專利名稱：具有改變的生長特性的植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣義上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及改變植物生長特性的方法。更具體的說，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)植物中B型CDK(細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶)核酸地表達，和/或通過調(diào)節(jié)植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平來改變植物生長特性的方法。本發(fā)明也涉及具有B型CDK核酸的已調(diào)節(jié)的表達和/或B型CDK蛋白的已調(diào)節(jié)的活性和/或水平的植物，該植物相對于對應(yīng)的野生型的植物具有改變的生長特性。本發(fā)明還提供了新的篩選方法，鑒定相對于對應(yīng)的未突變CDK具有提高了CDK活性的CDK突變體。本發(fā)明同時提供了新的篩選方法，鑒定能夠結(jié)合CKI(細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶的抑制劑)的無活性CDK。本發(fā)明還提供通過本發(fā)明的篩選方法可獲得的CDK突變體。
世界人口的不斷增長和農(nóng)業(yè)可用耕地供應(yīng)的不斷減少加速為了提高農(nóng)業(yè)效率的農(nóng)業(yè)研究。傳統(tǒng)的農(nóng)作物和園藝改良方法是利用選擇性繁殖技術(shù)鑒別具有期望特性的植物。但是，這種選擇性繁殖技術(shù)具有許多缺點，即一般來說這些技術(shù)是勞動密集型的，產(chǎn)生的通常具有不同遺傳組成的植物從親本植物傳代后不一定總能得到期望的性狀。分子生物學(xué)的進展使人類可以改變動物和植物的種質(zhì)。植物基因工程承擔(dān)著遺傳物質(zhì)(一般以DNA或RNA的形式)的分離和操縱、和該遺傳物質(zhì)的隨后導(dǎo)入的使命。這種技術(shù)具有提供具有各種改良經(jīng)濟、農(nóng)藝或園藝特性的植物的能力。具體經(jīng)濟利益的一個特征就是產(chǎn)量。通常產(chǎn)量定義為作物的有經(jīng)濟價值的可測量產(chǎn)物。其可從量和/或質(zhì)上定義。產(chǎn)量直接依賴與幾個因素，例如器官的數(shù)量和大小、植物的結(jié)構(gòu)(例如分枝的數(shù)目)、種子產(chǎn)量及其它。根的生長、養(yǎng)分的攝取和逆境耐性也是決定產(chǎn)量的重要因素。植物通常面臨的壓力包括環(huán)境(非生物的)壓力(例如異常高或低溫引起的溫度壓力；養(yǎng)分不足導(dǎo)致的壓力；缺水(干旱)導(dǎo)致的壓力)和生物壓力(其他植物(雜草)、動物性害蟲和病原體施加給植物的)。不僅通過優(yōu)化上述因素中的一種可以增加作物的產(chǎn)量，而且通過改變植物內(nèi)在的生長機制也可以增加作物的產(chǎn)量。
植物內(nèi)在的生長機制是總稱為“細胞周期”的高度有序的事件。細胞周期的進行是所有多細胞生物生長和發(fā)育的基礎(chǔ)，對于細胞增殖至關(guān)重要。在酵母、哺乳動物和植物中細胞周期的主要組分是高度保守的。一般細胞周期分為下列有序的時期G0-G1-S-G2-M。DNA的復(fù)制或合成一般發(fā)生在S期(“S”代表DNA的合成)，染色體的有絲分裂分離發(fā)生在M期(“M”是有絲分裂)，和分裂間期(intervening gapphase)G1(DNA復(fù)制前的細胞生長時期)和G2(DNA復(fù)制后細胞準備分裂的時期)。M期的最后步驟，胞質(zhì)分裂后細胞分裂完成。離開細胞周期的細胞和周期中靜止的細胞稱為處于G0期。這個時期內(nèi)的細胞能夠被刺激在G1期進入細胞周期。G1、G2和G0中的“G”表示“間期”。細胞周期程序的完成使每一子細胞在細胞分裂中得到親代基因組的全部備份。
細胞分裂被兩個主要的細胞周期事件控制，即DNA合成的起始和細胞分裂的起始。這些關(guān)鍵事件間的每個轉(zhuǎn)化是由特殊蛋白質(zhì)復(fù)合體(參與DNA復(fù)制和分離)代表的關(guān)卡控制的。在哺乳動物和植物細胞中，G1/S邊界上DNA合成的必需基因的表達由轉(zhuǎn)錄因子中的E2F家族控制(La Thangue，1994(Curr.Opin.Cell Biol.6(3)，443-450)；Muller等人，2001(Genes Dev.15(3)，267-285)；De Veylder等人，2002(EMBO J.21(6)，1360-1368))。進入細胞周期由整合信號并激活細胞周期基因轉(zhuǎn)錄的E2F/Rb復(fù)合體調(diào)節(jié)/引發(fā)。