專利名稱：一種具有毒殺植物線蟲活性的化合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有毒殺植物線蟲活性的化合物及其應(yīng)用，屬微生物生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲是一種危害嚴(yán)重的植物病害，每年對農(nóng)作物造成的損失高達(dá)1044億美元。目前對線蟲的防治仍然以化學(xué)防治為主，但由于化學(xué)殺線蟲劑多數(shù)是高毒、高殘留農(nóng)藥，對人蓄和環(huán)境造成嚴(yán)重的威脅，已逐步受到限制。有的品種，如溴甲烷類等已被多數(shù)國家禁用。因此，研究開發(fā)高效低毒及生物殺線蟲劑已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中重要問題。在線蟲的生防研究中，目前已有直接利用菌體的第一代商品制劑問世，己在相當(dāng)大的范圍內(nèi)推廣應(yīng)用。但由于產(chǎn)品是活菌體，受抑菌作用等因素影響，導(dǎo)致在不同國家不同土壤中防治效果不穩(wěn)定。為此，人們更加關(guān)注線蟲生防第二代產(chǎn)品，即具有殺線蟲功能的微生物次生代謝產(chǎn)物的研究與開發(fā)。
在近30年的研究中，已從50多株微生物菌株中分離到90多種對線蟲有活性的化合物，其結(jié)構(gòu)類型多樣，主要有醌類、生物堿類、萜類、肽類、吡喃類、脂肪酸類和萘類等。但由于各種原因，這些化合物中具有開發(fā)潛力的很少。因此，通過進(jìn)一步篩選獲得對線蟲有活性的物質(zhì)或組分，為研究開發(fā)新型線蟲生防制劑奠定基礎(chǔ)具有重要意義。
國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索表明，本發(fā)明化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one為一新結(jié)構(gòu)化合物，并未見有關(guān)活性和天然來源的報(bào)道，也未見其被用于制備殺線蟲制劑應(yīng)用的公開文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從具有毒殺植物寄生線蟲功能的真菌中篩選出高毒力菌株，從菌株的次生代謝產(chǎn)物中提取高毒力殺線蟲化合物，為研究開發(fā)生物殺線蟲制劑和研究開發(fā)仿生生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明人在前期研究中，篩選獲得了具有良好殺植物寄生線蟲功能的真菌(Coprinus xanthothrix)4916，4916菌株已于2005年10月31日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.1519。
本發(fā)明將4916菌株采用PDA培養(yǎng)基，用常規(guī)發(fā)酵方法培養(yǎng)，將發(fā)酵液低壓濃縮后，用甲醇提取。將甲醇提取物經(jīng)反復(fù)硅膠柱，氯仿/甲醇洗脫，得到本發(fā)明的化合物，該化合物是一種含氮化合物，分子式C23H42O2N2，分子量401.31，經(jīng)核磁共振波譜，質(zhì)譜，紅外光譜和紫外光譜確定為1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one，結(jié)構(gòu)式為 實(shí)驗(yàn)表明1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one具有顯著的毒殺Panagrellus redivivus線蟲和花生根結(jié)線蟲(Meloidogyne arenaria)的功能，24小時(shí)對Panagrellus redivivus線蟲的半致死率(ED50)為200ppm，90％致死率(ED90)為500ppm。對花生根結(jié)線蟲的半致死率(ED50)為200ppm，90％致死率(ED90)為500ppm。
本發(fā)明將從(Coprinus xanthothrix)4916中用現(xiàn)有方法分離得到的1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one作為制備殺植物線蟲制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明亦可將0.5mg 1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dieh-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one的化合物溶于二甲亞砜，再用Tween-20水溶液稀釋，得到具殺線蟲活性物質(zhì)的乳濁液；乳濁液中二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％。
本發(fā)明與現(xiàn)有的殺植物寄生線蟲藥相比，具有高效、低毒及低殘留等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明化合物的常規(guī)發(fā)酵生產(chǎn)方法1、將4916菌株的菌絲體接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，20-30℃下培養(yǎng)4-8天，獲得試管種。
2、將試管種接種到250ml三角瓶中(每瓶裝50ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為PDB培養(yǎng)基，自然pH。培養(yǎng)溫度20-30℃；搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100-300rpm；培養(yǎng)時(shí)間4-12天，待菌絲體大量產(chǎn)生后即可。
3、將含菌絲的發(fā)酵液低壓濃縮后，用甲醇反復(fù)溶解，將溶解物合并低壓濃縮后得甲醇提取物。甲醇提取物經(jīng)正相硅膠柱層析，氯仿反復(fù)洗脫?；钚愿櫃z測所分離到的組分，將具有活性的部分合并低壓濃縮，經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，氯仿/甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)活性檢測，活性部分經(jīng)TLC檢測(展開劑氯仿∶甲醇5∶1；硫酸顯色)，將只具有同一個(gè)單點(diǎn)的部位合并得到化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one。
本發(fā)明化合物對植物線蟲的藥效試驗(yàn)1、試驗(yàn)用藥劑(1)試驗(yàn)藥劑將前述本發(fā)明化合物溶于二甲亞砜，用無菌蒸餾水稀釋，二甲亞砜的終濃度不超過3％。
(2)對照用藥劑用常規(guī)的方法及操作條件將未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基低壓濃縮后，用甲醇提取。將甲醇提取物濃縮后用二甲亞砜溶解，再用無菌蒸餾水稀釋，二甲亞砜的終濃度不超過3％。
2、制備試驗(yàn)用線蟲(1)制備Panagrellus redivivus線蟲將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無菌水洗滌，瞬時(shí)離心，棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
(2)花生根結(jié)線蟲(Meloidogyne arenaria)的培養(yǎng)將溫室培養(yǎng)的帶有花生根結(jié)線蟲的蕃茄根用無菌水洗凈，用解剖針挑取根結(jié)線蟲的卵囊置于0.4M的KCl溶液中，在5ml離心管中依次用4ml無菌水(三次)、1ml無菌青-鏈霉素雙抗溶液、3ml 0.1％的NaClO溶液洗滌和消毒，每一步驟均通過短暫離心(8000轉(zhuǎn)30秒)除去上清液。洗滌好的蟲卵置于0.4M的ZnCl2溶液中孵化48小時(shí)，二齡幼蟲用移液器收集于1.5ml離心管，通過短暫離心(5000轉(zhuǎn)30秒)富集備用。
3、試驗(yàn)方法將本發(fā)明化合物稀釋為不同濃度供試藥液，將藥液200μl加于20孔板中，加入活線蟲100-150條，置于25℃下，分別于4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)在光學(xué)顯微鏡下檢查計(jì)算線蟲的死亡率。
鑒定死亡的方法為在處理板孔中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
死亡率％＝(死亡線蟲數(shù)/(死亡線蟲數(shù)+存活線蟲數(shù)))×100％校正死亡率％＝樣品死亡率-對照死亡率實(shí)施例1化合物對線蟲的毒殺作用將0.5mg 1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one的化合物溶于少量二甲亞砜，用無菌蒸餾水稀釋為500ppm溶液，二甲亞砜的終濃度不超過3％。
按上述試驗(yàn)方法進(jìn)行藥效試驗(yàn)。列表所示為校正死亡率。
表1化合物對P.redivivus線蟲的毒殺作用

