專利名稱：巨大合葉珊瑚粘液抗菌物質的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種巨大合葉珊瑚(S.gigantea)粘液抗菌物質的提取方法背景技術珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是地球上產量和多樣性最高的系統(tǒng)之一，但是，近幾十年來，由于病害的爆發(fā)使得珊瑚蟲的死亡，從而導致珊瑚礁白化，所以許多科技人員投入到石珊瑚的抗病力的研究之中。珊瑚蟲分泌的粘液覆蓋在珊瑚蟲所形成的礁塊表面，這層粘液是珊瑚抵抗病菌的第一道門戶，因此研究粘液的抗病菌作用非常重要。粘液中所含有的化合物不僅可以作為珊瑚自身抗感染物質，而且許多化合物所具有的生物活性還可以為人類提供抗菌素。
雖然石珊瑚的粘液研究意義重大，但是粘液提取的方法問題很少有人深入研究。魚類的表面粘液中分離得到了許多抗菌活性化合物。對粘液抗菌現(xiàn)象的研究很多，諸如海龜、蛙類等，但是很少有人研究珊瑚礁粘液的抗菌性。實際上，作為營固著生活的石珊瑚，在抗感染方面起主要作用是表面的粘液，因此其中含有豐富的抗菌物質；并且這些抗菌物質還可能為人類提供新的醫(yī)學藥物。提取活性物質時選擇適當?shù)娜軇?，是獲得目的產物的關鍵所在。但是至今還沒有人對巨大合葉珊瑚(S.gigantea)進行提取溶劑的研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是根據科研和實際應用的需求提供一種能獲得有很強抗菌活性的抗菌物質的巨大合葉珊瑚(S.gigantea)粘液抗菌物質的提取方法。
本發(fā)明所提供的提取方法，其提取步驟如下(1)從冰箱中取出冷凍保存的巨大合葉珊瑚粘液，于室溫下解凍；(2)將解凍的粘液按體積比為2-3∶1的比例加入到提取溶劑中，在冰浴上攪拌3-5小時，得到提取液，所述的提取溶劑的組分是水、乙二胺四乙酸四鈉鹽、苯甲基磺酰氟、抑蛋白酶肽和乙酸，其中，乙二胺四乙酸四鈉鹽、苯甲基磺酰氟、抑蛋白酶肽和乙酸的濃度分別為4-40mM、0.4-4mM、0.0004-0.0012mM和4-8M；(3)將提取液在15000-20000rpm，20-40min，3-5℃下離心；(4)收集離心上清液，過濾，首先使用濾紙，再先后用0.45μm和0.2μm的微孔濾膜過濾，所得濾液再用1K超濾離心管超濾濃縮，得濃縮液；(5)將濃縮液中加入含聚乙二醇8000和甘氨酸的凍干輔助劑后，放在≤-40℃冰箱中凍結，所述的凍干輔助劑中，聚乙二醇8000的質量濃度為1％-2％，甘氨酸的質量濃度為0.1％-0.2％；(6)將凍結后的制品在凍干機里凍干。
所得的凍干品即為本發(fā)明所提取得到的最終制品，制得凍干品可以在低溫長期保存，使活性不喪失。
申請人對本發(fā)明制品進行了以下的抗菌測試以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)作為測試菌種，以紙片擴散法進行抗菌測試，檢測提取效果。由一片直徑為6mm小濾紙，吸收用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0-7.4)溶解的凍干產品2-4mg，以雙層瓊脂糖紙片擴散法測試對金黃色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)抑制效果，結果顯示，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達9-13mm，說明制品中含有抗菌活性很強的抗菌物質。
在本發(fā)明的提取方法中，所使用的提取溶劑，能最大程度上溶解粘液樣品，方便后續(xù)的分級提取和樣品純化，能高效、快速地從巨大合葉珊瑚(S.gigantea)粘液中提取得到抗菌物質；該方法在提取過程中能穩(wěn)定活性物質，避免提取過程中的攪拌導致物質失活；并具有提取工藝簡便，提取費用低廉的優(yōu)點。
具體實施例方式