細胞周期的不同階段的轉(zhuǎn)化和之后細胞周期的進行由不同的異源二聚化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的形成和激活驅(qū)動，所述絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶一般指細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)。這些激酶活性的首要條件是和具體周期蛋白的物理結(jié)合，激活的時間選擇主要由周期蛋白的表達決定。周期蛋白的結(jié)合導(dǎo)致相關(guān)CDK的N末端部位(lobe)的構(gòu)像改變，導(dǎo)致復(fù)合體的定位和底物特異性。當與周期蛋白結(jié)合時，單體CDK被激活，并因此具有激酶的活性。在細胞周期中，細胞周期蛋白水平波動，并因此體現(xiàn)出一個決定CDK激活時間的主要因素。在細胞周期中，含有細胞周期蛋白和CDK的這些復(fù)合體的周期性活動介導(dǎo)細胞周期轉(zhuǎn)化(關(guān)卡)的時間調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)CDK活性的其他因素包括CDK抑制劑(CKI或ICK、KIP、CIP、INK)，CDK激活激酶(CAK)，CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亞基(CKS)(Mironov等人，1999(Plant Cell11(4)，509-522)；Reed 1996(Progressin Cell cycle Research2，15-27))。
在植物中，一直研究兩個主要CDK類別，已知的A型和B型CDK。A型CDK調(diào)節(jié)G1至S和G2至M的轉(zhuǎn)化，而B型CDK似乎僅控制G2至M的關(guān)卡(Hemerly等人，1995(EMBO J.14(16)，3925-3936)；Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)；Porceddu等人，2001(J.Biol.Chem.276(39)36354-36360))。另外，已有C型CDK和CDK激活激酶(CAK)存在的報道(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235)；Umeda等人，1998(Proc Natl Acad SciUSA.95(9)，5021-5026.；Joubès等人，2001(Plant Physiol.126(4)，1403-1415))，和D型、E型和F型CDK存在的報道(Vandepoele等人，2002(Plant Cell 14(4)，903-916))。
影響植物中細胞周期和由此改變植物的各種生長特性的能力將在多個領(lǐng)域中有許多應(yīng)用，例如作物增殖、植物繁殖、觀賞植物生產(chǎn)、aboriculture、園藝、林業(yè)、藻類或植物生產(chǎn)(例如用作生物反應(yīng)器，例如藥品、抗體或疫苗的物質(zhì)的生產(chǎn)，或有機廢物生物轉(zhuǎn)化或用作高產(chǎn)量藻類和植物的養(yǎng)料)。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)在植物中B型CDK核酸的表達，和/或調(diào)節(jié)在植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平，提供具有改變的生長特性的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個實施方式，本發(fā)明提供了改變(改良)植物生長特性的方法，包括調(diào)節(jié)植物中B型CDK核酸的表達，和/或調(diào)節(jié)在植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平，其中改變的生長特性選自提高生長速度、增加產(chǎn)量和改變的結(jié)構(gòu)。
調(diào)節(jié)B型CDK核酸的表達即提高或增加B型CDK基因/核酸的表達。調(diào)節(jié)B型CDK蛋白的活性和/或水平即增加活性(可能是，或可能不是增加B型CDK蛋白水平的結(jié)果)。相對于對應(yīng)的野生型植物中B型CDK的表達、活性和/或水平，變化了的表達、活性和/或水平被改變。在本領(lǐng)域中，獲得提高或增加基因表達或基因產(chǎn)物的方法已被詳盡記載，包括例如通過強啟動子驅(qū)動的超表達、轉(zhuǎn)錄增強子或翻譯增強子的使用。
改變(更具體的，改良)植物生長特性的優(yōu)選方法包括在植物中導(dǎo)入和表達B型CDK核酸，所述核酸編碼B型CDK蛋白。該核酸可通過，例如轉(zhuǎn)化導(dǎo)入植物中。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，提供了改良植物生長特性的方法，包括向植物中導(dǎo)入B型CDK核酸的可表達形式，所述B型CDK核酸編碼B型CDK蛋白，其中改良的生長特性是均相對于對應(yīng)的野生型植物，且為生長速度的提高，產(chǎn)量的增加和改變的結(jié)構(gòu)中的任意一種或幾種。