結(jié)果表明，本發(fā)明化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one 500ppm水溶液對P.redivivus線蟲的致死率在24小時(shí)達(dá)到80％以上。具有明顯的殺線蟲活性。
表2化合物對M.arenaria線蟲的毒殺作用

結(jié)果表明，本發(fā)明化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one 500ppm水溶液對M.arenaria線蟲的致死率在24小時(shí)達(dá)到80％以上。具有明顯的殺線蟲活性。
實(shí)施例2化合物對線蟲的半致死率ED50實(shí)施例2方法同實(shí)施例1，不同之處為將2.5mg 1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one的化合物溶于少量二甲亞砜，配制為1000ppm的水溶液，隨后倍半稀釋，測定半致死率(ED50)和90％致死率(ED90)，待測溶液中二甲亞砜的終濃度不超過3％。
表3化合物對P.redivivus線蟲的ED50和ED90

結(jié)果表明，本發(fā)明化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one在24小時(shí)對P.redivivus線蟲的半致死率(ED50)為250ppm，90％致死率(ED90)為500pm。
表4化合物對M.arenaria線蟲的ED50和ED90

結(jié)果表明，本發(fā)明化合物1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one在24小時(shí)對M.arenaria線蟲的半致死率(ED50)為250ppm，90％致死率(ED90)為500ppm。
實(shí)施例3化合物與乳化劑混合對線蟲的毒殺作用實(shí)施例3方法同實(shí)施例1，不同之處為將0.5mg 1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one的化合物溶于二甲亞砜，再用0.3％濃度的Tween-20水溶液稀釋，稀釋濃度為500ppm，得具殺線蟲活性物質(zhì)的乳濁液。在該乳濁液中，二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％。
表5化合物乳化制劑對P.redivivus線蟲的毒殺作用

結(jié)果表明，1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one與乳化劑混合后可以提高毒殺P.redivivus線蟲活性，提高率為4-12％。
表6化合物乳化制劑對M.arenaria線蟲的毒殺作用

結(jié)果表明，1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-djen-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one與乳化劑混合后可以提高毒殺M.arenaria線蟲活性，提高率為4-30％。
權(quán)利要求
1.一種具有毒殺植物寄生線蟲活性的化合物，由生產(chǎn)菌株和輔料經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、甲醇提取、反復(fù)硅膠柱及氯仿/甲醇洗脫工序后分離得到，其特征在于(1)生產(chǎn)菌株為(Coprinus xanthothrix)4916，4916菌株已于2005年10月31日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.1519；(2)分離得到的化合物是一種含氮化合物，分子式C23H42O2N2，分子量401.31，經(jīng)核磁共振波譜，質(zhì)譜，紅外光譜和紫外光譜確定為1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one，結(jié)構(gòu)式為
2.權(quán)利要求1所說的化合物，其特征在于(1)1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one化合物可應(yīng)用于制備殺線蟲制劑；(2)將0.5mg1-(1-((2E，6Z)-6-amino-5-methylnona-2，6-dien-4-yl)-4-methylpiperidin-2-yloxy)heptan-2-one化合物溶于二甲亞砜，再用Tween-20水溶液稀釋后得具殺線蟲活性物質(zhì)的乳濁液；乳濁液中二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％；該乳濁液為生物殺線蟲劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有毒殺植物寄生線蟲活性的化合物及其應(yīng)用，屬微生物生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明由(Coprinus xanthothrix)4916菌株和輔料經(jīng)常規(guī)發(fā)酵后分離得到1－(1－((2E，6Z)－6－amino－5－methylnona－2，6－dien－4－yl)－4－methylpiperidin－2－yloxy)heptan－2－one化合物，該化合物是一種含氮化合物，分子式C23H42O2N2，分子量401.31。該化合物具有顯著的毒殺線蟲活性，24小時(shí)對Panagrellus redivivus線蟲的半致死率(ED
文檔編號A01N25/04GK1788559SQ200510048710
公開日2006年6月21日 申請日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日
發(fā)明者劉亞君, 張克勤, 周薇 申請人:云南大學(xué)