以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明實施例一從冰箱里取出巨大合葉珊瑚(S.gigantea)凍存的粘液樣品(50ml)，在室溫下解凍。
在置于冰浴上的玻璃燒瓶里配制提取溶劑約18ml，配比為超純水 8.5ml0.5M乙二胺四乙酸四鈉鹽 1.2ml200mM苯甲基磺酰氟 0.3ml0.36mM抑蛋白酶肽0.05ml冰醋酸 8ml將50ml解凍的粘液樣品加入到提取溶劑中。
在冰浴條件下攪拌3小時，離心(17000rpm，30min，4℃)，收集上清液，過濾和超濾。超濾濃縮液中加入聚乙二醇8000和甘氨酸，使其濃度分別為1.5％和0.2％。放入-70℃冰箱中凍結，然后凍干，即得制品。
稱取凍干品，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)溶解，溶液滴加于滅過菌的直徑為6mm濾紙片上，使得每個紙片含有凍干品4mg。雙層瓊脂糖紙片擴散法測試對金黃色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)抑制效果。向培養(yǎng)(92mm×15mm)中加入10ml底層培養(yǎng)基(該層培養(yǎng)基含有6％w/v胰蛋白胨培養(yǎng)基，1％w/v瓊脂糖)。待底層培養(yǎng)基凝固后加入10ml上層培養(yǎng)基(該層培養(yǎng)基中含有3mg胰蛋白胨培養(yǎng)基，1％w/v瓊脂糖，10ml的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)，對數(shù)生長期細菌105CFU/ml)。將加有凍干品的濾紙片和對照濾紙片(用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)浸泡)置于培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)皿放于37℃培養(yǎng)25小時后，量取透明斑的直徑，再減去6mm，則得抑菌圈大小?？咕鷾y試重復3次，除去濾紙片直徑6mm后，抑菌圈直徑平均值12mm。
實施例二從冰箱里取出巨大合葉珊瑚(S.gigantea)凍存的粘液樣品(100ml)，在室溫下解凍。在置于冰浴上的玻璃燒瓶里配制提取溶劑約50ml，配比為超純水 37.4ml0.5M乙二胺四乙酸四鈉鹽 0.4ml200mM苯甲基磺酰氟 0.1ml0.36mM抑蛋白酶肽 0.06ml冰醋酸 12ml將100ml解凍的粘液樣品加入到提取溶劑中。
在冰浴條件下攪拌5小時，離心(15000rpm，40min，5℃)，收集上清液，過濾和超濾。超濾濃縮液中加入聚乙二醇8000和甘氨酸，使其濃度分別為1％和0.1％。放入-70℃冰箱中凍結，然后凍干，即得制品。
稱取凍干品，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)溶解，溶液滴加于滅過菌的直徑為6mm濾紙片上，使得每個紙片含有凍干品3mg。雙層瓊脂糖紙片擴散法測試對金黃色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)抑制效果。向培養(yǎng)皿(92mm×15mm)中加入10ml底層培養(yǎng)基(該層培養(yǎng)基含有6％w/v胰蛋白胨培養(yǎng)基，1％w/v瓊脂糖)。待底層培養(yǎng)基凝固后加入10ml上層培養(yǎng)基(該層培養(yǎng)基中含有3mg胰蛋白胨培養(yǎng)基，1％w/v瓊脂糖，10ml的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，對數(shù)生長期細菌105CFU/ml)。將加有凍干品的濾紙片和對照濾紙片(用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)浸泡)置于培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)皿放于37℃培養(yǎng)25小時后，量取透明斑的直徑，再減去6mm，則得抑菌圈大小?？咕鷾y試重復3次，除去濾紙片直徑6mm后，抑菌圈直徑平均值10mm。