本發(fā)明中“B型CDK核酸”定義為編碼蛋白質(zhì)的核酸/基因，其具有(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；和(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)可以容易的確定以上(i)到(iii)中定義的基序和結(jié)構(gòu)域。激酶分析可以如Cockcroft等人，2000(Nature，405(6786)，575-579)的描述實施。該分析包括在液氮中研磨植物材料，在合適的緩沖液(例如1ml的50mM的Tris-HClpH7.5，75mM NaCl，15mM EGTA，15mM MgCl2，1mM二硫蘇糖醇，0.1％Tween 20，1X完全Tm蛋白酶抑制劑，1mM NaF，0.2mM NaV，2mM焦磷酸鈉，60mM β-甘油磷酸)中重懸。然后將懸浮液勻漿四次，每次30秒，勻漿之間在冰上放置30秒。接著，上清液與20μl蛋白A瓊脂糖凝膠(50％懸浮)在4℃孵育30分鐘。該上清液與1μl抗血清(針對CDC2b蛋白的羧基端多肽，如Setiady等人，1996(PlantCell Physiology 37(3)，369-376)在冰上孵育2小時，然后加入20μl蛋白A瓊脂糖凝膠，樣品在4℃旋轉(zhuǎn)1小時。樣品用激酶緩沖液(50mMTris-HCl pH7.5，100mM NaCl，5mM EGTA，1mM DTT)洗滌2次，在15μl分析緩沖液(50mM Tris-HCl pH7.5，100mM NaCl，5mMEGTA，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM NaF，0.2mM釩酸鈉，2mM焦磷酸鈉，25mM β-甘油磷酸，0.5mM組蛋白H1作為底物，0.5mM PMSF，和74kBq[γ32P ATP(>185TBq mmol-1)每15μl反應(yīng)物)中重懸，并在室溫下孵育30分鐘。該反應(yīng)通過加入凝膠載樣緩沖液停止，可以使用SDS-PAGE分析樣品，使用磷光影像分析儀(Molecular Dynamics)定量。
本文中定義的術(shù)語“B型CDK氨基酸”是任何氨基酸序列，當其用于構(gòu)建例如


圖1所描述的CDK系統(tǒng)發(fā)生樹時，傾向于聚簇在B型CDK周圍而非其他CDK群周圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用產(chǎn)生這種系統(tǒng)發(fā)生樹的已知技術(shù)和軟件，例如GCG、EBI或CLUSTAL包，使用默認值，能夠容易的確定任何討論的氨基酸序列是否符合“B型CDK氨基酸”的定義。構(gòu)建這種系統(tǒng)發(fā)生樹后，聚簇在B型CDK群中的序列將被認為符合“B型CDK”的定義，并將用于進行本發(fā)明的方法。另外或或者，本文中定義的術(shù)語“B型CDK氨基酸”包括(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235)。
下表1顯示代表性的沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的B型CDK和PPTALRE基序。
表1
B型CDK核酸/基因可分離或衍生自任何植物或藻類或真菌來源。該核酸可以基本上由其在組成和/或有意的人工操作中的基因組環(huán)境中的天然形式修飾得到。B型CDK核酸可分離自單子葉或雙子葉種，優(yōu)選來自十字花科(Brassicaceae)，進一步優(yōu)選來自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)。該核酸優(yōu)選是1類B型CDK，例如選自
圖1種顯示的1類CDK實例的1類B型CDK，也就是，來自鼠耳芥的CDK B1；1、來自鼠耳芥的CDK B1；2、來自番茄(Lycopersiconesculentum)(番茄)的CDK B1；1、來自金魚草(Antirrhinum majus)的CDK B1；1、來自紫苜蓿(Medicago sativa)(紫苜蓿)的CDK B1；1和來自杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)的CDK B1，進一步優(yōu)選1類B型CDK是來自鼠耳芥的CDK B1；1和來自鼠耳芥的CDK B1；2?；蛘?，該核酸優(yōu)選是2類B型CDK，例如選自
圖1中顯示的例子的2類B型CDK，也就是，來自鼠耳芥的CDK B2；1、來自鼠耳芥的CDK B2；2、來自金魚草的CDK B2；1、來自Mesembryanthemum crassifolium的CDK B2；1、來自紫苜蓿的CDK B2；1、來自番茄的CDK B2；1和來自稻(Oryza sativa)的CDK B1，2類B型CDK進一步優(yōu)選是來自鼠耳芥的CDK B2；2。
