在內(nèi)源成熟miR399位置12至最后一位上的0、1、2或3個(gè)錯(cuò)配，其中在內(nèi)源成熟miR399位置12至最后一位上的每個(gè)錯(cuò)配都鄰近至少一個(gè)互補(bǔ)堿基對(duì)；而且其中至少一個(gè)miR399誘騙序列被成熟miR399識(shí)別并結(jié)合、但不切割。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，成熟miR399具有SEQIDNO.8812-8815的序列，或者是從選自SEQIDN0.8816-8819的miR399前體序列獲得的成熟miRNA。本發(fā)明還提供在選自缺氮和缺磷的至少一種營(yíng)養(yǎng)缺乏下提供產(chǎn)量提高的非天然轉(zhuǎn)基因作物的方法，該方法包括在非天然轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)可轉(zhuǎn)錄為包含至少一個(gè)miR399誘騙序列的RNA轉(zhuǎn)錄物的重組DNA構(gòu)建體。本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案是對(duì)內(nèi)源miRNA誘騙序列的抑制，例如通過基因抑制元件(例如在標(biāo)題“用于抑制表達(dá)的DNA元件”下所述)，尤其是被細(xì)胞特異性啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。本文所述的任何這些重組DNA構(gòu)建體都可通過常用技術(shù)來制備，例如在標(biāo)題“制備和使用重組DNA構(gòu)建體”下所述并參見工作實(shí)施例。重組DNA構(gòu)建體尤其可用于制備非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、非天然轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因種子，如以下“轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物”所述。包含miRNA誘騙序列的重組DNA構(gòu)建體可用于提供經(jīng)工程改造以抑制內(nèi)源基因的合成miRNA的獨(dú)特表達(dá)圖式；這尤其可用于防止由合成miRNA在某些組織中的不想要的表達(dá)而引起的不利表型。例如，合成miRNA可用于僅在植物的特定組織中才抑制內(nèi)源基因，例如通過重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)，該重組DNA構(gòu)建體包含(a)驅(qū)動(dòng)合成miRNA表達(dá)的組成型啟動(dòng)子，和(b)驅(qū)動(dòng)miRNA誘騙序列表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子，該miRNA誘騙序列經(jīng)設(shè)計(jì)用于隱蔽合成miRNA。本發(fā)明還提供用于提供改良的作物的方法。本發(fā)明一方面包括提供具有至少一個(gè)改變的性狀的非天然轉(zhuǎn)基因作物的方法，該方法包括在非天然轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)可轉(zhuǎn)錄為包含至少一個(gè)miRNA誘騙序列的RNA轉(zhuǎn)錄物的重組DNA構(gòu)建體，該miRNA誘騙序列被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO樣蛋白切割)，其中內(nèi)源miRNA是選自以下的至少一種miRNA(a)選自以下成熟miRNA的成熟miRNA:SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921,SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或(b)從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408,SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；而且miRNA誘騙序列包含約19個(gè)至約36個(gè)連續(xù)RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA誘騙序列被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合，導(dǎo)致miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間的堿基配對(duì)，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一個(gè)錯(cuò)配，或在所述miRNA誘騙序列對(duì)應(yīng)于所述內(nèi)源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一個(gè)插入，(b)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個(gè)錯(cuò)配，和(c)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3個(gè)錯(cuò)配，其中在所述內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個(gè)所述錯(cuò)配都鄰近至少一個(gè)互補(bǔ)堿基對(duì)，因而相對(duì)于不表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的作物而言，導(dǎo)致非天然轉(zhuǎn)基因作物表現(xiàn)出選自以下的至少一個(gè)改變的性狀(i)提高非生物脅迫耐性；(ii)提高生物脅迫耐性；(iii)提高針對(duì)植物的有害動(dòng)物或病原體的抗性；(iv)改變初級(jí)代謝產(chǎn)物組成；(v)改變次級(jí)代謝產(chǎn)物組成；(vi)改變微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(vii)提高產(chǎn)量；(viii)提高氮或其它營(yíng)養(yǎng)物的利用能力；(ix)改變農(nóng)藝學(xué)特性；(x)改變生長(zhǎng)或生殖特性；和(xi)提高收獲、貯存或加工品質(zhì)。另一方面，本發(fā)明提供具有至少一個(gè)改變的性狀的非天然轉(zhuǎn)基因作物的方法，該方法包括在非天然轉(zhuǎn)基因作物中抑制至少一個(gè)內(nèi)源miRNA誘騙序列，該內(nèi)源miRNA誘騙序列被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合、但不切割(例如不被淘金者蛋白或AGO樣蛋白切割)，其中內(nèi)源miRNA是選自以下的至少一種miRNA(a)選自以下成熟miRNA的成熟miRNA:SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDN08742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850,或(b)從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；而且miRNA誘騙序列包含約19個(gè)至約36個(gè)連續(xù)RNA核苷酸的RNA序列，其中miRNA誘騙序列被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合，導(dǎo)致miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間的堿基配對(duì)，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一個(gè)錯(cuò)配，或在所述miRNA誘騙序列對(duì)應(yīng)于所述內(nèi)源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一個(gè)插入，(b)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個(gè)錯(cuò)配，和(c)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3個(gè)錯(cuò)配，其中在所述內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個(gè)所述錯(cuò)配都鄰近至少一個(gè)互補(bǔ)堿基對(duì)；因而相對(duì)于不表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的作物而言，導(dǎo)致非天然轉(zhuǎn)基因作物表現(xiàn)出選自以下的至少一個(gè)改變的性狀(i)提高非生物脅迫耐性；(ii)提高生物脅迫耐性；(iii)提高針對(duì)植物的有害動(dòng)物或病原體的抗性；(iv)改變初級(jí)代謝產(chǎn)物組成；(v)改變次級(jí)代謝產(chǎn)物組成；(vi)改變微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(vii)提高產(chǎn)量；(viii)提高氮或其它營(yíng)養(yǎng)物的利用能力；(ix)改變農(nóng)藝學(xué)特性；(x)改變生長(zhǎng)或生殖特性；和(xi)提高收獲、貯存或加工品質(zhì)。可通過包括在非天然轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)基因抑制元件(例如在標(biāo)題“對(duì)內(nèi)源或天然miRNA的抑制”下所述的用于抑制表達(dá)的DNA元件)的任何方法或通過任何其它的基因抑制方法，來達(dá)到對(duì)至少一個(gè)內(nèi)源miRNA誘騙序列的抑制。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因植物在營(yíng)養(yǎng)充足條件下過量表達(dá)針對(duì)miRNA(其在營(yíng)養(yǎng)充足條件下高水平天然表達(dá)而在營(yíng)養(yǎng)缺乏條件下低水平天然表達(dá))的至少一個(gè)miRNA誘騙序列，因而導(dǎo)致植物在營(yíng)養(yǎng)缺乏下的性能或產(chǎn)量提高，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的利用力提高。例如，miRM0N18和miR399在缺氮或缺磷條件下低水平表達(dá)，而在氮磷充足的條件下高水平表達(dá)，因而它們的天然靶基因在缺氮或缺磷條件下被抑制，而在氮磷充足條件下以相對(duì)高的水平表達(dá)；這導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物對(duì)氮和/或磷的利用力提高。因此，相對(duì)于不表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的植物而言，過量表達(dá)包含至少一個(gè)miRM0N18誘騙序列(或至少一個(gè)miR399誘騙序列)的重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，導(dǎo)致在氮磷充足條件下以較高水平表達(dá)miRM0N18天然靶基因(或miR399天然靶基因)。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，預(yù)期過量表達(dá)包含至少一個(gè)miRM0N18誘騙序列的重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物能積累相對(duì)高水平的天然miRM0N18靶標(biāo)(例如含有SPX結(jié)構(gòu)域的基因，例如圖12所示的基因，如實(shí)施例7、9和10所述)。實(shí)施例實(shí)施例1本實(shí)施例描述鑒定作物(水稻和玉米)微RNA和它們的前體(折回)結(jié)構(gòu)的方法的非限制性實(shí)施方案，用于制備本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體。通過高通量測(cè)序(Margulies等(2005)Nature，437:376-380)，從成熟水稻(Oryzasativacv.Nipponbare)成熟谷粒(一式三份)和秧苗以及從玉米(Zeamays)葉和玉米籽粒(授粉后39天)中克隆若干小(19-25個(gè)核苷酸)RNA文庫。由此得到的序列用于分別在水稻基因組序列和玉米基因組序列中進(jìn)行miRNA預(yù)測(cè)，使用來自先前已表征的miRNA的一組法則，再按照手冊(cè)指南來消除不良預(yù)測(cè)的折回結(jié)構(gòu)。與注釋tRNA、rRNA、轉(zhuǎn)座子/反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和其它已知重復(fù)序列、以及葉綠體基因組或線粒體基因組完美匹配的小RNA排除在分析之外。基因組研究學(xué)會(huì)(InstituteforGenomeResearch)的水稻基因組注釋4.0版(公眾可得自tigr.org)用于預(yù)測(cè)310個(gè)核苷酸的兩個(gè)側(cè)翼基因組區(qū)段，其中給定的小RNA位于所述區(qū)段左端或右端附近，因而得到由280個(gè)核苷酸+小RNA+10個(gè)核苷酸組成的序列，或由10個(gè)核苷酸+小RNA+280個(gè)核苷酸組成的序列。按照以下文獻(xiàn)所述，用Vienna軟件包中的RNAfold程序，預(yù)測(cè)由此得到的各區(qū)段的折回結(jié)構(gòu)H0facker等(1994)Monatsh.f.Chemie,125:167_188。為了便于結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，各小RNA的假豐度(pseudo-abundance)定為2。根據(jù)從以下文獻(xiàn)所述修飾而來的已證實(shí)的miRNA前體的特性，來過濾結(jié)構(gòu)Jones-Rhoades等(2006)Annu.Rev.Plant.Biol.,5719-53。對(duì)于水稻miRNA，過濾要求包括⑴小RNA必須全部位于預(yù)測(cè)折回(莖環(huán))結(jié)構(gòu)的一個(gè)臂內(nèi)；⑵小RNA與其相反臂中的對(duì)應(yīng)物區(qū)段的核苷酸序列必須彼此具有至少75%互補(bǔ)性；和(3)小RNA及其對(duì)應(yīng)物，當(dāng)形成不完美雙鏈體時(shí)，必須不含多于3個(gè)核苷酸的對(duì)稱凸起(bulge)或多于2個(gè)核苷酸的不對(duì)稱凸起。滿足以上標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)還可進(jìn)一步過濾，即通過選擇(1)僅長(zhǎng)度為20或21個(gè)核苷酸并且5’端堿基為尿嘧啶的小RNA；或(2)測(cè)序至少10次的小RNA。最終過濾步驟包括(1)選擇與基因組具有少于23個(gè)完美匹配的小RNA，以除去重復(fù)元件，和(2)用于預(yù)測(cè)的區(qū)段不含來自負(fù)鏈的小RNA。在當(dāng)鑒定出多個(gè)重疊小RNA的情況下，選擇其中最豐富的成員作為代表性的序列。就玉米miRNA預(yù)測(cè)而言，預(yù)測(cè)/過濾步驟是從用于水稻miRNA的步驟修改而來，因?yàn)樯胁豢墒褂猛暾衩谆蚪M。獨(dú)立分析來自玉米葉和玉米籽粒文庫的小RNA，以便使用小RNA豐度來進(jìn)行miRNA預(yù)測(cè)。將小RNA作圖到MaizeAssembledGeneIslands(MAGI第4版)，這是公眾可得的裝配玉米基因組序列數(shù)據(jù)庫，描述于Fu等(2005)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,102:12282-12287。具有來自正負(fù)鏈的小RNA的序列排除在外。采用與水稻所用的相同需要，預(yù)測(cè)和過濾微RNA折回結(jié)構(gòu)，并且進(jìn)一步手工檢查，以消除具有大(>100個(gè)核苷酸)或高不配對(duì)環(huán)區(qū)的結(jié)構(gòu)。通過過濾而排除的先前表征的miRNA用于表明假陰性。分析來自水稻的大小范圍在19-25個(gè)核苷酸的總共260676個(gè)獨(dú)特小RNA中推定的新miRNA。過濾并手工檢查后，對(duì)應(yīng)于1072基因座的840個(gè)小RNA被鑒定為新的水稻miRNA。iiilt后，了miRNA^igj#"miRBase"(bJHgmicrorna.sanger.ac.uk/sequences/)中存在的27個(gè)已知miRNA家族和原始獨(dú)特序列組22個(gè)家族。根據(jù)已表征miRNA(miRBase)估計(jì)的18.5%的假陰性率表明，通過該方法捕獲大部分miRNA。從來自玉米籽粒的總共126691個(gè)小RNA中，鑒定出對(duì)應(yīng)于MAGI第4.0版玉米基因組序列中的281基因座的116個(gè)新的玉米miRNA；同樣，從來自玉米葉的總共53103個(gè)小RNA中，鑒定出對(duì)應(yīng)于302基因座的79個(gè)新的玉米miRNA。水稻miRNA和玉米miRNA以及它們相應(yīng)的miRNA前體序列、以及各miRNA前體序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列標(biāo)識(shí)號(hào)歸于下表1:玉米籽粒miRNA(SEQIDNO.1-116)、玉米葉miRNA(SEQIDNO.117-195)、水稻miRNA(SEQIDN0.196-1035)、玉米籽粒miRNA前體序列(SEQIDNO.1036-1316)、玉米葉miRNA前體序列(SEQIDNO.1317-1618)和水稻miRNA前體序列(SEQIDNO.1619-2690)。總共174個(gè)預(yù)測(cè)的新的玉米miRNA(代表528基因組座位)包括與先前在并非玉米的物種中鑒定的已知miRNA相同的9個(gè)miRNA直向同源物；這些都列于下表2。表1玉米和水稻miRNA和miRNA前體<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表1(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>1(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>表<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>表2玉米miRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>氺“ptc，，，毛果楊(Populustrichocarpa)；"osa",/JCfS(Oryzasativa)；“ath，，，擬南芥(Arabidopsisthaliana)；"sbi，，，高梁(Sorghumbicolor)實(shí)施例2根據(jù)以下文獻(xiàn)所述的序列互補(bǔ)法則，使用基因組研究學(xué)會(huì)(InstituteforGenomeResearch)的水稻基因組注釋第4.0版(公眾可得自www.tigr.org)，對(duì)預(yù)測(cè)是新的水稻miRNA的靶標(biāo)的水稻基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)Zhang(2005)NucleicAcidsRes.