實施例三從冰箱里取出巨大合葉珊瑚(S.gigantea)凍存的粘液樣品(50ml)，在室溫下解凍。
在置于冰浴上的玻璃燒瓶里配制提取溶劑約20ml，配比為超純水 13ml0.5M乙二胺四乙酸四鈉鹽 0.8ml200mM苯甲基磺酰氟 0.15ml0.36mM抑蛋白酶肽 0.03ml冰醋酸 6ml將50ml解凍的粘液樣品加入到提取溶劑中。
在冰浴條件下攪拌4小時，離心(20000rpm，25min，4℃)，收集上清液，過濾和超濾。超濾濃縮液中加入聚乙二醇8000和甘氨酸，使其濃度分別為1.5％和0.15％。放入-70℃冰箱中凍結，然后凍干，即得制品。
稱取凍干品，用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)溶解，溶液滴加于滅過菌的直徑為6mm濾紙片上，使得每個紙片含有凍干品3mg。雙層瓊脂糖紙片擴散法測試對金黃色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)抑制效果。向培養(yǎng)皿(92mm×15mm)中加入10ml底層培養(yǎng)基(該層培養(yǎng)基含有6％w/v胰蛋白胨培養(yǎng)基，1％w/v瓊脂糖)。待底層培養(yǎng)基凝固后加入10ml上層培養(yǎng)基(該層培養(yǎng)基中含有3mg胰蛋白胨培養(yǎng)基，1％w/v瓊脂糖，10ml的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)，對數(shù)生長期細菌105CFU/ml)。將加有凍干品的濾紙片和對照濾紙片(用20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)浸泡)置于培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)皿放于37℃培養(yǎng)20小時后，量取透明斑的直徑，再減去6mm，則得抑菌圈大小。抗菌測試重復3次，除去濾紙片直徑6mm后，抑菌圈直徑平均值11mm。
權利要求
1.一種巨大合葉珊瑚(Symphyllia gigantea)粘液抗菌物質的提取方法，其特征在于提取步驟如下(1)從冰箱中取出冷凍保存的巨大合葉珊瑚粘液，于室溫下解凍；(2)將解凍的粘液按體積比為2-3∶1的比例加入到提取溶劑中，在冰浴上攪拌3-5小時，得到提取液，所述的提取溶劑的組分是水、乙二胺四乙酸四鈉鹽、苯甲基磺酰氟、抑蛋白酶肽和乙酸，其中，乙二胺四乙酸四鈉鹽、苯甲基磺酰氟、抑蛋白酶肽和乙酸的濃度分別為4-40mM、0.4-4mM、0.0004-0.0012mM和4-8M；(3)將提取液在15000-20000rpm，20-40min，3-5℃下離心；(4)收集離心上清液，過濾，首先使用濾紙，再先后用0.45μm和0.2μm的微孔濾膜過濾，所得濾液再用1K超濾離心管超濾濃縮，得濃縮液；(5)將濃縮液中加入含聚乙二醇8000和甘氨酸的凍干輔助劑后，放在≤-40℃冰箱中凍結，所述的凍干輔助劑中，聚乙二醇8000的質量濃度為1％-2％，甘氨酸的質量濃度為0.1％-0.2％；(6)將凍結后的制品在凍干機里凍干。
全文摘要
本發(fā)明提供一種巨大合葉珊瑚(S.gigantea)粘液抗菌物質的提取方法，其提取步驟如下將解凍的粘液按體積比為2－3∶1的比例加入到組分為水、乙二胺四乙酸四鈉鹽、苯甲基磺酰氟、抑蛋白酶肽和乙酸的提取溶劑中，在冰浴上攪拌3－5小時，得到提取液，將提取液離心后，收集離心上清液，過濾，超濾濃縮，再將濃縮液凍干，即得本發(fā)明制品。本發(fā)明能高效、快速地從巨大合葉珊瑚(S.gigantea)粘液中提取得到抗菌物質，提取過程能避免抗菌物質失活，使之保持穩(wěn)定的活性物質。
文檔編號A01P1/00GK1792165SQ20051012127
公開日2006年6月28日 申請日期2005年12月28日 優(yōu)先權日2005年12月28日
發(fā)明者陳國華, 黃良民, 譚燁輝 申請人:中國科學院南海海洋研究所