最優(yōu)選的CDK B1；1核酸是SEQ ID NO1代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B1；1蛋白是SEQ ID NO2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最優(yōu)選的CDK B1；2核酸是SEQ ID NO3代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B1；2蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最優(yōu)選的CDK B2；2核酸是SEQ ID NO5代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B2；2蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。每個CDK B1；1、CDK B1；2和CDK B2；2核酸/蛋白也包括本文后面描述的核酸和氨基酸變體。
雖然本發(fā)明由分別根據(jù)SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5所代表的B型CDK，及根據(jù)SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ IDNO6的對應(yīng)氨基酸例證，但是對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，根據(jù)本發(fā)明的方法明顯可以使用核酸變體和氨基酸變體進行，例如本文后面定義的那些。因此，從廣義來說術(shù)語“B型CDK”蛋白/核酸也包括適合進行根據(jù)本發(fā)明的方法的核酸變體和氨基酸變體。適合進行根據(jù)本發(fā)明的方法的核酸變體和氨基酸變體包括符合“B型CDK”定義的那些，這意味著在例如
圖1所描述的CDK系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)構(gòu)上，目的變異序列傾向于聚簇在B型CDK周圍和/或變體編碼(在變異核酸的情況下)，或是蛋白質(zhì)(在變異氨基酸的情況下)其包括(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(PlantCell 9(2)，223-235)。
進行根據(jù)本發(fā)明的方法中有用的合適變體核酸和氨基酸序列包括
(i)B型CDK核酸/基因的功能部分；
(ii)能夠與B型CDK核酸/基因雜交的序列；
(iii)B型CDK核酸/基因的可變剪接變體；
(iv)B型CDK核酸/基因的等位基因變體；
(v)B型CDK蛋白的同源物、衍生物或活性片段；
(vi)突變B型CDK。
變體B型核酸/基因的例子是B型核酸/基因的功能部分。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，DNA序列全長不是進行根據(jù)本發(fā)明的方法的必要條件是顯而易見的。根據(jù)本發(fā)明的方法可使用B型CDK的功能部分方便的進行。功能部分是指來自或制備自原始(大)B型CDK DNA分子的一段DNA，當該DNA部分導(dǎo)入植物并表達時，其產(chǎn)生具有改變的生長特性的植物，該部分編碼的蛋白質(zhì)包含i)沒有錯配，或具有在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(PlantCell 9(2)，223-235)。該部分可以包含許多基因，具有或不具有其他的調(diào)節(jié)元件或可能含有間隔序列。該部分可以通過在例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5中任意一個核酸序列中進行一個或多個缺失，和/或截短來制備。在核酸中導(dǎo)入截短和缺失的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。
另外B型CDK核酸變體的例子是能夠與B型CDK雜交的序列。方便的，根據(jù)本發(fā)明的方法也可以使用能夠與B型CDK雜交的序列進行，所述B型CDK特別是SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5中任意一個代表的B型CDK，該雜交的序列是符合“B型CDK”定義的那些序列，即在例如
圖1所描述的CDK系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)構(gòu)上，雜交序列傾向于聚簇在B型CDK周圍而非其他CDK群周圍，和/或雜交序列編碼的蛋白質(zhì)包括(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