，33:W701-704和Rhoades等(2002)Cell，110:513_520。這些預(yù)測(cè)靴標(biāo)是包含至少一個(gè)miRNA識(shí)別位點(diǎn)的序列，該識(shí)別位點(diǎn)被選自以下的成熟miRNA識(shí)別SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921,SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560,SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識(shí)別SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。表3列出被水稻成熟miRNA(SEQIDNO.197)識(shí)別的miRNA識(shí)別位點(diǎn)(SEQIDNO.2691-2729)的非限制性實(shí)例。表<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>實(shí)施例3本實(shí)施例描述重組DNA構(gòu)建體的非限制性實(shí)施方案，其中用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含用于抑制從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內(nèi)源miRNA的表達(dá)的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819。更具體地講，本實(shí)施例說明用于抑制靶基因(例如內(nèi)源miRNA或內(nèi)源miRNA誘騙序列)表達(dá)的DNA元件的非限制性實(shí)例。圖2A示意性描繪了用于抑制靶基因(例如內(nèi)源miRNA)表達(dá)的DNA元件的非限制性實(shí)例。這些DNA元件包含用于抑制至少一個(gè)第一靶基因的至少一個(gè)第一基因抑制元件(“GSE”或“GSE1”)，其中第一基因抑制元件嵌入內(nèi)含子中，其一側(cè)或兩側(cè)鄰接非蛋白質(zhì)編碼DNA。這些DNA元件利用內(nèi)含子(在許多實(shí)施方案中，優(yōu)選得自5’非翻譯區(qū)的內(nèi)含子或表達(dá)增強(qiáng)內(nèi)含子)來遞送基因抑制元件，而無需任何蛋白質(zhì)編碼外顯子(編碼序列)的存在。DNA元件可任選包含用于抑制至少一個(gè)第二靶基因的至少一個(gè)第二基因抑制元件(“GSE2”)，用于表達(dá)至少一個(gè)目標(biāo)基因(其可以是編碼序列或非編碼序列或這兩者)的至少一個(gè)基因表達(dá)元件(“GEE”)或這兩者。在含有任選基因表達(dá)元件的實(shí)施方案中，基因表達(dá)元件可位于內(nèi)含子之外(例如與內(nèi)含子相鄰)。在某些實(shí)施方案中，含有第一基因抑制元件的內(nèi)含子是終止子的3’。為了根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)而更明確地區(qū)分本發(fā)明的DNA元件(含有至少一個(gè)基因抑制元件，其嵌入在一側(cè)或兩側(cè)側(cè)接非蛋白質(zhì)編碼DNA的一個(gè)內(nèi)含子中)，圖2B示意性描繪了重組DNA構(gòu)建體的現(xiàn)有技術(shù)的實(shí)例。這些構(gòu)建體可含有位于鄰近側(cè)接蛋白質(zhì)編碼序列的內(nèi)含子、或在兩個(gè)不連續(xù)的內(nèi)含子之間的基因抑制元件(其中基因抑制元件并不包含在這兩個(gè)不連續(xù)內(nèi)含子的任一個(gè)之內(nèi))，或可包含含有嵌入在內(nèi)含子中的基因抑制元件的基因表達(dá)元件，該內(nèi)含子側(cè)接多個(gè)外顯子(例如包含蛋白質(zhì)編碼序列的外顯子)。圖3描繪了用于抑制靶基因(例如內(nèi)源miRNA)表達(dá)的DNA元件的各種非限制性實(shí)例，其可用于本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體。當(dāng)劃出一條單鏈時(shí)(圖3A至圖3E)，這些都按常規(guī)以5’至3’(左到右)轉(zhuǎn)錄方向來描繪；箭頭表明反義序列(箭頭指向左)、或有義序列(箭頭指向右)。這些DNA元件可包含包含至少一個(gè)反義DNA區(qū)段的DNA，該反義DNA區(qū)段對(duì)至少一個(gè)第一靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的，或包含多拷貝的至少一個(gè)反義DNA區(qū)段的DNA，該反義DNA區(qū)段對(duì)至少一個(gè)第一靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的(圖3A)；包含至少一個(gè)有義DNA區(qū)段的DNA，該區(qū)段是至少一個(gè)第一靶基因的至少一個(gè)區(qū)段，或包含多拷貝的至少一個(gè)有義DNA區(qū)段的DNA，該有義DNA區(qū)段是至少一個(gè)第一靶基因的至少一個(gè)區(qū)段(圖3B)；可轉(zhuǎn)錄為RNA并通過形成雙鏈RNA而抑制至少一個(gè)第一靶基因的DNA，并且該DNA包含至少一個(gè)反義DNA區(qū)段和至少一個(gè)有義DNA區(qū)段，該反義DNA區(qū)段對(duì)至少一個(gè)靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的，而該有義DNA區(qū)段是至少一個(gè)第一靶基因的至少一個(gè)區(qū)段(圖3C)；可轉(zhuǎn)錄為RNA并通過形成一個(gè)雙鏈RNA而抑制至少一個(gè)第一靶基因的DNA,并且該DNA包含多個(gè)連續(xù)反義DNA區(qū)段和多個(gè)連續(xù)有義DNA區(qū)段，這些反義DNA區(qū)段對(duì)至少一個(gè)第一靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的，而這些有義DNA區(qū)段是至少一個(gè)第一靶基因的至少一個(gè)區(qū)段(圖3D)；可轉(zhuǎn)錄為RNA并通過形成多個(gè)雙鏈RNA而抑制至少一個(gè)第一靶基因的DNA，并且該DNA包含多個(gè)反義DNA區(qū)段和多個(gè)有義DNA區(qū)段，這些反義DNA區(qū)段對(duì)至少一個(gè)第一靶基因的至少一個(gè)區(qū)段而言是反義的，而這些有義DNA區(qū)段是至少一個(gè)第一靶基因的至少一個(gè)區(qū)段，并且其中所述多個(gè)反義DNA區(qū)段和多個(gè)有義DNA區(qū)段以一系列反向重復(fù)序列方式排列(圖3E)；和包含從miRNA獲得的核苷酸的DNA、或包含siRNA的核苷酸的DNA(圖3F)。圖3F描繪了可由DNA元件的實(shí)施方案轉(zhuǎn)錄而來的、用于抑制靶基因表達(dá)(例如內(nèi)源miRNA)的雙鏈RNA的各種非限制性排列，用于本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體。當(dāng)形成這樣的雙鏈RNA時(shí)，它可抑制一個(gè)或多個(gè)靶基因，并且可形成一個(gè)雙鏈RNA或多個(gè)雙鏈RNA、或一個(gè)雙鏈RNA“莖”或多個(gè)“莖”。當(dāng)形成多個(gè)雙鏈RNA“莖”時(shí)，它們可以“錘頭”或“三葉草”形式排列。在某些實(shí)施方案中，雙鏈莖可形成“假結(jié)(pseudoknot)”排列(例如當(dāng)一個(gè)雙鏈莖的間隔區(qū)或環(huán)RNA形成第二雙鏈莖部分時(shí))；參見例如以下文獻(xiàn)中對(duì)假結(jié)構(gòu)造的描述Staple和Butcher(2005)PLoSBiol.,3(6):e213。間隔DNA(位于dsRNA區(qū)之間或鄰近dsRNA區(qū))是任選的，但通常包含和一般包含不符合靶基因的DNA(盡管在某些實(shí)施方案中可包含靶基因的有義或反義DNA)。間隔DNA可包含以下序列其可轉(zhuǎn)錄為單鏈RNA或至少部分雙鏈RNA(例如以“相吻莖環(huán)”排列)、或可轉(zhuǎn)錄為假定二級(jí)結(jié)構(gòu)或三維構(gòu)型(例如靶基因或適配子的反義序列的大環(huán))的RNA，該RNA賦予轉(zhuǎn)錄物額外的所需特性，例如穩(wěn)定性提高、體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)或者細(xì)胞特異性或組織特異性提高。用于抑制靶基因表達(dá)的DNA元件和方法的其它描述可參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)公布說明書2006/0200878，其通過引用結(jié)合到本文中。實(shí)施例4本實(shí)施例描述使用微RNA、微RNA前體、微RNA識(shí)別位點(diǎn)和微RNA啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的方法的非限制性實(shí)施方案。miRNA或其識(shí)別位點(diǎn)的不同潛在用途由miRNA的表達(dá)圖式來表示。有關(guān)給定成熟miRNA的表達(dá)的空間或時(shí)間分布或誘導(dǎo)性的知識(shí)可用于例如設(shè)計(jì)以空間或時(shí)間或誘導(dǎo)型特異性方式來表達(dá)的重組構(gòu)建體。確定成熟miRNA的表達(dá)圖式的一個(gè)非限制性方法是通過分離成熟miRNA(或其前體)并通過用合適探針(即對(duì)成熟miRNA或miRNA前體具有特異性的探針)的RNA印跡來分析表達(dá)圖式。圖4描繪了從不同玉米組織中分離的成熟miRNA的RNA印跡結(jié)果的非限制性實(shí)施例。將一個(gè)探針與來自兩個(gè)家族(miR156和miR157)的成熟miRNA雜交。各個(gè)成熟miRNA在特定細(xì)胞或組織中以不同水平表達(dá)，例如Zm-miR390在根和成長(zhǎng)葉中不表達(dá)或僅以低水平表達(dá)，而miR156在根、葉和雄花穗(tassel)中表達(dá)。因此，例如，包含由組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元和被玉米miR390成熟miRNA識(shí)別的miRNA識(shí)別位點(diǎn)的本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)基因在根和成長(zhǎng)葉組織中表達(dá)，但不在高水平表達(dá)成熟miR390的組織中表達(dá)。為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的構(gòu)建體和方法在調(diào)控轉(zhuǎn)基因表達(dá)中的用途，用報(bào)道基因作為轉(zhuǎn)基因本身，或者作為轉(zhuǎn)基因的替代物。例如，當(dāng)需要報(bào)道基因(例如綠色熒光蛋白，GFP)在玉米稈和未成熟穗組織中表達(dá)時(shí)，將miR156靶位點(diǎn)包含在GFP表達(dá)盒中并在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因玉米植物中、在CaMV35S啟動(dòng)子控制之下表達(dá)。在強(qiáng)表達(dá)miR156的組織(例如根、葉和雄花穗)中，GFP表達(dá)被抑制。抑制表型可局限于受抑制組織內(nèi)非常特殊的細(xì)胞類型，而鄰近細(xì)胞表現(xiàn)出在鄰近表達(dá)成熟miR156的細(xì)胞的GFP的表達(dá)或表達(dá)梯度。確定成熟miRNA的表達(dá)圖式的另一個(gè)非限制性方法是通過分析包含成熟miRNA序列的核酸序列的轉(zhuǎn)錄概況，例如通過包括以下步驟的通用方法(a)提供包含莖環(huán)區(qū)的起始miR序列，例如來自"miRBase，，數(shù)據(jù)庫(可得自microrna.sanger.ac.uk/sequences)中的公眾可得的miR序列；(b)使用序列分析算法，例如本領(lǐng)域眾所周知的BLAST(參見Altschul等(1990)J.Mol.Biol.，215:403_410)，鑒定同源或相同序列(例如根據(jù)用玉米全基因組DNA制備的微陣列探針組上的專有序列)；和(c)分析步驟(b)中鑒定的同源探針組序列的轉(zhuǎn)錄概況并鑒定在所需組織(即雄性或雌性生殖組織)中具有表達(dá)圖式的miRNA。優(yōu)選加上第4步(d)對(duì)于發(fā)現(xiàn)具有所需轉(zhuǎn)錄概況的同源探針組序列來說，證實(shí)對(duì)miRNA基因的鑒定，即通過將起始miR序列的莖環(huán)序列與探針組序列進(jìn)行比對(duì)，或者對(duì)于潛在新的miRNA，確定序列預(yù)測(cè)能折疊成miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)特征。還優(yōu)選使用任選步驟，其中包括針對(duì)額外序列數(shù)據(jù)組(dataset)(而不是探針組序列數(shù)據(jù)組)的一個(gè)或多個(gè)BLAST比較(在以上步驟(b)之前)，允許對(duì)落入miR基因預(yù)測(cè)折回區(qū)之外的探針進(jìn)行進(jìn)一步鑒定；假陽性(例如因?yàn)樵诎徽_剪接片段重疊群(contigs)的額外序列數(shù)據(jù)組的匹配所致的假陽)，因其缺乏miRNA特征(例如合適折回結(jié)構(gòu))而得以鑒定并除去。圖5描繪了探針組序列的轉(zhuǎn)錄概況，這些序列用前述段落所述方法鑒定為包含對(duì)玉米雄性生殖組織(花粉)具有特異性的表達(dá)圖式的miRNA前體序列。這些miRNA前體適用于本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體，其設(shè)計(jì)用于在非天然條件下(例如在對(duì)miRNA前體而言并非天然啟動(dòng)子的啟動(dòng)子的控制之下)表達(dá)天然miRNA(在該實(shí)施例中，為花粉特異性miRNA)。這些miRNA前體也可用于提供可經(jīng)修飾或工程改造以抑制并非天然或內(nèi)源靶基因的靶基因的“支架(scaffold)”序列。本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的一個(gè)非限制性實(shí)例包含用于驅(qū)動(dòng)編碼蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)殺蟲蛋白或蛋白片段(“Bt”)的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子和花粉特異性miRNA的識(shí)別位點(diǎn)，導(dǎo)致Bt在除花粉之外的植物組織中強(qiáng)表達(dá)。另外，這些miRNA前體的天然啟動(dòng)子可用于任何目標(biāo)基因的花粉特異性表達(dá)。在一個(gè)替代方法中，使用例如以下文獻(xiàn)所述的序列互補(bǔ)法則，可鑒定現(xiàn)有(天然或內(nèi)源)miRNA識(shí)別位點(diǎn)Zhang(2005)NucleicAcidsRes.,33:W701_704和Rhoades等(2002)Cell，110:513_520。使天然miRNA識(shí)別位點(diǎn)充分突變(例如通過化學(xué)誘變)，以減少或防止切割(參見Mallory等(2004)Curr.Biol.，141035-1046)。因此，可使含有天然miRNA識(shí)別位點(diǎn)并具有所需效應(yīng)(例如葉片或種子大小增加)的基因發(fā)生突變，因而其表達(dá)水平比當(dāng)存在未突變天然或內(nèi)源miRNA識(shí)別位點(diǎn)時(shí)更高。一個(gè)實(shí)施方案是用工程同源物替代天然基因，其中天然miRNA已發(fā)生突變或者甚至缺失，這樣對(duì)給定miRNA切割的敏感性更低。該方法的另一具體實(shí)例是在玉米根中基本不表達(dá)、但在大多數(shù)其它組織表達(dá)的成熟miRNA(例如但不限于miRNA162、miRNA164或miRNA390，如圖4所示)的一個(gè)或多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)包含在重組DNA構(gòu)建體中，用于以轉(zhuǎn)基因的形式表達(dá)蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白或蛋白片段(“Bt”，參見例如以下文獻(xiàn)中公開的蘇云金芽孢桿菌殺蟲序列和方法及其應(yīng)用美國(guó)專利號(hào)6，953，835和美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/713，111，2005年8月31日申請(qǐng)，通過引用結(jié)合到本文中)，例如在包含表達(dá)盒e35S/Bt/hspl7的構(gòu)建體中。表達(dá)盒中包含這些識(shí)別位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)，能降低轉(zhuǎn)錄物在并非根的大多數(shù)組織中的表達(dá)，但在根中維持高水平的Bt靶RNA表達(dá)，例如最好用于害蟲例如玉米根蟲的防治。在類似實(shí)施方案中，構(gòu)建體中包含不同miRNA識(shí)別位點(diǎn)的組合，以便在一種或多種特定組織中得到所需表達(dá)圖式。_例5本實(shí)施例描述作物微RNA及其前體(折回)結(jié)構(gòu)的額外非限制性實(shí)施方案，用于制備本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體。通過30個(gè)玉米文庫的高通量測(cè)序(Margulies等(2005)Nature,437:376_380)，總共得到1327933個(gè)獨(dú)特小RNA(長(zhǎng)度為20-24個(gè)核苷酸)。所得序列用于根據(jù)玉米基因組序列來預(yù)測(cè)玉米微RNA及其前體結(jié)構(gòu)，使用以上實(shí)施例1所述的方法。在1576個(gè)專有玉米基因組序列中預(yù)測(cè)共有1192小RNA是新miRNA。玉米miRNA及其相應(yīng)的miRNA前體、以及各miRNA前體序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列標(biāo)識(shí)號(hào)歸于下表4玉米miRNA(SEQIDNO.2730-3921)和玉米miRNA前體序列(SEQIDNO.3922-5497)。表4玉米和水稻miRNA和miRNA前體<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>4(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>表<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>實(shí)施例5本實(shí)施例描述作物微RNA及其前體(折回)結(jié)構(gòu)的額外非限制性實(shí)施方案，用于制備本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體。自在水脅迫和對(duì)照條件下生長(zhǎng)的玉米(Zeamays)或大豆(Glycinemax)制備小RNA文庫(表5)。用從1.0(無影響或?qū)φ?至4.0的相對(duì)評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)干旱期的大豆；大豆植物各期的實(shí)例見圖6。