本文中定義的術(shù)語“雜交”是基本同源互補核苷酸序列相互退火的過程。該雜交過程能夠完全發(fā)生在溶液中，即互補核酸均在溶液中。依賴這個過程的分子生物學(xué)方法包括聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR；和基于此的所有方法)、遞減雜交(subtractive hybridisation)、隨機引物延伸、核酸酶S1作圖、引物延伸、反轉(zhuǎn)錄、cDNA合成、RNA差異顯示和DNA序列測定。該雜交過程也能夠發(fā)生在互補核酸序列之一固定在基質(zhì)上，例如磁珠、瓊脂糖凝膠珠或其他任何樹脂。依賴這個過程的分子生物學(xué)方法包括poly(A+)mRNA的分離。此外，該雜交過程也能夠發(fā)生在互補核酸序列之一固定在固體支持物上，例如硝化纖維素或尼龍膜或通過例如光版印刷術(shù)固定至硅酸玻璃支持物(后者稱為核酸陣列或微陣列或核酸芯片)。依賴這個過程的分子生物學(xué)方法包括RNA和DNA凝膠印跡分析、集落雜交、噬斑雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了使雜交發(fā)生，一般核酸分子熱或化學(xué)變性以將雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從核酸單鏈上移去發(fā)夾結(jié)構(gòu)其他二級結(jié)構(gòu)。雜交的嚴緊性由例如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成等條件影響。雜交的高嚴緊性條件包括高溫和/或低鹽濃度(包括NaCl和檸檬酸鈉的鹽)，和/或雜交緩沖液中甲酰胺的包含，和/或降低雜交緩沖液中例如SDS(去污劑)的化合物的濃度，和/或從雜交緩沖液中排除例如葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇(促進分子的群集)的化合物。常規(guī)的雜交條件描述如下，例如Sambrook(2001)分子克隆實驗手冊(Molecular Cloningalaboratory manual)第三版，冷泉港實驗室出版，CSH，紐約，但是技術(shù)人員可以理解，基于已知的或期望的核酸序列的同源性和/或長度能夠設(shè)計大量不同的雜交條件。特別優(yōu)選(至少第一種情況)足夠低嚴緊性的雜交條件來分離本發(fā)明以上定義的DNA序列的異源核酸。低嚴緊性條件的例子是4-6XSSC/0.1-0.5％ w/v SDS，在37-45℃下進行2-3小時?；陔s交中核酸的來源和濃度，可以使用不同條件的嚴緊性，例如中度嚴緊條件。中度嚴緊條件的例子包括1-4XSSC/0.25％ w/vSDS，在大于等于45℃下進行2-3小時。高度嚴緊條件的例子包括0.1-1XSSC/0.1％ w/v SDS，在60℃下進行1-3小時。技術(shù)人員將意識到在雜交和洗滌中可以改變各種參數(shù)，并且這些參數(shù)可以保持或改變嚴緊條件。開始時嚴緊條件可是是低的，逐漸升高到提供雜交的如上定義的B型CDK核酸。導(dǎo)致異源性的元素包括等位性、遺傳密碼的簡并性和優(yōu)先密碼子使用的差別。
變體B型CDK的另一實例是B型CDK的可變剪接變體。根據(jù)本發(fā)明的方法也可使用B型CDK核酸/基因的可變剪接變體實施。本文使用的術(shù)語“可變剪接變體”包括核酸的變體，所述核酸中選擇的內(nèi)含子和/或外顯子已被切除、替換或增加。這種剪接變體可在自然界中找到，或使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)人工制造?？捎糜诟鶕?jù)本發(fā)明的方法的剪接變體是“B型CDK”，即在例如
圖1所描述的CDK系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)構(gòu)上，目的剪接變體傾向于聚簇在B型CDK周圍而非其他CDK群周圍，和/或剪接變體編碼的蛋白質(zhì)包括(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235)。優(yōu)選地，所述剪接變體是SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5中任意一個所代表的序列的剪接變體。
B型CDK變體的另一個例子是等位基因變體。方便的，根據(jù)本發(fā)明的方法也可以使用B型CDK核酸的等位基因變體進行，優(yōu)選使用SEQID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO5中任意一個所代表的序列的等位基因變體。等位基因變體存在于自然界中，根據(jù)本發(fā)明的方法的等位基因變體是使用那些根據(jù)本發(fā)明的方法分離的天然等位基因?？捎糜诟鶕?jù)本發(fā)明的方法的等位基因變體是“B型CDK”，即在例如
圖1所描述的CDK系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)構(gòu)上，目的等位基因變體傾向于聚簇在B型CDK周圍而非其他CDK群周圍，和/或等位基因變體編碼的蛋白質(zhì)包括(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