由此得到的小RNA序列用于分別根據(jù)玉米或大豆基因組序列預(yù)測(cè)額外的新的微RNA及其前體(折回)結(jié)構(gòu)，使用以上實(shí)施例1所述的方法。從玉米中，在1725個(gè)玉米基因組序列中預(yù)測(cè)1186個(gè)玉米miRNA，而從大豆中，在181個(gè)大豆基因組序列中預(yù)測(cè)134個(gè)大豆miRNA(表6)。這些miRNA及其相應(yīng)的miRNA前體序列、以及各miRNA前體序列中成熟miRNA的核苷酸位置，可按其各自的序列標(biāo)識(shí)號(hào)歸于下表6玉米miRNA(SEQIDNO.5498-6683)、玉米miRNA前體序列(SEQIDN0.6684-8408)、大豆miRNA(SEQIDN0.8409-8560)和大豆miRNA前體序列(SEQIDN0.8561-8417)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>*對(duì)于自大豆制備的文庫39和41，將所示各期的樣品合并在一起；大豆干旱期用以下相對(duì)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)1.O=無影響1.5=分生組織或1片三小葉枯萎2.O=2片三小葉枯萎2.5=所有三小葉都枯萎3.O=底部三小葉完全干枯易碎3.5=除頂部一片之外，所有三小葉都完全干枯易碎，頂部三小葉仍然柔軟4.0=所有都完全干枯易碎表6:玉米和大豆miRNA和miRNA前體<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>6(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>表<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>6(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>表<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>也發(fā)現(xiàn)類似用途，這類miRNA例如在營(yíng)養(yǎng)充足和營(yíng)養(yǎng)不足條件、或者在熱脅迫和熱非脅迫條件下具有差異表達(dá)圖式的miRNA。合適方法包括將外源miRNA識(shí)別位點(diǎn)引入序列，缺失或修飾序列中的內(nèi)源miRNA識(shí)別位點(diǎn)，工程改造天然miRNA或miRNA前體序列，以便識(shí)別并非內(nèi)源靶序列的序列，以及利用miRNA啟動(dòng)子來提供特定表達(dá)圖式。實(shí)施例6本實(shí)施例描述具有特定表達(dá)圖式的作物miRNA(miRMONIS)的鑒定，所述表達(dá)圖式的特征為在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制。按照實(shí)施例1和實(shí)施例5所述技術(shù)，從水稻(Oryzasativacv.Nipponbare)、玉米(Zeamaysvar.LH244)和大豆(Glycinemaxvar.A3525)的不同組織和發(fā)育期克隆小RNA并鑒定推定的miRNA。將各文庫的小RNA豐度標(biāo)準(zhǔn)化，并按照轉(zhuǎn)錄物/四分之一百萬序歹ll(transcriptsperquartermillionsequence,tpq)來計(jì)算。在水禾(SEQIDNO.393)、玉米(SEQIDNO.3227)和大豆(SEQIDNO.8742)小RNA文庫中鑒定出具有序列UUAGAUGACCAUCAGCAAACA的推定的成熟miRNA(小RNA編號(hào)為370903，已確定俗名為"miRM0N18”)。該序列與miRBase中的已知miRNA不匹配。從水稻基因組中鑒定出miRM0m8前體序列為CCAUGAACCU⑶UUUGUUGCUG⑶CAUCUAGCUACCCGUGCAUGCCUGGAGAUUGGAGAAUAAUUGACGAUGCAGCAGUCGGCUUAUUGGCUCUUGGGCACGC⑶GGUUAGAUGACCAUCAGCAAACAA⑶UC⑶GAG,(SEQIDNO.1763，圖7B)。從可用的玉米基因組數(shù)據(jù)中鑒定出另一推定的miRM0m8前體序列為CUCCGAACCU⑶UUUGUUGGUG⑶CAUUUAACCAUGCAUGCUUCGAUCGAUGGAUUGGUGCAUGCAUGGAUUAUUGCAUA⑶⑶GAUGCAUGUGGCGCAUCA⑶GCAUGGUUAGAUGACCAUCAGCAAACAU⑶UCUUGAG(SEQIDN0.3936，圖7A)。成熟miRM0N18的位置在以上這些前體序列(SEQIDN0.1763和SEQIDN0.3936)中用下劃線標(biāo)明。各miRM0N18前體預(yù)測(cè)能形成折回結(jié)構(gòu)(圖7A和7B)，成熟miRNA(miRMONIS)位于折回結(jié)構(gòu)3’臂內(nèi)，而預(yù)測(cè)miRNA*(“miRM0N18*”)位于5，臂；這與相對(duì)于在單個(gè)玉米基因座MRT4577_378723C.3中觀察到的miRM0N18*而言、豐富得多的成熟miRM0N18是一致的。在擬南芥中鑒定出具有序列UGCAACCCUUGAAUGUGUUUGUUGAUUGAUAUCUACACAUGUUGAUCAUCCUUGUGUUGAUCGAUUGGUUUAGAUGACCAUCAACAAACUCUUUCGUG⑶UUUGCA(SEQIDN0.8743，圖7C)的折回結(jié)構(gòu)為序列UUAGAUGACCAUCAACAAACU(miR827,SEQIDN0.8744)的相對(duì)成熟miRNA的前體。在擬南芥中僅觀察到低豐度的成熟miR827。這兩種成熟miRNA的比對(duì)表明，miR827與miRM0N18有2個(gè)核苷酸的差異(圖7D)。miRMONIS與miR827間的這2個(gè)核苷酸差異看來是在單子葉植物和雙子葉植物中是保守的，其中在玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)和甘蔗(Saccharumofficinarum，數(shù)據(jù)未顯示)中鑒定出miRM0N18，而在雙子葉植物(擬南芥)中鑒定出miR827。RNA印跡證實(shí)miRM0N1821聚體在采自正常(非脅迫)條件下生長(zhǎng)的植物的至少水稻(谷粒和秧苗)和玉米(籽粒、葉和根)組織樣品中表達(dá)，見圖8A。微RNA前體起源自由RNA聚合酶II產(chǎn)生的聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄物，玉米miRM0N18前體(SEQIDN0.3936，對(duì)應(yīng)于探針組AlZM068928_at)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄概況分析進(jìn)一步證實(shí)在玉米胚乳、愈傷組織和幼苗中表達(dá)提高(圖8B)，而在該樣品其它組織中的表達(dá)落入500單位的檢測(cè)截止閾值以下。對(duì)玉米miRM0N18前體(SEQIDN0.3936)在缺水(干旱)(圖9A)、低溫(圖9B)和缺氮條件下(圖9C)生長(zhǎng)的植物的玉米組織中的表達(dá)進(jìn)行了分析。miRMONIS前體的表達(dá)在根、芽、穗、籽粒和雄花穗中相對(duì)不受水條件的影響，而相對(duì)于水充足條件而言，在缺水條件下在葉和穗絲(silk)中的表達(dá)增加(圖9A)；表達(dá)也相對(duì)不受溫度的影響(圖9B)。然而，miRMONIS表達(dá)對(duì)氮條件高度應(yīng)答，其中相對(duì)于在充足氮(20毫摩爾(mM)硝酸銨)時(shí)觀察到的表達(dá)而言，在氮限制(2毫摩爾(mM)硝酸銨)時(shí)觀察到約2倍抑制(圖9C)。通過對(duì)小RNA樣品的RNA印跡的磷光體成像定量測(cè)定(phosphorimagequantification)，證實(shí)了這種氮_應(yīng)答表達(dá)圖式，在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯示出對(duì)成熟miRMONIS21聚體的平均9.6倍的抑制(圖10A)。因此，miRM0N18在玉米胚乳和玉米籽粒中顯示出總表達(dá)增加，而在缺氧誘導(dǎo)的葉中強(qiáng)抑制。在另一實(shí)驗(yàn)中，在水培系統(tǒng)中在充足磷下培養(yǎng)玉米，直到V3期，然后剝奪磷多達(dá)3天。在磷剝奪開始后的第1天和第3天采集葉組織樣品。在第3天，讓植物恢復(fù)到磷充足條件，恢復(fù)后30分鐘和6小時(shí)采樣。在各時(shí)間點(diǎn)從在磷充足條件下持續(xù)培養(yǎng)的植物中采集對(duì)照樣品。圖IOB描繪了用miRMONIS探針分析的RNA印跡結(jié)果，證明在該實(shí)驗(yàn)中，在葉組織中，玉米miRM0N18成熟miRNA在磷充足條件下表現(xiàn)出強(qiáng)表達(dá)，而在缺磷條件下表現(xiàn)出抑制。實(shí)施例7本實(shí)施例描述具有被作物miRNA(miRM0N18)天然調(diào)節(jié)的miRNA識(shí)別位點(diǎn)(miRMONIS識(shí)別位點(diǎn))的基因的鑒定，其中表達(dá)圖式的特征為在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制。鑒定出成熟miRM0N18(UUAGAUGACCAUCAGCAAACA，SEQIDΝ0·393，SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)的推定靶標(biāo)，其包含SPX(“SYGl/Pho81/XPRl”)結(jié)構(gòu)域家族中的基因進(jìn)化枝。SPX結(jié)構(gòu)域?qū)儆诿Q為PfamPF03105的蛋白質(zhì)家族/結(jié)構(gòu)域，并且發(fā)現(xiàn)它是若干蛋白質(zhì)的N-端的疏水結(jié)構(gòu)域，通常包含約180個(gè)殘基的一段，其具有35-47個(gè)氨基酸的3個(gè)較小亞結(jié)構(gòu)域；參見例如JaneliaFarmsResearchCampusoftheHowardHughesMedicalInstitute的Pfam數(shù)據(jù)庫的SPX詞條，公眾可得自pfam.janeIia.org/family？acc=PF03105。SPX結(jié)構(gòu)域家族中的大多數(shù)蛋白質(zhì)在其C-端都包含其它保守結(jié)構(gòu)域。例如，SPX結(jié)構(gòu)域家族中的若干蛋白質(zhì)在其C-端也包含EXS("ERDUXPRl和SYGl”)結(jié)構(gòu)域，PfamPF03124，其可參與蛋白質(zhì)分選；參見例如pfam.janeIia.org/family？acc=PF03124。其它SPX蛋白包括保守VTC(液泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(vacuolartransporter)陪伴分子2)結(jié)構(gòu)域，PfamPF09359；參見例如pfam.janelia.org/family？acc=PF09359。若干SPX蛋白包含保守MFS_1或MFS("majorfacilitatorsuperfamily”)結(jié)構(gòu)域，PfamPF07690，其可參與小的糖和無機(jī)鹽等小溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，以應(yīng)答化學(xué)滲透離子梯度；參見pfam.janelia.org/family？acc=PF07690。SPX結(jié)構(gòu)域可能是轉(zhuǎn)錄因子，并且可作為二聚化結(jié)構(gòu)域。SPX蛋白包含PHO基因所編碼的那些，其可參與將無機(jī)磷加載到根的木質(zhì)部；參見例如Wang等(2004)PlantPhysiol.，135:400_411，該作者描述了對(duì)若干PHOl同源物的鑒定、在這些蛋白質(zhì)內(nèi)SPX結(jié)構(gòu)域的保守性、以及PHOl啟動(dòng)子在根、葉、莖或花等維管組織和某些非維管組織中的優(yōu)勢(shì)表達(dá)。SPX結(jié)構(gòu)域家族中的蛋白質(zhì)可能參與G-蛋白締合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(因此可能是無機(jī)磷的感受器)；參見Ticconi和Abel(2004)TrendsPlantSci.,9548-555。PHOl基因同時(shí)包含SPX結(jié)構(gòu)域和EXS結(jié)構(gòu)域。PHO進(jìn)化枝成員也包含RING結(jié)構(gòu)域(Atlg02860和At2g38920)或MFS結(jié)構(gòu)域(At4g22990、At4gll810和Atlg63010)；參見Wang等(2004)PlantPhysiol.，135:400_411，尤其是圖3和圖6d。目前，已報(bào)道名稱為NLA的基因是在擬南芥中低氮利用率的適應(yīng)性所需的；參見Peng等(2007)PlantCell，50:320_337。NLA("AtNLA，，，locusAtlg02860)，稱為UniProtKB/Swiss-Prot檢索號(hào)Q2V4F9，具有序列MRT3702_101115C，SEQIDNO.8745；有關(guān)NLA蛋白的注釋公眾可自beta,uniprot.org/uniprot/Q2V4F9禾口pfam.janeIia.org/protein？id=Q94C80_ARATH。具有序列SEQIDNO.8745的擬南芥NLA基因含有SPX結(jié)構(gòu)域、MFS_1結(jié)構(gòu)域和RING結(jié)構(gòu)域，并包含位于核苷酸位置135至155的miR827識(shí)別位點(diǎn)(靶)序列TGTTTGTTGATGGTCATCTAA(SEQIDN0.8746)，其已證實(shí)為擬南芥miR827的靶標(biāo)。NLA編碼C3HC4-型環(huán)指(RING-finger)泛蛋白連接酶(AT1G02860.1,SEQIDN0.8747)；該基因若發(fā)生突變就會(huì)破壞擬南芥對(duì)氮限制的適應(yīng)性。對(duì)AtNLA基因的10個(gè)額外克隆進(jìn)行了測(cè)序?？寺?、4和5含有部分AtNLA序列(SEQIDN0.8748)?？寺?含有缺乏SPX結(jié)構(gòu)域的AtNLA序列(SEQIDN0.8749)?？寺?含有缺乏RING結(jié)構(gòu)域的AtNLA序列(SEQIDN0.8750)?？寺?含有具有位于核苷酸位置2142-2162的破壞的miR827識(shí)別位點(diǎn)(靶序列)的基因組AtNLA片段(SEQIDN0.8751)?？寺?含有另一AtNLA序列(Atlg63010，SEQIDNO.8752)。克隆8含有具有位于核苷酸位置2142-2162的破壞的miR827識(shí)別位點(diǎn)(靶序列)的另一基因組AtNLA片段(Atlg63010，SEQIDNO.8753)?？寺?含有缺乏SPX結(jié)構(gòu)域的另一AtNLA序列(Atlg63010，SEQIDNO.8754)。克隆10含有缺乏MFS結(jié)構(gòu)域的AtNLA序列(Atlg63010，SEQIDNO.8755)。大量“實(shí)際”cDNA自玉米基因組和cDNA序列裝配，描述了miRM0N18所靶向的獨(dú)立基因。這些新的miRM0N18靶標(biāo)(“SPX_MFS_117961287”，來自BAC的GI117961287)中的第一個(gè)具有序列SEQIDN0.8756并包含核苷酸位置326-328的ATG起始密碼子和核苷酸位置2414-2416的TGA終止密碼子；由SEQIDN0.8756編碼的最長(zhǎng)可讀框(翻譯框=2)具有氨基酸序列SEQIDN0.8757。這第一個(gè)新的miRM0N18靶基因的一個(gè)替代剪接形式是SEQIDN0.8758(“SPX_MFS_117961287_2”)，其包含核苷酸位置87-89的ATG起始密碼子和核苷酸位置1137-1139的TGA終止密碼子；由SEQIDN0.8758編碼的最長(zhǎng)可讀框(翻譯框=3)具有氨基酸序列SEQIDN0.8759。這些新的miRM0N18靶標(biāo)中的第二個(gè)具有序列SEQIDN0.8760(“SPX_MFS2”，來自BAC的GI=118200525)并包含核苷酸位置201-203的ATG起始密碼子和核苷酸位置2295-2297的TGA終止密碼子；由SEQIDN0.8760編碼的最長(zhǎng)可讀框(翻譯框=3)具有氨基酸序列SEQIDN0.8761。這個(gè)第二新的miRM0N18靶基因的一個(gè)替代剪接形式是SEQIDN0.8762(“SPX_MFS_117961287_2”)，其包含核苷酸位置145-147的ATG起始密碼子和核苷酸位置1189-1191的TGA終止密碼子；由SEQIDN0.8762編碼的最長(zhǎng)可讀框(翻譯框=1)具有氨基酸序列SEQIDN0.8763。第三個(gè)新的miRM0N18靶標(biāo)包含來自EST數(shù)據(jù)的凹凸(stitched)cDNA序列并具有序列SEQIDN0.8764(來自BAC的GI126116193)并在核苷酸位置217-219和1034-1036包含2個(gè)可能的ATG起始密碼子以及在核苷酸位置2093-2095包含TGA終止密碼子。通過同源性從兩個(gè)可能可讀框預(yù)測(cè)2種蛋白質(zhì)；第一種蛋白(預(yù)測(cè)移碼為1)含有625個(gè)氨基酸并具有序列SEQIDN0.8765，而第二種蛋白含有353個(gè)氨基酸并具有序列SEQIDN0.8766。用ClustalWa.82版)對(duì)這些新的玉米miRM0N18靶基因所編碼的肽進(jìn)行比對(duì)；所得多序列比對(duì)見圖11，顯示出玉米SPX結(jié)構(gòu)域(用下劃線序列表示，如果有的話)和玉米MFS結(jié)構(gòu)域(用黑體序列表示)。自BAC115312385的額外克隆工作證實(shí)第一miRM0m8的序列(“SPX—MFS—117961287”，SEQIDNO.8756)并產(chǎn)生基因組SPX—MFS2序列SEQIDNO.8767，其中進(jìn)一步鑒定出前導(dǎo)序列(用斜體表示)、5’內(nèi)含子(用下劃線表示)、外顯子(用大寫字母表示)和miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)(位于SEQIDNO.8767核苷酸2628-2648并用黑體表示)導(dǎo)序列(用斜體表示)、5’內(nèi)含子(用下劃線表示)、外顯子(用大寫字母表示)和miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)(位于SEQIDNO.8767核苷酸2628-2648并用黑體表示)gttacaaggcaatatttttgtagaataaaatcttaaaggaaactcaactccacgaattggtcacttgcattaaatcatattgtgggtctcttttagttgcatcttaagatggcggcaacaagatttcaagcactttttatctagtgaccgcaatgcactggagataaataagaatccaaatattatttttgataaccttgacactatttaaatcttcttataagtgacgaagtagtttgatcaacaataaaaacgtatagatttcaacattttttgcgattgtaggatatatgttagcaaatattttaagcaaaataatatttttatctataatctctatatggattattctagattttggggaccctatataaaattagctatgagtattaacacttgataatcttgcctagaatgtcttcgatttctgggtctaccactacacctaactgagtttaaccctgcaataaataattaatctcgtgaaatcatttggagattttgactcaatttaaataggtagctactgtgtagttaggttgaaccaggacaccaggtgtaacacgagtcacatatgcatgcatgtgtattgactcaatcggccggcgcacgctatgatggtgctagaaaatgttttatacggctgtgaaaggtgtaacctgtgctgtgtcgcaaacaatatattgtttaactttgtttggccttgaactcctgggggcaaacataagatataaaagatcgatatgcctttcatgattccgtcataatctcgaccgtaattaaggcccgctctatataaacctttaaagcaaattgttagtcatataataatttattagttggattgatgcaacaaataacaactatttatttaagattaactaacttctcagttaaatttagtcactaactattagttttagaggtttggaacatgttataagaacctaaccggtctctcaacgttacaaaagctatcatatttgaacccccgtcatcggagcgcacacgttttattttgttctgttcatgtctatgctgagatactaaaattttgtgcacaagactacaaggacgagagcacctaatgaggtattaatcggttattcaaattccgtaagagttgggggtattggaagagattattagaatttttgacctgttaagatttaaacccacttaatttcttgcaacacatactgcaggtcctcagatagcgaggcgcagtcgcgcagaccgcagagcgccgaatcgtgagaaggatcagaagtgcttgttacttccgtacgggttagagcatctccaacaacgtgacctataaaaatgccctataatttgaaaatgagtatattttatagaatttagggcaccaacaaaacaccccgctccaacagtaaagccccaaatctagattatagggcagcccactacggtgtagtatatttgagtcacttgagagggtgccctatagttttttgacaaaattttatgaaatggagcactgttggagtagtttttcctgtgtagagccctatatttcaatttgaggcactagtttgaggcattgttggagatgctcttacaaatacacggaacatatttgggttcagcaacagggacggacggacggcgcgccgtgttctacagacttgccgtcgctgcttctgcatctgttcgaaaaccgtaacccccgtgcaccgctggtcagtagtcgtcgtttcgtttcgtttcgtttcgtcgcggcgatcttcgaaccgatgaagcgtggcacttggctggttggtggtggtacgccgggccagaaggtgacctgcctcgatccgaataccatgcatcgatctgtgcacgtgcctgttctcttcctactccgattaccgatagtccgggccgggaaaaagagcgcgaagccagatctgaccactaggggtctgtttggttggtttctctcgccaacctggctgtgtgagccaggatcactggagcctggctctgaagatacgaccaatctgctcgtatctggtgagectggcccaaggtgctttaaggatcgtgcgagtctggattcaaatctacatgcagacaaccaaacacagagctcgcacgcgcatagcttggctcatagcaaccaaacagcagctacccgcatcccgcgacgcaagcacgcgcagatgcaggcaaccaaacagaccccaggtgatccaggtcgtcgaatgttccacgcgaaccgcagccgcgagtgccgtctccggctccgccacaggtagagctcagagcagaaaatgctccagccacctgtctctcttcttcctccttcctgccctgcacgcggctataagtacccaccgccatctcactttgcccagcagcacggcagtagctgcgccattgcacgcctccggccggcggctgcttgtcttgctgcttctgccgcacatccgtgatccgtacgtcgtcacctcaccactcacgcacaagcacaaagagcgttaatttcttgctggagattctattctatttctatggcgtgtccctgatcgaatcctaaatcctaaacctctgtggtgcactgcagggcagaaggtgcttcgttcgttgcaggcctggcgccacgccgtaccgtgcaagcgCGTTTGCTGATGTTCATCTAAttactgtataataatatctccgggcgaaagagctagcaatcgtcggcgggggaggaggggctcgattgctgctcaaggtgagttgtaattccttggctctggatttccctatctgttggctgttcatggatcatccaatggatggatggcgctccctgttctctacacctgcgtgctcttcttccctcgcctcgccggggtcttgtgtcagttactgtatctccctgttgattttaaaatctaagaagcaacaacaaaagatgattcaaaaaaatattc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AGGTATAGAACGAAGGCAGGATGAGAACTCAGAAGTTAATGATGATACTGAAGTAGAGTCAGAAAGCTCTCATGAACCAGCAACATCAATTGCTTCAGCATACAGATTGCTAACTCCATCTGTGAAGGtttccttccccctcccttcccaattatcgatttttctttgtcttgttcttggttcaaacgtttgaaagaaagaagctcacaatctacatagggttcttttgtaaataaagttagataaattaactatataatataataaaactgcatctttaaatagtaatgggtaaatacattccagttactagtaggtacatctgcatgtcatacaagcaaacataacggacacgccatgtaaaagaaactaggccaacctaggagaaactaggttgcatttattattatattattattaagatgaaaataggcacccaaatttaccttgacaaggacttgaacctaggtggtctgggtttacgagcacacccttgaccaagtgagctagctcagttcccttgacacaccagccagatgaaaagttgcatgtgcagctacccctttttccacgcccttttcatcttccaatctttgttggagctaccttctcatgtattcatatctttaaaaaatggttgtttgtcAGGCCCAGCTACTGATATACTTCATGCTCAAGTACGCAATGGAAATACTACTATCAGAATCGAGCGTTGTCACCACATACTATTTTAGCTGGTCTACAAGTGCTGTGGCTATCTTTCTAGCGATTCTTGGATTAACGGTTCTTCCAGTAAATGCCATTGTTGGAAGCTACGTTACAAATTTATTCGAGGATAGGtaagctttgtactcttacaaaacatactacatgaaacttttatattctctagacattgtttttctcttaaactgagacatgctttcacaaaataagaacttgctctatcatttgcaggCAAATTTTGTTGGCATCTGAAGTCATGGTTCTCATCGGTATAATCATGAGCTTTTGTTTCACACCTCACTACTCCATCCCGCAATATGTTCTTTCAGCTTTCATCACATTTGTATTTGCTGAGGTGCTTGAaggtatgtatgtttatatacattaatggtttgagacagcgaaacctaaatcaatcatacgctgctgatttatcagccactcaacttctaacctcgagctatgcAGGAGTGAATCTGTCCTTGCTCTCACGAGTAATGTCATCGAGGCTTTCCCGAGGGACCTACAATGGTGGACTCCTTTCGACAGAGGCCGGGACGTTGGCCCGTGTAGTTGCAGATGCCACGATTACTGCAGCCGGTTATCTCGGCACGGACCTCCTTCTGAATGTCACTCTTCTCCCATCCCTTGTGATTTGCATAGTCTCCATCGCAGCAGCACTCTACACTTACAACAATCTCTATTGAagctattgttgctgtacaagtgtacaacaatgttcctaagctaaaatgttcctgcccacaacgggtttgtatatctgttcaagcatggtttgtaaacattttgatcaagtttgtatgcaaaatttcttgtatttagtgcatttatgtaaagattcatcctgtaaagaattataaactatgagacgctattgccatttatgatcatttatgtttatctttttagccttatgttatttgaatttgtctaatcaatgccatcttccatcacgagcacatcattgacatattactgatggatagacctttttgggacgtgagatgctaaaggcacaacctatatagctgaaaatttctaacatatttatcaataataccaagatgcctttgttgtttatcaattgcacattatttcaacgtaaatgcaattttgttaaatatgtcatggtgtcgagcctactgcttaccccagcatgttgaattgctgccttaagcagaaacatcgaaaaacctgcgtagattccacgatccaacaatcctctccgttcatttttttagttccatatgaaaggaccgattacgtctgaaagaagagtttcattagacaatctatttcttttaactaatgcctctagtttttcaaaacctatgcaataaataggtgtaactatagttttgactaagggttgtaatctctttgtaaaatatttatgcaatctcgatttcaaatctatccactagcctaacaactaataagataaaacatacaaccaagatacataatataaatacgggagcttaaatacgatatacatataaactcttattgatgactccattgtttttatcgagataccaagaaagacgcaagtttctccctagtcctcattggagcccagtccgcgcgagtaccaagctctcggtcaggtaacattgtggatagcctaggttttttgccacacacaagtgggtctttagtgtagcctcttctaaatgctctctatcaaaggtggtccaggaaaagattcaaaatggggccctagcagtagtagtattactactaacaacaataatgataaataagtaaatgctcaatgtgcataaaattgatctaagaagtacttgtaaactcatgtaatgttgtaaacttatttgcttatttctttatgtttcttttctcacatccgaacagattccttctagaggacatgattgtaagttaaaaaataaaatagaacactaattaaatcaaagctatcgctacttgctgagttacaaaattattaaatctatttataaaatactaccaattatgtcgtacttccaaattatcaaacaattgaatagattacaaaataatatttaatcaatagattacaaaatacctactacaaattcacaaaacaatttgtctagtttagtaattattcaaactatagttgtacatagtaattaatttggctttggtttagaccctcggccttggtgaacgacgaacaacgaggtatcctatgtgtagtcatgtatgatgcgtctaggatgtagatgcagtggccagtggcaatcctcagtcttcacgaatcaggatgaacatatggagggtggggcctcgcggaatagggggactagggta(SEQIDNO.8767)0對(duì)于SPX基因，搜索TIGR轉(zhuǎn)錄物數(shù)據(jù)庫中的SPX:MFS結(jié)構(gòu)域編碼序列。這些基因的鑒定可支持高等植物中存在保守調(diào)節(jié)途徑。通過搜索起始密碼子上游5’非翻譯區(qū)中與miRM0N18互補(bǔ)的保守序列，發(fā)現(xiàn)推定的miRM0N18靶位點(diǎn)。在葡萄(Vitisvinifera)中鑒定出推定的mirM0N18靶(TA40434_29760)，其序列為SEQIDNO.8768，其中miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)位于SEQIDNO.8768的核苷酸323-343。同樣，在萵苣(Lactucasativa)中鑒定出miRM0N18靶標(biāo)(TA5852_4236)，其序列為SEQIDNO.8769，其中miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)位于SEQIDNO.8769的核苷酸64-84。在玉米、水稻和大豆等各種不同物種中鑒定出含有直向SPX-結(jié)構(gòu)域的基因，包括NLA樣基因。當(dāng)序列可用時(shí)，在5’UTR中鑒定出推定的miRM0N18或miR827靶序列(識(shí)別位點(diǎn))。圖12描繪了為已鑒定SPX基因而構(gòu)建的系統(tǒng)樹，通過ClustalW比對(duì)氨基酸序列，用10000次迭代測(cè)定自引(bootstrap)值；通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)的含有預(yù)測(cè)miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)(在來自并非擬南芥的物種的基因中)或預(yù)測(cè)miR827識(shí)別位點(diǎn)(在來自擬南芥的基因中)的基因用黑體表示。除了含有SPX結(jié)構(gòu)域和RING結(jié)構(gòu)域的擬南芥NLA基因AtNLA(MRT3702_101115C，Atlg02860,SEQIDNO.8770，其包含在核苷酸135-155的miR827識(shí)別位點(diǎn)并編碼序列為SEQIDN0.8771的蛋白質(zhì))之外，系統(tǒng)樹中的基因還有玉米NLA樣基因ZmNLA(SEQIDN0.8772，編碼序列為SEQIDN0.8773的蛋白質(zhì))、大豆NLA樣基因GmNLA(SEQIDN0.8774，編碼序列為SEQIDN0.8775的蛋白質(zhì))、水稻NLA樣基因0sNLA(SEQIDNO.8776，編碼序列為SEQIDN0.8777的蛋白質(zhì))；擬南芥序列Atlg63010(SEQIDNO.8778，其包含核苷酸153-173的miR827識(shí)別位點(diǎn)并編碼序列為SEQIDN0.8779的蛋白質(zhì))、AT2g26660(SEQIDNO.8780，編碼序列為SEQIDN0.8781的蛋白質(zhì))和AT5g20150(SEQIDNO.8782，編碼序列為SEQIDN0.8783的蛋白質(zhì))；水稻序列0s02g45520(SEQIDNO.8784，其包含核苷酸395-415的miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)，并編碼序列為SEQIDN0.8785的蛋白質(zhì))和0s04g48390(SEQIDNO.8786，其包含核苷酸334-354的miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)，并編碼序列為SEQIDN0.8787的蛋白質(zhì))；和玉米序列MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788，其包含核苷酸1660-1680的miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)，并編碼序列為SEQIDN0.8789的蛋白質(zhì))、MRT4577_51705C(SEQIDNO.8790，編碼序列為SEQIDN0.8791的蛋白質(zhì))、MRT4577_375264C(SEQIDNO.8792，編碼序列為SEQIDN0.8793的蛋白質(zhì))、MRT4577_46983C(SEQIDNO.8794，編碼序列為SEQIDN0.8795的蛋白質(zhì))、MRT4577_340665C(SEQIDNO.8796，編碼序列為SEQIDN0.8797的蛋白質(zhì))和MRT4577_319995C(SEQIDNO.8798，編碼序列為SEQIDN0.8799的蛋白質(zhì))。幾千堿基對(duì)的序列是玉米和水稻NLA樣編碼序列的可用上游，其中從初步測(cè)序工作中未鑒定出miRM0N18靶位點(diǎn)。根據(jù)表達(dá)概況分析數(shù)據(jù)，看來ZmNLA(SEQIDN0.8772)RNA水平對(duì)氮利用率不應(yīng)答。相比之下，圖12所示的SPX-MFS結(jié)構(gòu)域進(jìn)化枝(SEQIDN0.8788、SEQIDNO.8786、SEQIDNO.8784和SEQIDNO.8778)在充足氮條件下、在玉米和擬南芥中受到抑制，并且預(yù)測(cè)會(huì)受到miRMONIS的調(diào)節(jié)；該進(jìn)化枝中的序列含有經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的miRM0N18(或miR827)識(shí)別位點(diǎn)。樹的頂端所顯示的SPX進(jìn)化枝(SEQIDN0.8798、SEQIDNO.8796、SEQIDNO.8794、SEQIDNO.8782、SEQIDNO.8780、SEQIDNO.8792和SEQIDNO.8790)(圖12)僅含有可識(shí)別的SPX結(jié)構(gòu)域，被有限氮抑制，并且也可預(yù)測(cè)會(huì)受到miRM0N18的調(diào)節(jié)。在玉米中，對(duì)應(yīng)于進(jìn)化枝1的基因(SEQIDN0.8798、SEQIDNO.8796、SEQIDNO.8794,SEQIDNO.8792和SEQIDNO.8780)的TxP數(shù)據(jù)與miRM0N18前體表達(dá)相關(guān)；miRMONIS前體的表達(dá)和進(jìn)化枝1基因的表達(dá)都在氮充足條件下被上調(diào)。SPX-MFS進(jìn)化枝2中的基因(SEQIDN0.8788,SEQIDNO.8786、SEQIDNO.8784和SEQIDNO.8778)受到miRM0N18的直接抑制，而進(jìn)化枝1基因缺乏直接靶標(biāo)，表明miRM0N18可通過抑制進(jìn)化枝2基因而間接調(diào)節(jié)進(jìn)化枝1基因表達(dá)。實(shí)施例8本實(shí)施例描述具有特定表達(dá)圖式的作物miRNA(miRM0N18)啟動(dòng)子的鑒定，所述表達(dá)圖式的特征為在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制。玉米miRM0N18基因的進(jìn)一步表征涉及miRM0N18前體(SEQIDNO.3936)與cDNA文庫和微陣列元件的BLAST匹配，和來自玉米(Zeamaysvar.LH244)的miRM0N18基因組序列(SEQIDN0.8800)的反向PCR克隆，使用基于來自克隆LIB5025-018-A1-XP1-B6的cDNA序歹Ij(SEQIDNO.8801)的反向PCR引物。該miRM0N18基因組序列(SEQIDNO.8800)具有圖13所示的注釋序列，其中以大寫字母給出SEQIDNO.8800的核苷酸2173-2788的miRM0N18轉(zhuǎn)錄物。該基因組序列也包含以小寫字母表示的SEQIDNO.8800的核苷酸211-2172的miRM0N18啟動(dòng)子元件、以小寫字母表示的SEQIDN0.8800的核苷酸2173-2308的前導(dǎo)元件、以下劃線加上小寫字母表示的SEQIDN0.8800的核苷酸2144-2147的規(guī)范TATA盒(末端是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的25個(gè)核苷酸)、以下劃線加上大寫字母表示的SEQIDN0.8800的核苷酸2419-2439的成熟miRM0N18、以及以下劃線加上大寫字母表示的SEQIDN0.8800的核苷酸2322-2341的miRM0N18*。為了證實(shí)miRM0N18啟動(dòng)子的表達(dá)圖式，在二元載體中構(gòu)建了2個(gè)重組DNA構(gòu)建體(SEQIDN0.8802和SEQIDN0.8803)，其包含驅(qū)動(dòng)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptll)作為選擇標(biāo)記的水稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子。質(zhì)粒PM0N111971中的構(gòu)建體(SEQIDN0.8802)依次包含miRM0N18啟動(dòng)子(SEQIDN0.8804)和驅(qū)動(dòng)GUS基因(SEQIDN0.8806)表達(dá)的miRM0N18前導(dǎo)序列(SEQIDN0.8805)、和NOS終止序列(SEQIDN0.8807)。質(zhì)粒pM0N111967中的構(gòu)建體(SEQIDN0.8803)含有DnaK內(nèi)含子(SEQIDN0.8808)并且還依次包含miRM0N18啟動(dòng)子(SEQIDN0.8804)、miRM0N18前導(dǎo)序列(SEQIDN0.8805)、GUS基因(SEQIDNO.8806)和NOS終止序列(SEQIDNO.8807)。用標(biāo)題“制備和使用非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和非天然轉(zhuǎn)基因植物”下所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和抗生素選擇，將載體轉(zhuǎn)化到玉米中。在氮充足和磷充足條件下，在轉(zhuǎn)化玉米葉中觀察到強(qiáng)miRM0N18-啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS的表達(dá)。在缺氮或缺磷條件下在轉(zhuǎn)化玉米葉中⑶S表達(dá)被抑制。用于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)基因以天然miRMONIS基因的表達(dá)圖式而表達(dá)的(即在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制)替代miRM0N18啟動(dòng)子序列包含具有SEQIDN0.8800的核苷酸211-2172的序列的啟動(dòng)子；與SEQIDN0.8800的核苷酸211-2172具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%同一性的至少約50、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400、或至少500個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，其中所述片段在至少一種植物組織中具有啟動(dòng)子活性，其特征是在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制；和與SEQIDN0.8804具有至少85%、至少90%、至少95%、或至少98%同一性的至少約50、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400、或至少500個(gè)連續(xù)核苷酸的片段，其中所述片段在至少一種植物組織中具有啟動(dòng)子活性，其特征是在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制。通過常規(guī)技術(shù)證實(shí)對(duì)替代啟動(dòng)子序列的鑒定，例如證實(shí)TATA盒在啟動(dòng)子序列內(nèi)和證實(shí)在至少一種植物組織中的啟動(dòng)子活性(例如通過測(cè)定重組DNA構(gòu)建體包含啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因(例如GUS或螢光素酶)在瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)或在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物中的表達(dá))。實(shí)施例9本實(shí)施例描述作物miRNA(miRM0N18)識(shí)別位點(diǎn)的鑒定，其中表達(dá)圖式的特征為在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制，或者在磷充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制。也公開了miRNA、miRNA啟動(dòng)子和miRNA識(shí)別位點(diǎn)的使用方法。非限制性實(shí)例包括在缺氮或缺磷條件下提供產(chǎn)量提高的非天然轉(zhuǎn)基因作物的方法，即通過在轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)包含miRMONIS-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因的重組DNA構(gòu)建體，以及在缺氮或缺磷條件下提供產(chǎn)量提高的非天然轉(zhuǎn)基因作物的方法，即通過在轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)包含miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)的重組DNA構(gòu)建體包含miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)，所述位點(diǎn)已經(jīng)添加到正常miRM0N18_無應(yīng)答的基因的序列中。使用以下文獻(xiàn)所述的序列互補(bǔ)法則等本領(lǐng)域已知方法，可完成對(duì)識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)Zhang(2005)NucleicAcidsRes.，33:W701_704和Rhoades等(2002)Cell,110513-520。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)預(yù)測(cè)miRNA識(shí)別位點(diǎn)的一個(gè)非限制性方法是稱為RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA5，端快速擴(kuò)增(“5，RLM-RACE”)的技術(shù)，其鑒定miRNA切割模式；參見例如Kasschau等(2003)Dev.Cell,4:205_217和Llave等(2002)Science,297:2053_2056。該方法依賴于RNA銜接分子與切割位點(diǎn)5’端的連接并且依賴于RNA酶III酶(包括Agol)留下的5’磷酸。對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，與預(yù)測(cè)miRNA在相對(duì)于miRNA5’端而言的核苷酸10和11之間的切割位點(diǎn)比對(duì)的克隆的相對(duì)數(shù)量提供對(duì)miRNA活性的估計(jì)值。圖14描繪了對(duì)水稻序列0s02g45520(SEQIDNO.8784)和0s04g48390(SEQIDNO.8786)和玉米序列MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的miRM0N18的預(yù)測(cè)切割。5，RLM_RACE測(cè)定的結(jié)果用于證實(shí)在水稻序列0s02g45520(SEQIDN0.8784)和0s04g48390(SEQIDNO.8786)中的預(yù)測(cè)miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)(靶位點(diǎn))切割，其中對(duì)24個(gè)克隆中的3個(gè)和16個(gè)克隆中的13個(gè)分別測(cè)序，發(fā)現(xiàn)具有預(yù)測(cè)切割模式(在相對(duì)于miRMONIS5’端而言的核苷酸10和11)。5'-RACE實(shí)驗(yàn)也部分證實(shí)了玉米SPX_MFS2序列SEQIDN0.8767中的miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)(數(shù)據(jù)未顯不)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了預(yù)測(cè)miRNA識(shí)別位點(diǎn)的另一非限制性方法是檢查推定靶標(biāo)的表達(dá)水平，例如通過轉(zhuǎn)錄概況分析實(shí)驗(yàn)?？梢灶A(yù)測(cè)，當(dāng)不表達(dá)miRNA時(shí)，真正的miRNA靶標(biāo)的表達(dá)水平是高的，而當(dāng)表達(dá)miRNA時(shí)，miRNA靶標(biāo)的表達(dá)水平則是低的。因此，當(dāng)不表達(dá)miRM0N18時(shí)(即在缺氮或缺磷條件下)，miRM0N18靶標(biāo)預(yù)測(cè)具有較高表達(dá)，而當(dāng)表達(dá)miRM0N18時(shí)(即在氮磷充足條件下)，miRMONIS靶標(biāo)預(yù)測(cè)表達(dá)則較低。圖15B描繪了含有預(yù)測(cè)miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)的玉米序列MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的表達(dá)概況。MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)不受水利用率或溫度的影響(在水充足或干旱條件下、或者在低溫或常溫下，觀察到轉(zhuǎn)錄物水平?jīng)]有大的差異；數(shù)據(jù)未顯示)，但在缺氮條件下比在氮充足條件下表現(xiàn)出更高的表達(dá)水平，即表達(dá)圖式與miRM0N18的相反，如圖15A所示(另見圖9和圖10)，表明MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的確受到miRM0N18的調(diào)節(jié)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，miRM0N18調(diào)節(jié)含有保守SPX結(jié)構(gòu)域的基因。miRM0N18的表達(dá)在缺氮或缺磷時(shí)被抑制，允許在這樣的條件下表達(dá)內(nèi)源miRMONIS-調(diào)節(jié)的基因。對(duì)成熟miRM0N18miRNA或miRM0N18靶標(biāo)(至少在miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)包含的基因)表達(dá)的操作可用于改變植物對(duì)缺氮或缺磷的應(yīng)答。本發(fā)明一方面包括在缺氮或缺磷條件下提供產(chǎn)量提高的非天然轉(zhuǎn)基因作物的方法，即通過在轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)miRMONIS-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因。一個(gè)實(shí)施方案是在非天然轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)包含合成miRMONIS-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列的重組DNA構(gòu)建體，其中合成miRM0N18-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列是(a)由天然miRM0N18_應(yīng)答序列獲得，即通過缺失或修飾天然miRM0N18-應(yīng)答序列內(nèi)的所有天然miRM0N18miRNA識(shí)別位點(diǎn)(也就是說，消除或改變天然miRMONIS-應(yīng)答序列的核苷酸)，所述識(shí)別位點(diǎn)被具有SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742序列的成熟miRM0N18miRNA識(shí)別，或被從選自SEQIDNO.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRM0N18miRNA識(shí)別，和(b)不被成熟miRM0N18miRNA識(shí)別。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，在圖12所示的任何含保守SPX-結(jié)構(gòu)域的基因中的miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)都缺失或修飾，使得修飾SPX基因不被內(nèi)源成熟miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)識(shí)別和結(jié)合，而且因此從miRMONIS的調(diào)節(jié)中解脫出來并因此也從缺氮或缺磷的影響中解脫出來。在一個(gè)非限制性具體實(shí)例中，玉米基因MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)可從miRM0N18調(diào)節(jié)中解脫出來并因此通過表達(dá)修飾MRT4577_36529C基因而從缺氮或缺磷的影響中解脫出來，其中miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)在其5，非翻譯區(qū)(SEQIDN0.8788的核苷酸1660-1680)已經(jīng)缺失或修飾，使得修飾MRT4577_36529C基因不被成熟miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)識(shí)別和結(jié)合。修飾miRM0N18_無應(yīng)答的MRT4577_36529C用組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子在玉米中表達(dá)，在氮充足和磷充足條件下提高營(yíng)養(yǎng)攝取和利用并導(dǎo)致在正常條件下、優(yōu)選在缺氮或缺磷條件下使產(chǎn)量提高?；蛘撸琺iRM0N18識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)工程改造成為正常miRM0N18_無應(yīng)答-基因，其在氮充足條件下被抑制，而在缺氮條件時(shí)表達(dá)；這是一個(gè)有用的方法，例如用氮轉(zhuǎn)運(yùn)基因，其在氮或磷限制條件下具有增加的表現(xiàn)或產(chǎn)量，而在非限制條件下表達(dá)時(shí)則沒有益處。實(shí)施例10可用于根據(jù)對(duì)miRMONIS或SPX基因表達(dá)的操作而提高氮或磷利用的方法和重組DNA構(gòu)建體的額外非限制性實(shí)例如下所述。(A)在限制條件下調(diào)節(jié)SPX基因表達(dá)以提高氮利用。在該實(shí)施方案中，經(jīng)工程改造而在5’UTR缺乏miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)(或在擬南芥中為miR827識(shí)別位點(diǎn))的含有SPX-結(jié)構(gòu)域的基因在植物中表達(dá)。將SPX基因從內(nèi)源miRM0N18(或在擬南芥中為miR827)調(diào)節(jié)中解脫出來，提供在氮或磷充足條件下對(duì)營(yíng)養(yǎng)利用率的適應(yīng)性，并導(dǎo)致產(chǎn)量提高。SPX-MFS進(jìn)化枝(SEQIDN0.8788、SEQIDNO.8786、SEQIDNO.8784和SEQIDNO.8778)(圖12)表達(dá)提高的一個(gè)想要的結(jié)果就是，在氮或磷充足條件期間，通過在庫(sink)組織中增加營(yíng)養(yǎng)利用率，在至少一種植物組織(例如葉、莖稈、根或種子)中提高蛋白質(zhì)含量。在擬南芥中評(píng)價(jià)了幾種載體(參見表7)，以模擬SPX基因的功能。在植物中上調(diào)AtNLA(Atlg02860，其含有SPX-RING結(jié)構(gòu)域，SEQIDN0.8745)的預(yù)測(cè)表型對(duì)低氮或低磷條件而言是組成型適應(yīng)性的并提高植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的總體運(yùn)輸和利用；在SPX-RING進(jìn)化枝(SEQIDN0.8772、SEQIDNO.8770、SEQIDNO.8774和SEQIDN0.8776)中有關(guān)基因的上調(diào)預(yù)測(cè)也具有類似表型(圖12)。載體編號(hào)1至5是嵌合轉(zhuǎn)錄物，其包含非靶向5，非翻譯區(qū)和3，非翻譯區(qū)和AtNLA編碼區(qū)(SEQIDN0.8745)；載體編號(hào)6包含基因組AtNLA(SEQIDN0.8745)片段，其包含自內(nèi)源AtNLA啟動(dòng)子至終止序列的序列(以防止異位表達(dá))，但其中天然miR827識(shí)別位點(diǎn)已缺失或修飾，以防止被成熟miR827識(shí)別。上調(diào)SPX-MFS進(jìn)化枝基因(SEQIDN0.8788、SEQIDN0.8786、SEQIDΝ0·8784和SEQIDNO.8778)(圖12)的預(yù)測(cè)表型是增加營(yíng)養(yǎng)(尤其是氮和/或磷)運(yùn)輸，尤其是從來源到庫(sink)組織，導(dǎo)致產(chǎn)量增加。載體編號(hào)7、9和10是嵌合轉(zhuǎn)錄物，其包含非靶向5’非翻譯區(qū)和3，非翻譯區(qū)和Atlg63010編碼區(qū)(SEQIDNO.8778)；載體編號(hào)8包含基因組Atlg63010(SEQIDNO.8778)片段，其包含自內(nèi)源Atlg63010啟動(dòng)子至終止序列的序列(以防止異位表達(dá))，但其中天然miR827識(shí)別位點(diǎn)已缺失或修飾，以防止被成熟miR827識(shí)別；載體編號(hào)11是嵌合轉(zhuǎn)錄物，其包含非靶向5’非翻譯區(qū)和3’非翻譯區(qū)和0s04g48390編碼區(qū)(SEQIDNO.8786)；載體編號(hào)12包含基因組0s04g48390(SEQIDNO.8786)片段，其包含自內(nèi)源0s04g48390啟動(dòng)子至終止序列的序列(以防止異位表達(dá))，但其中天然miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)已缺失或修飾，以防止被成熟miRMONIS(或在擬南芥中為成熟miR827)識(shí)別。通過MRT4577_319995C(SEQIDNO.8798)的表達(dá)，用載體13-15(表7)，評(píng)價(jià)了未分類功能、但預(yù)測(cè)被低氮利用率阻遏的SPX進(jìn)化枝基因的上調(diào)效應(yīng)。類似表達(dá)實(shí)驗(yàn)在玉米中進(jìn)行。構(gòu)建包含具有保守SPX結(jié)構(gòu)域的基因(參見圖12)的載體(表7)并轉(zhuǎn)化玉米。載體變異體包括含SPX基因的基因組序列的載體和含SPX基因克隆的、受天然啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的cDNA的載體。在非限制性實(shí)例中，載體16-18使用來自MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的編碼序列，并具有破壞的miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)，允許在僅可表達(dá)天然啟動(dòng)子的充足氮條件下表達(dá)轉(zhuǎn)基因。也會(huì)制備僅表達(dá)來自MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)的MFS結(jié)構(gòu)域的第三構(gòu)建體(其代表缺乏SPX的天然替代剪接同種型)并在玉米中測(cè)試氮的同化。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage119</column></row><table>*35S，花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子；FDA，果糖二磷酸醛縮酶啟動(dòng)子(維管束鞘(bundlesheath)啟動(dòng)子)；PPDK，丙酮酸正磷酸二激酶啟動(dòng)子(葉肉細(xì)胞啟動(dòng)子)；RCc3，水稻RCc3基因啟動(dòng)子(根特異性啟動(dòng)子)(B)在充足氮條件下使用MIRM0N18啟動(dòng)子的基因表汰。在該實(shí)施方案中，miRMONIS啟動(dòng)子用于消除在限制氮條件下表達(dá)轉(zhuǎn)基因所得到的不想要的表型(非正常型(off-types))。例如，當(dāng)?shù)幌拗茣r(shí)，天冬酰胺合成酶的表達(dá)產(chǎn)生想要的高蛋白表型。在限制氮條件下，過量表達(dá)天冬酰胺合成酶引起產(chǎn)量減少。由MIRMONIS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的天冬酰胺合成酶的表達(dá)在充足氮利用率下得到高蛋白表型，但在限制氮條件下，轉(zhuǎn)基因被關(guān)掉以防止產(chǎn)量懲罰(penalty)。構(gòu)建含以下部分的載體玉米miRM0N18啟動(dòng)子(SEQIDNO.8804)、玉米miRM0N18前導(dǎo)序列(SEQIDNO.8805)和與天冬酰胺合成酶基因融合的miRM0N18折回結(jié)構(gòu)。天冬酰胺合成酶基因的非限制性實(shí)例包括大豆(Glycinemax)天冬酰胺合成酶(SEQIDNO.8809)、Galdieriasulphuraria天冬酰胺合成酶(SEQIDNO.8810)和玉米(Zeamays)天冬酰胺合成酶(SEQIDNO.8811)。用這些載體轉(zhuǎn)化玉米，然后在限制氮和充足氮條件下，在所得轉(zhuǎn)基因玉米植物中評(píng)價(jià)產(chǎn)量和蛋白質(zhì)品質(zhì)。(C)在限制氮條件下使用miRM0N18識(shí)別位點(diǎn)序列的基因抑制。該實(shí)施方案的非限制性實(shí)例是包含轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元和外源miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)的重組DNA構(gòu)建體，其中重組DNA構(gòu)建體在植物中表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，當(dāng)不表達(dá)成熟miRM0N18miRNA時(shí)。高等植物中含有SPX-結(jié)構(gòu)域的基因的5，UTR賦予在充足氮條件下通過內(nèi)源成熟miRM0N18或miR827的調(diào)節(jié)而抑制mRNA。在本發(fā)明的一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，由miRM0N18或miR827調(diào)節(jié)SPX基因的5，UTR，例如但不限于AtNLA(SEQIDNO.8770)、Atlg63010(SEQIDNO.8778)、0s02g45520(SEQIDNO.8784)、0s04g48390(SEQIDNO.8786)和MRT4577_36529C(SEQIDNO.8788)，都摻入到轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒的前導(dǎo)序列中。這導(dǎo)致在充足氮條件下對(duì)轉(zhuǎn)基因的抑制，無論所用的啟動(dòng)子序列如何，以消除與未調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)相關(guān)的非正常型(off-types)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將miRM0N18或miR827識(shí)別位點(diǎn)的切割位點(diǎn)上存在的保守4個(gè)核苷酸的序列AUG(G/U)變?yōu)镚UGG，以防止不想要的起始，同時(shí)保留對(duì)成熟miRNA的堿基配對(duì)?；蛘?，將合成miRM0N18或miR827識(shí)別位點(diǎn)摻入到非翻譯區(qū)中或編碼區(qū)內(nèi)，而不改變蛋白質(zhì)功能，從而在充足氮條件下賦予抑制。在另一實(shí)例中，將0s04g48390(SEQIDNO.8786)的5，UTR與由組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS融合；構(gòu)建含有內(nèi)源水稻序列的一種形式(其中存在于miRMONIS切割位點(diǎn)上的AUG已修飾為GUG)和另一形式(其中在miRM0N18切割位點(diǎn)上的AUG已修飾為GUG)。也評(píng)價(jià)了將串聯(lián)(2個(gè)或更多)合成miRMONIS識(shí)別位點(diǎn)引入到3’UTR的第三構(gòu)建體。在不同營(yíng)養(yǎng)(氮或磷)條件下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化玉米植物和不同組織中評(píng)價(jià)這些載體的GUS表達(dá)。(D)MIRM0N18異位表汰限制SPX基因表汰。在該實(shí)施方案中，miRM0m8(或在擬南芥中為miR827)表達(dá)是由組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，導(dǎo)致對(duì)所有miRM0N18-調(diào)節(jié)的(或miR827調(diào)節(jié)的)基因(例如保守SPX基因)的抑制。一個(gè)非限制性實(shí)例包含載體PM0N107261(圖16)，其包含CaMV35S啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)玉米miRM0N18轉(zhuǎn)錄物(例如SEQIDNO.8800的核苷酸2173-2788)的表達(dá)。評(píng)價(jià)用該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米和擬南芥植物的表型，并選擇在氮或磷限制條件下表現(xiàn)出改良性狀(例如產(chǎn)量增加)的植物。實(shí)施例11本實(shí)施例描述重組DNA構(gòu)建體，其可轉(zhuǎn)錄為包含至少一個(gè)miRNA誘騙序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，所述miRNA誘騙序列被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合，但不切割。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，內(nèi)源成熟miRNA是對(duì)營(yíng)養(yǎng)脅迫應(yīng)答的miRNA-例如成熟miRNA，其表達(dá)可受到營(yíng)養(yǎng)缺乏條件的上調(diào)或下調(diào)，相對(duì)于營(yíng)養(yǎng)充足條件下的表達(dá)而言。更具體地講，本實(shí)施例描述對(duì)營(yíng)養(yǎng)脅迫應(yīng)答的成熟miRNA(miR827,miRM0N18和miR399)的miRNA誘騙序列。實(shí)施例6-10描述表現(xiàn)出以下表達(dá)圖式的2種miRNA即miR827(SEQIDNO.8744)和miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)，其表達(dá)圖式的特征為營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)miRNA的調(diào)節(jié)(例如在缺氮、缺磷或氮磷同時(shí)缺乏條件下抑制miRNA)。另一miRNA即在擬南芥中鑒定的miR399具有序列UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG(SEQIDNO.8812)；通過小RNA測(cè)序，在玉米(SEQIDNO.8813)水稻(SEQIDNO.8814)和大豆(SEQIDNO.8815)中鑒定出相同miRNA。發(fā)現(xiàn)玉米miR399基因可應(yīng)答氮利用率。從專有cDNA數(shù)據(jù)組中鑒定出玉米miR399前體，其包含具有序列SEQIDNO.8816的Zm_miR399cDNA序列(MRT4577_22484C.8)，其在SEQIDNO.8816的核苷酸71-175含有Zm_miR399前體(SEQIDNO.8817)；并包含具有序列SEQIDNO.8818的另一Zm_miR399cDNA序列(MRT4577_22487C.6)，其在SEQIDNO.8818的核苷酸136-330含有Zm_miR399前體(SEQIDN0.8819)。玉米miR399前體的折回結(jié)構(gòu)見圖17A；圖17B描繪了用對(duì)應(yīng)于MRT4577_22487C.6(SEQIDNO.8818)的探針AlZM033468_at的轉(zhuǎn)錄概況分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這些結(jié)果表明Zm-miR399pri-miRNA(SEQIDNO.8817)在缺氮條件下被抑制(黑色條柱)，而在氮充足條件下表達(dá)(白色條柱)。在擬南芥中，已經(jīng)報(bào)道m(xù)iR399能應(yīng)答無機(jī)磷利用率并抑制基因進(jìn)化枝，這些基因包含擬南芥PH02基因(At2g33770，編碼E2結(jié)合酶(conjugase))和來自各種植物的推定PH02直向同源物。無機(jī)磷剝奪可誘導(dǎo)miR399的表達(dá)；miR399在磷充分供應(yīng)條件下過量表達(dá)可阻遏PH02的表達(dá)并導(dǎo)致葉中的高磷濃度。參見Fujii等(2005)Curr.Biol.，152038-2043；Chiou等(2006)PlantCell,18412~421；Aung等(2006)PlantPhysiol..1411000-1011；和Bari等(2006)PlantPhysiol.，141:988_999。在擬南芥IPS1轉(zhuǎn)錄物和基因的Mt4_TPSI家族的其它成員中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)保守的23個(gè)核苷酸的基序據(jù)報(bào)道對(duì)miR399具有序列互補(bǔ)性，除了對(duì)應(yīng)于成熟miR399的位置10和11的錯(cuò)配環(huán)之外，這可阻止miR399:IPS1雙鏈體的切割；參見Franco-Zorrilla等(2007)NatureGenetics,39:1033_1037。也含有對(duì)應(yīng)于成熟miRNA位置10和11的錯(cuò)配的一個(gè)類似的非切割序列據(jù)報(bào)道用于miR390；參見Axtell等(2006)Cell,127:565_577。開發(fā)了用于預(yù)測(cè)內(nèi)源“微RNA誘騙序列”的法則，該序列可被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合，導(dǎo)致miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間的堿基配對(duì)，因而形成因miRNA誘騙序列與成熟miRNA間存在錯(cuò)配而不被切割的抗切割RNA雙鏈體。一般而言，這些法則定義(1)所需錯(cuò)配，和(2)允許但并非必需的錯(cuò)配。錯(cuò)配包括規(guī)范錯(cuò)配(例如G-A、C-U、C-A)以及G::U擺動(dòng)配對(duì)和得失位(indels)(核苷酸插入或缺失)。所需錯(cuò)配包括(a)miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間在內(nèi)源成熟miRNA位置9、10或11上的至少1個(gè)錯(cuò)配，或者，(b)在對(duì)應(yīng)于內(nèi)源成熟miRNA的位置9、10或11的miRNA誘騙序列的位置上的1、2、3、4或5個(gè)插入(即額外核苷酸)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在(a)miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間在內(nèi)源成熟miRNA的位置10和/或11上的至少1個(gè)錯(cuò)配，或(b)在對(duì)應(yīng)于內(nèi)源成熟miRNA的位置10和/或11的miRNA誘騙序列的位置上的至少1個(gè)插入。允許但并非必需的錯(cuò)配包括(a)miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間在內(nèi)源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個(gè)錯(cuò)配，和(b)miRNA誘騙序列與內(nèi)源成熟miRNA之間在內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位(即21個(gè)核苷酸的成熟miRNA的位置21)上的0、1、2或3個(gè)錯(cuò)配，其中在內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個(gè)錯(cuò)配都鄰近至少一個(gè)互補(bǔ)堿基對(duì)(即使得在內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上有不超過2個(gè)連續(xù)錯(cuò)配)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在內(nèi)源成熟miRNA的位置1、2、3、4、5、6、7和8上不存在錯(cuò)配(即所有都是互補(bǔ)堿基對(duì))。這些法則可用于從專有cDNA數(shù)據(jù)組中鑒定出大量含有內(nèi)源miRNA誘騙序列的玉米序列或大豆序列。表8提供針對(duì)miRM0N18(SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742)的玉米(Zeamays)內(nèi)源miRNA誘騙序列；miRNA誘騙序列中的錯(cuò)配在miRNA與miRNA誘騙序列之間的比對(duì)中用下劃線表示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>表9提供針對(duì)miR399(SEQIDNO.8812、SEQIDNO.8813、SEQIDNO.8814或SEQIDNO.8815)的玉米(Zeamays)內(nèi)源miRNA誘騙序列；miRNA誘騙序列中的錯(cuò)配在miRNA與miRNA誘騙序列之間的比對(duì)中用下劃線表示。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>在2個(gè)cDNA序列(SEQIDNO.8831和SEQIDNO.8833)的負(fù)鏈中鑒定出微RNAmiR399誘騙序列。表9提供的cDNA序列的6框翻譯分析沒有顯示任何長(zhǎng)可讀框，對(duì)這些相同序列進(jìn)行BLAST搜索，在公共數(shù)據(jù)庫中也沒有鑒定出任何蛋白質(zhì)，表明這些基因可能是非編碼序列。miR399誘騙序列的玉米cDNA序列的比對(duì)見圖18，其中共有序列為SEQIDNO.8834，并且顯示出至少兩組基因含有miR399誘騙序列第一組含有密切相關(guān)基因MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)、MRT4577_521786C.1(SEQIDNO.8831)和MRT4577_135578C.1(SEQIDNO.8833)，而第二組含有MRT4577_36567C.8(SEQIDNO.8829)。在含有miR399誘騙序列(SEQIDNO.8827、SEQIDNO.8831和SEQIDNO.8833)的第一組玉米基因的miRNA誘騙序列與擬南芥IPS1(AT3G09922.l)miR399“模擬”位點(diǎn)(由Franco-Zorrilla等報(bào)道，F(xiàn)ranco-Zorrilla等(2007)NatureGenetics，391033-1037)之間僅有1個(gè)核苷酸差異；SEQIDNO.8826、SEQIDNO.8830和SEQIDNO.8832的位置12上的保守G在擬南芥miR399“模擬”位點(diǎn)中被C取代。然而，玉米基因(SEQIDNO.8827、SEQIDNO.8831和SEQIDNO.8833)與擬南芥IPS1(AT3G09922.1)基因之間的同源性局限于miRNA誘騙序列位點(diǎn)。表10提供針對(duì)miR399(SEQIDNO.8812、SEQIDNO.8813、SEQIDNO.8814或SEQIDNO.8815)的大豆(Glycinemax)內(nèi)源miRNA誘騙序列；miRNA誘騙序列中的錯(cuò)配在miRNA與miRNA誘騙序列之間的比對(duì)中用下劃線表示。轉(zhuǎn)錄概況分析數(shù)據(jù)用于比較內(nèi)源miRNA誘騙cDNA序列和相應(yīng)miRNA前體的表達(dá)；探針組包括AlGM035741_at(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.8836)、AlGM069937_at(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.8838)、AlGM074873_at(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.8840)、AlGM031412_at(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.8842)和AlGM053788_at(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO.8844)。表10SEQIDNO.miR399誘騙序列玉米cDNA名稱和SEQIDN0.(編碼miRNA誘騙序列在cDNA中的核苷酸位置)以3'至5'方向(上方)表示的miR399與以5，至3，方向(下方)表示的miRNA誘騙序列之間的比對(duì)8835UAGGGCAACUUCGAUCCUUUGGCAMRT3847—238967C.1(SEQIDN0.8836)(390-413)GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUuagggcaacuucgauccuuuggca8837UAGGGCAACUUCUAUCCUUUGGCAMRT3847—241832C.1(SEQIDNO.8838)(393-416)GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUuagggcaacuucuaucCuuuggca8839AAGGGCAACUUCAAUCCUUUGGCAMRT3847—336885C.1(SEQIDNO.8840)(96-119)GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUaagggcaacuucaauccuuuggca8841AAGGGCAACUUCCAUCCUUUGGCAMRT3847—217257C.2(SEQIDNO.8842)(179-202)GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUaagggcaacuuccauccuuuggca8843AAGGGCAACUUCCAUCCUUUGGCAMRT3847—236871C.3(SEQIDNO.8844)(238-261)GUCCCGUUAAG---AGGAAACCGUaagggcaacuuccauccuuuggca轉(zhuǎn)錄概況分析實(shí)驗(yàn)用于比較玉米內(nèi)源miR399誘騙cDNA序列和相應(yīng)的玉米miR399前體在不同氮條件下的表達(dá)。組lmiR399誘騙基因MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)在缺氮條件下在玉米葉中表現(xiàn)出約2倍下調(diào)(圖19A)；組2miR399誘騙基123因MRT4577_36567C.8(SEQIDNO.8829)在缺氮條件下在玉米葉中表現(xiàn)出至少IO倍以上的更明顯下調(diào)(圖19B)。通過RNA印跡對(duì)成熟miR399(圖19C)和miR399誘騙序列MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)(圖19D)的表達(dá)測(cè)定，證實(shí)這些結(jié)果。用來自低氮(2毫摩爾)或高氮(20毫摩爾)下生長(zhǎng)的玉米V6葉的5微克總RNA/泳道，進(jìn)行RNA印跡，同樣檢測(cè)成熟21個(gè)核苷酸的miR399(圖19C)和miR399誘騙序列MRT4577_47862C.7(SEQIDNO.8827)(圖19D，主要條帶在約600bp)的印跡。玉米miR399誘騙序列在氮充足條件下更高表達(dá)水平反映出玉米miR399前體在氮充足條件下更高表達(dá)水平(圖17B)。類似轉(zhuǎn)錄概況分析實(shí)驗(yàn)用于比較玉米內(nèi)源miR399誘騙cDNA序列和相應(yīng)的玉米miR399前體在不同溫度條件下的表達(dá).組2miR399誘騙基因MRT4577_36567C.8(SEQIDNO.8829)在氮充足條件下在玉米葉中表現(xiàn)出至少10倍以上的高表達(dá)，尤其是在白天時(shí)間里(圖20A)。這同樣的基因當(dāng)長(zhǎng)期低溫后在根(圖20B)和芽(圖20C)中表現(xiàn)出至少2倍的下調(diào)。也將內(nèi)源miR399誘騙cDNA序列在玉米和大豆的不同組織中的表達(dá)進(jìn)行比較。圖21A描繪了以下序列的表達(dá)水平組1玉米miR399誘騙序列SEQIDNO.8827(MRT4577_47862C,代表為探針AlZM005814_at和AlZM005813_s_at)和組2玉米miR399誘騙序列SEQIDN0.8829(MRT4577_36567C，代表為探針AlZM048024_at)、以及玉米pri-miR399序列SEQIDN0.8818(MRT4577_22487C.6，代表為探針AlZM033468_at)。圖21B描繪了以下序列的表達(dá)水平大豆miR399誘騙序列SEQIDN0.8842(MRT3847_217257C.2,代表為探針AlGM031412_at)、SEQIDNO.8844(MRT3847_236871C.2,代表為探針AlGM053788_at)、SEQIDN0.8836(MRT3847_238967C.1，代表為探針AlGM035741_at)和SEQIDNO.8838(MRT3847_241832C.1，代表為探針AlGM069937_at)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)在包括玉米和大豆在內(nèi)的作物中的新的氮-應(yīng)答表達(dá)圖式，用于成熟miR399(和miR399前體)以及內(nèi)源miR399誘騙序列。miR399的各種用途包括過量表達(dá)成熟miR399(例如通過過量表達(dá)pri-miR399序列)，表達(dá)設(shè)計(jì)用于抑制并非天然成熟miR399所天然靶向基因的基因的工程miR399，表達(dá)處于miR399啟動(dòng)子控制之下的轉(zhuǎn)基因(編碼序列或非編碼序列或這兩者)，表達(dá)添加或除去miR399識(shí)別位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因，過量表達(dá)miR399誘騙序列，以及抑制內(nèi)源miR399誘騙序列。表11提供針對(duì)miR319,UUGGACUGAAAGGAGCUCCU(SEQIDNO.8845)的大豆(Glycinemax)和玉米(Zeamays)內(nèi)源miRNA誘騙序列，所述miR319已在大量植物物種(包括擬南芥、水稻、玉米和大豆)中鑒定出來(參見公眾可得的miRBase中的實(shí)例，microrna.Sanger,ac.uk/cgi-bin/sequences/query,pi？terms=miR319)；miRNA誘騙序歹[J中白勺錯(cuò)配在miRNA與miRNA誘騙序列的比對(duì)中用下劃線表示。圖22A描述了在不同大豆組織中大豆內(nèi)源miR319誘騙SEQIDN0.8847(MRT3847_41831C.6，代表為探針A1GM001017_at)的轉(zhuǎn)錄概況分析數(shù)據(jù)；圖22B描述了不同玉米組織中玉米內(nèi)源miR319誘騙SEQIDN0.8849(MRT4577_577703C.1，代表為探針AlZM012886_s_at)的轉(zhuǎn)錄概況分析數(shù)據(jù)。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>由miR319調(diào)節(jié)的靶基因是參與葉發(fā)育的TCP基因和參與花發(fā)育的MYB基因。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過抑制內(nèi)源成熟miR319在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄來改變植物的葉或花結(jié)構(gòu)或發(fā)育模式，或通過miR319誘騙序列在轉(zhuǎn)基因植物中的過量表達(dá)而改變內(nèi)源miR319活性。在再一個(gè)實(shí)施例中，miR398b(SEQIDNO.8850)已經(jīng)顯示出調(diào)節(jié)CSDl和CSD2(銅/鋅過氧化物歧化酶)的表達(dá)；參見Sunkar等(2006)PlantCell，18:2051_2065。過氧化物歧化酶有助于通過將O2轉(zhuǎn)化為H2O2而凈化活性氧中間體(ROS)并能減少由過氧化物或過氧化物來源的ROS引起的潛在損傷。miR398被氧化脅迫輕微下調(diào)并被Cu利用率強(qiáng)下調(diào)；參見Yamasaki等(2007)J.Biol.Chem.，28216369-16378。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括在氧化脅迫-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)包含miR398b誘騙序列(例如SEQIDN0.8851-8852)的嵌合轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致在脅迫條件下對(duì)miR398b活性的進(jìn)一步抑制并提高CSDl和CSD2的蓄積和脅迫保護(hù)作用。按照以上所公開的內(nèi)容所述，可制備和使用本文所公開和要求保護(hù)的所有材料與方法，而無需過多的實(shí)驗(yàn)。盡管根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案和說明性的實(shí)施例已經(jīng)描述了本發(fā)明的材料與方法，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍的條件下，可以對(duì)本文所述的材料與方法進(jìn)行修改。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有這些類似替換和修改都視為落入所附權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思之內(nèi)。權(quán)利要求一種重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含(a)合成miRMON18-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列，其中所述合成miRMON18-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列是(i)由天然miRMON18-應(yīng)答序列獲得，即通過缺失或修飾所述天然miRMON18-應(yīng)答序列內(nèi)的所有天然miRMON18miRNA識(shí)別位點(diǎn)，和(ii)不被具有序列SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742的成熟miRMON18miRNA識(shí)別；或(b)合成miRNA-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列，其中所述合成miRNA-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列是(i)由天然miRNA-應(yīng)答序列獲得，即通過缺失或修飾所述天然miRNA-應(yīng)答序列內(nèi)被至少一個(gè)選自以下的特定成熟miRNA識(shí)別的所有天然miRNA識(shí)別位點(diǎn)SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，和(ii)不被所述至少一個(gè)特定成熟miRNA識(shí)別；或(c)合成miR399-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列，其中所述合成miR399-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列是(i)由天然miR399-應(yīng)答序列獲得，即通過缺失或修飾所述天然miR399-應(yīng)答序列內(nèi)的所有天然miR399識(shí)別位點(diǎn)，和(ii)不被成熟miR399miRNA識(shí)別；或(d)合成miR319-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列，其中所述合成miR399-無應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因序列是(i)由天然miR319-應(yīng)答序列獲得，即通過缺失或修飾所述天然miR319-應(yīng)答序列內(nèi)的所有天然miR319miRNA識(shí)別位點(diǎn)，和(ii)不被成熟miR319miRNA識(shí)別。2.一種重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中所述至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件選自(a)(i)轉(zhuǎn)錄為具有選自以下植物miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體的DNA元件=SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中所述miRNA前體包含所述植物miRNA前體序列的至少90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段，而且所述重組DNA構(gòu)建體任選還包含并非所述miRNA前體序列天然啟動(dòng)子的啟動(dòng)子；或(ii)轉(zhuǎn)錄為具有選自以下植物miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體的DNA元件:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中所述miRNA前體包含所述植物前體miRNA序列的至少90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段，而且所述至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，而且所述重組DNA構(gòu)建體任選還包含并非所述miRNA前體序列天然啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在所述植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)所述至少一個(gè)靶基因的抑制；(b)(i)轉(zhuǎn)錄為具有miRM0N18前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體并加工為成熟miRM0N18miRNA的DNA元件，而且所述重組DNA構(gòu)建體任選還包含并非所述miRM0N18前體序列天然啟動(dòng)子的啟動(dòng)子；或(ii)轉(zhuǎn)錄為具有miRMONIS前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體并加工為成熟miRM0N18miRNA的DNA元件，而且所述至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，而且所述重組DNA構(gòu)建體任選還包含并非所述miRMONIS前體序列天然啟動(dòng)子的啟動(dòng)子，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在所述植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)所述至少一個(gè)靶基因的抑制；(c)⑴轉(zhuǎn)錄為從選自以下植物miRNA前體序列的植物miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)獲得的工程miRNA前體的DNA元件:SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中所述工程miRNA前體包含修飾的成熟miRNA；或(ii)轉(zhuǎn)錄為從選自以下植物miRNA前體序列折回結(jié)構(gòu)獲得的工程miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中所述工程miRNA前體包含修飾的成熟miRNA，其中所述至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因或者所述植物的有害動(dòng)物或病原體的內(nèi)源基因，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在所述植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)所述至少一個(gè)靶基因的抑制；(d)(i)轉(zhuǎn)錄為從miRMONIS前體序列折回結(jié)構(gòu)獲得的工程miRNA前體的DNA元件，其中所述工程miRNA前體包含修飾的成熟miRM0N18miRNA；或(ii)轉(zhuǎn)錄為從miRM0N18前體序列折回結(jié)構(gòu)獲得的工程miRNA前體的DNA元件，其中所述工程miRNA前體包含修飾的成熟miRMONISmiRNA，其中所述至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因或者所述植物的有害動(dòng)物或病原體的內(nèi)源基因，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在所述植物中的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)所述至少一個(gè)靶基因的抑制；(e)(i)位于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)或其附近并轉(zhuǎn)錄為包含miRNA識(shí)別位點(diǎn)的RNA的DNA元件，所述miRNA識(shí)別位點(diǎn)被選自以下的成熟miRNA識(shí)別SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或者被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識(shí)別SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408,SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819;或(ii)位于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)或其附近并轉(zhuǎn)錄為包含miRNA識(shí)別位點(diǎn)的RNA的DNA元件，所述miRNA識(shí)別位點(diǎn)被選自以下的成熟miRNA識(shí)別SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744,SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850，或者被從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA識(shí)別SEQIDNO.1036-2690,SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408,SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，并且所述至少一個(gè)靶基因包含由所述轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元編碼的轉(zhuǎn)基因，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)基因在并非天然表達(dá)所述成熟miRNA的所述植物的細(xì)胞中表達(dá)；(f)(i)位于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)或其附近并轉(zhuǎn)錄為包含miRNA識(shí)別位點(diǎn)的RNA的DNA元件，所述miRNA識(shí)別位點(diǎn)被成熟miRM0N18miRNA或從miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA識(shí)別；或(ii)位于轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)或其附近并轉(zhuǎn)錄為包含miRNA識(shí)別位點(diǎn)的RNA的DNA元件，所述miRNA識(shí)別位點(diǎn)被成熟miRM0N18miRNA或從miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA識(shí)別，并且所述至少一個(gè)靶基因包含由所述轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元編碼的轉(zhuǎn)基因，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)基因在并非天然表達(dá)所述成熟miRMONISmiRNA的所述植物的細(xì)胞中表達(dá)；(g)⑴用于抑制從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內(nèi)源miRNA表達(dá)的DNA元件=SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417,SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；或(ii)用于抑制從選自以下植物miRNA前體序列獲得的內(nèi)源miRNA表達(dá)的DNA元件SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819，其中所述至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，而且所述內(nèi)源基因的表達(dá)在發(fā)生所述內(nèi)源miRNA天然表達(dá)的所述植物細(xì)胞中受到抑制，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在所述細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致所述內(nèi)源基因在所述細(xì)胞中表達(dá)；和(h)(i)用于抑制從miRM0N18前體序列獲得的內(nèi)源成熟miRM0N18miRNA表達(dá)的DNA元件，所述至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，而且所述內(nèi)源基因的表達(dá)在發(fā)生所述內(nèi)源成熟miRM0N18miRNA天然表達(dá)的所述植物細(xì)胞中受到抑制，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在所述細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致所述內(nèi)源基因在所述細(xì)胞中表達(dá)；或(ii)用于抑制從miRMONIS前體序列獲得的內(nèi)源成熟miRM0N18miRNA表達(dá)的DNA元件，其中所述至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，而且所述內(nèi)源基因的表達(dá)在發(fā)生所述內(nèi)源成熟miRMONISmiRNA天然表達(dá)的所述植物細(xì)胞中受到抑制，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在所述細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致所述內(nèi)源基因在所述細(xì)胞中表達(dá)。3.一種包含啟動(dòng)子的重組DNA構(gòu)建體，所述啟動(dòng)子選自(a)表現(xiàn)出特征為受到非生物脅迫調(diào)節(jié)的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子；(b)表現(xiàn)出特征為受到營(yíng)養(yǎng)脅迫調(diào)節(jié)的表達(dá)圖式的miRNA啟動(dòng)子，其中所述營(yíng)養(yǎng)脅迫包括選自缺氮和缺磷的至少一種營(yíng)養(yǎng)缺乏；(c)在葉組織中表現(xiàn)出在氮充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺氮條件下抑制的玉米miRNA啟動(dòng)子；(d)在葉組織中表現(xiàn)出在磷充足條件下強(qiáng)表達(dá)、而在缺磷條件下抑制的玉米miRNA啟動(dòng)子；(e)具有序列SEQIDNO.8804的miRM0N18啟動(dòng)子；和(f)與SEQIDNO.8804區(qū)段具有至少85%同一性的至少約50個(gè)連續(xù)核苷酸的片段；其中所述啟動(dòng)子與基因抑制元件和基因表達(dá)元件中的至少一個(gè)操作性連接。4.權(quán)利要求4的重組DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子至少與天冬酰胺合成酶基因的編碼區(qū)操作性連接。5.一種重組DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄為包含至少一個(gè)miRNA誘騙序列的RNA轉(zhuǎn)錄物，所述誘騙序列被內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合、但不切割，其中所述內(nèi)源miRNA是選自以下的至少一種miRNA(a)選自以下成熟miRNA的成熟miRNA:SEQIDNO.1-1035、SEQIDNO.2730-3921、SEQIDNO.5498-6683、SEQIDNO.8409-8560、SEQIDNO8742、SEQIDNO.8744、SEQIDNO.8812-8815、SEQIDNO.8845和SEQIDNO.8850；或(b)從選自以下植物miRNA前體序列獲得的成熟miRNA=SEQIDNO.1036-2690、SEQIDNO.3922-5497、SEQIDNO.6684-8408、SEQIDNO.8561-8417、SEQIDNO.8743、SEQIDNO.8800和SEQIDNO.8816-8819；和所述miRNA誘騙序列包含約19個(gè)至約36個(gè)連續(xù)RNA核苷酸的RNA序列，其中所述miRNA誘騙序列被所述內(nèi)源成熟miRNA識(shí)別并結(jié)合，導(dǎo)致所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間的堿基配對(duì)，因而形成包含以下的抗切割RNA雙鏈體(a)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置9、10或11上的至少一個(gè)錯(cuò)配，或在所述miRNA誘騙序列對(duì)應(yīng)于所述內(nèi)源成熟miRNA位置10-11的位置上的至少一個(gè)插入，(b)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置1、2、3、4、5、6、7、8和9上的0、1或2個(gè)錯(cuò)配，和(c)所述miRNA誘騙序列與所述內(nèi)源成熟miRNA之間在所述內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上的0、1、2或3個(gè)錯(cuò)配，其中在所述內(nèi)源成熟miRNA位置12至最后一位上的每個(gè)所述錯(cuò)配都鄰近至少一個(gè)互補(bǔ)堿基對(duì)。6.權(quán)利要求5的重組DNA構(gòu)建體，其中所述至少一個(gè)miRNA誘騙序列包含(a)天然存在的miRNA誘騙序列，或(b)合成miRNA誘騙序列，或(c)天然存在的miRNA誘騙序列和合成miRNA誘騙序列兩者。7.權(quán)利要求5的重組DNA構(gòu)建體，其中所述至少一個(gè)miRNA誘騙序列被選自以下的至少一種miRNA識(shí)別并結(jié)合、但不切割(a)具有序列SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDNO.8742的成熟miRM0N18miRNA或者從選自SEQIDNO.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRNA；(b)具有序列SEQIDNO.8815、SEQIDNO.8816、SEQIDNO.8817或SEQIDNO.8818的成熟miR399或者從選自SEQIDNO.8819、SEQIDNO.8820、SEQIDNO.8821和SEQIDNO.8822的miR399前體序列獲得的成熟miRNA；和(c)具有序列SEQIDNO.8845的成熟miR319。8.一種非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的重組DNA構(gòu)建體。9.一種非天然轉(zhuǎn)基因植物，所述植物包括由權(quán)利要求8的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物，或由權(quán)利要求8的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物的后代植物，其中相對(duì)于缺乏所述重組DNA構(gòu)建體的植物而言，所述非天然轉(zhuǎn)基因植物具有選自以下性狀的至少一個(gè)改變的性狀(b)提高非生物脅迫耐性；(c)提高生物脅迫耐性；(d)提高針對(duì)所述植物的有害動(dòng)物或病原體的抗性；(e)改變初級(jí)代謝產(chǎn)物組成；(f)改變次級(jí)代謝產(chǎn)物組成；(g)改變微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(h)提高產(chǎn)量；(i)提高氮或其它營(yíng)養(yǎng)物的利用能力；(j)改變農(nóng)藝學(xué)特性；(k)改變生長(zhǎng)或生殖特性；和(1)提高收獲、貯存或加工品質(zhì)。10.一種影響基因抑制的方法，所述方法包括(a)提供非天然轉(zhuǎn)基因植物，所述植物包括由包含權(quán)利要求2的重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物，或者由包含權(quán)利要求2的重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物的后代植物；和(b)在所述非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄所述重組DNA構(gòu)建體；其中所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生能夠在所述非天然轉(zhuǎn)基因植物中抑制所述至少一個(gè)靶基因的RNA，因此相對(duì)于在沒有所述重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄時(shí)的表達(dá)而言，至少一個(gè)靶基因被抑制。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述至少一個(gè)靶基因是選自以下的至少一個(gè)基因?qū)λ龇翘烊晦D(zhuǎn)基因植物而言是天然的基因，所述非天然轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)基因，以及對(duì)所述非天然轉(zhuǎn)基因植物的病毒、細(xì)菌、真菌或無脊椎動(dòng)物害蟲或病原體而言是天然的基因。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述至少一個(gè)靶基因是多個(gè)靶基因。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述基因抑制包括空間特異性基因抑制、時(shí)間特異性基因抑制、發(fā)育特異性基因抑制或誘導(dǎo)型基因抑制。14.一種同時(shí)影響至少一個(gè)靶基因的基因抑制和至少一個(gè)目標(biāo)基因的基因表達(dá)的方法，所述方法包括(a)提供非天然轉(zhuǎn)基因植物，所述植物包括由包含權(quán)利要求2的重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物，或者由包含權(quán)利要求2的重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來的再生植物的后代植物，其中所述重組DNA構(gòu)建體還包含用于表達(dá)所述至少一個(gè)目標(biāo)基因的基因表達(dá)元件；和(b)在所述非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄所述重組DNA構(gòu)建體，其中，當(dāng)所述重組DNA構(gòu)建體在所述非天然轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)錄時(shí)，產(chǎn)生能夠抑制所述至少一個(gè)靶基因的轉(zhuǎn)錄RNA和編碼所述至少一個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄RNA，因此相對(duì)于在沒有所述重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄時(shí)的表達(dá)而言，所述至少一個(gè)靶基因被抑制，而且所述至少一個(gè)目標(biāo)基因同時(shí)表達(dá)。15.一種非天然轉(zhuǎn)基因植物，所述植物由包含權(quán)利要求2的重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來，其中用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的所述至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含轉(zhuǎn)錄為具有選自以下miRMON18前體序列折回結(jié)構(gòu)的miRNA前體的DNA元件SEQIDNO.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800，其中所述miRNA前體包含所述miRM0N18前體序列的至少90%核苷酸的連續(xù)區(qū)段并加工為具有序列SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDN0.8742的成熟miRM0N18miRNA，而且所述至少一個(gè)靶基因是植物內(nèi)源基因，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在所述植物中的表達(dá)導(dǎo)致所述至少一個(gè)靶基因被抑制，其中所述至少一個(gè)靶基因包含SPX結(jié)構(gòu)域。16.一種非天然轉(zhuǎn)基因植物，所述植物由包含權(quán)利要求2的重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞制備而來，所述重組DNA構(gòu)建體還包含轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元，其中用于調(diào)節(jié)至少一個(gè)靶基因表達(dá)的所述至少一個(gè)可轉(zhuǎn)錄DNA元件包含位于所述轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)或其附近并轉(zhuǎn)錄為包含miRNA識(shí)別位點(diǎn)的RNA的DNA元件，所述miRNA識(shí)別位點(diǎn)被具有序列SEQIDNO.393、SEQIDNO.3227或SEQIDN0.8742的成熟miRM0N18miRNA識(shí)別或者被從選自SEQIDNO.1763、SEQIDNO.3936和SEQIDNO.8800的miRM0N18前體序列獲得的成熟miRMONISmiRNA識(shí)別，而且所述至少一個(gè)靶基因包含由所述轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄單元編碼的所述轉(zhuǎn)基因，而且其中所述重組DNA構(gòu)建體在植物中的表達(dá)導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)基因在并非天然表達(dá)所述成熟miRMONISmiRNA的所述植物的細(xì)胞中表達(dá)，其中所述至少一個(gè)靶基因包含SPX結(jié)構(gòu)域。17.一種提供具有至少一個(gè)改變的性狀的非天然轉(zhuǎn)基因作物的方法，所述方法包括在所述非天然轉(zhuǎn)基因作物中抑制至少一個(gè)內(nèi)源miRNA誘騙序列，因而相對(duì)于不表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體的作物而言，導(dǎo)致所述非天然轉(zhuǎn)基因作物表現(xiàn)出選自以下性狀的至少一個(gè)改變的性狀(i)提高非生物脅迫耐性；()提高生物脅迫耐性；(iii)提高針對(duì)所述植物的有害動(dòng)物或病原體的抗性；(iv)改變初級(jí)代謝產(chǎn)物組成；(ν)改變次級(jí)代謝產(chǎn)物組成；(vi)改變微量元素、類胡蘿卜素或維生素組成；(vii)提高產(chǎn)量；(viii)提高氮或其它營(yíng)養(yǎng)物的利用能力；(ix)改變農(nóng)藝學(xué)特性；(x)改變生長(zhǎng)或生殖特性；和(xi)提高收獲、貯存或加工品質(zhì)。18.—種在缺氮或缺磷條件下提供產(chǎn)量提高的非天然轉(zhuǎn)基因作物的方法，所述方法包括在所述非天然轉(zhuǎn)基因作物中表達(dá)權(quán)利要求7的重組DNA構(gòu)建體。全文摘要本發(fā)明公開了新的微RNA和它們的前體，還公開了包含這些新的miRNA、miRNA前體、miRNA啟動(dòng)子和對(duì)應(yīng)于miRNA的miRNA識(shí)別位點(diǎn)的重組DNA構(gòu)建體。本發(fā)明包括表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)-應(yīng)答表達(dá)的新的miRNA和miRNA前體。本發(fā)明也公開了miRNA誘騙序列。本發(fā)明還提供了在其基因組中含有本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的非天然轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子，以及利用本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體來調(diào)控基因表達(dá)的方法。文檔編號(hào)A01H1/00GK101802215SQ200780045788公開日2010年8月11日申請(qǐng)日期2007年10月12日優(yōu)先權(quán)日2006年10月12日發(fā)明者B·S·戈德曼,E·K·克里格爾,E·艾倫,J·K·羅伯茨,S·E·黑塞爾,S·I·伊瓦舒塔,張遠(yuǎn)記,郭亮,黃士杰申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司