變體B型氨基酸的例子包括B型CDK蛋白的同源物、衍生物或活性片段。方便的，根據(jù)本發(fā)明的方法也可以使用B型CDK的同源物、衍生物或活性片段進行，優(yōu)選使用編碼SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6中任意一個代表的B型CDK的同源物、衍生物或活性片段的核酸。
B型CDK蛋白的“同源物”包括相對于被討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸替代、缺失和/或插入，并與衍生其的未修飾蛋白質(zhì)具有類似生物和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。為了產(chǎn)生這種同源物，蛋白質(zhì)中的氨基酸可以被其他具有相似性質(zhì)(例如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或打斷α-螺旋或β-折疊結(jié)構(gòu)的傾向)的氨基酸取代。保守替換表在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(例如見Creighton(1984)蛋白質(zhì)(Proteins)W.H.Freeman and Company)。可用于根據(jù)本發(fā)明的方法的同源物優(yōu)選是B型CDK，即在例如
圖1所描述的CDK系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)構(gòu)上，任何目的同源物將傾向于聚簇在B型CDK周圍而非其他CDK群周圍。這種B型CDK不斷增加的優(yōu)選與鼠耳芥CDK B1；1(SEQ ID NO2)具有至少60％或65％或70％或75％或80％或85％或90％或95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列相同性或相似性，并且同源物包含(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
多肽是否具有和鼠耳芥CDK B1；1至少60％的同一性可以容易的通過序列比對確定。序列比較的比對方法在本領(lǐng)域中是已知的，例如包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch 1970(J.Mol.Biol.48(3)，443-453)的算法來發(fā)現(xiàn)兩個完全序列的對比，其最大化配對的數(shù)目，最小化缺口(gap)的數(shù)目。BLAST算法則計算相同序列的百分比，并進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計分析。進行BLAST分析的軟件可通過生物技術(shù)信息國家中心(NationalCentre for Biotechnology Information)公開獲得。與鼠耳芥CDK B1；1具有至少60％相同性的蛋白質(zhì)可以通過對比查詢序列和已知的B型CDK序列(例如見
圖1)容易的鑒別，使用例如，基于修飾的clustalW算法的VNTI AlignX多比對程序(InforMax，Bethesda，MD，http://www.informaxinc.com)，缺口開放處罰(penalty)的默認設(shè)置是10，一個缺口延伸0.05。
同源的兩種具體形式直向同源物(orthologs)和平行進化同源物(paralogs)，是進化的概念，用于描述基因的祖先(ancestral)關(guān)系。術(shù)語“平行進化同源物”指在同一物種的基因組的基因復(fù)制導(dǎo)致的平行進化同源基因。術(shù)語“直向同源物”是指在由于祖先關(guān)系的不同生物中的同源基因。本文中所用的術(shù)語“同源”也包括根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的蛋白質(zhì)的直向同源物和平行進化同源物。
例如單子葉植物品種中的直向同源物可通過進行稱為相互blast檢索(reciprocal blast search)容易的發(fā)現(xiàn)。這可以通過涉及將討論的序列(例如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)與任何序列數(shù)據(jù)庫blasting的第一blast進行，所述數(shù)據(jù)庫例如可公眾獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫，其可從以下地址發(fā)現(xiàn)http://www.ncbi.nlm.nih.gov。如果找到了稻中的直向同源物，討論的序列將被再次blast，例如，可在NCBI上獲得克隆自稻Nipponbare的全長為28,469的cDNA。使用標準默認值，當從核苷酸開始時，可以使用BLASTn或tBLASTX，當從蛋白質(zhì)開始時，可以使用BLASTP或TBLASTN。篩選blast的結(jié)果。然后，全長序列的篩選結(jié)果或未篩選結(jié)果，對于討論的序列來源的生物體的序列再進行blast(二次blast)。然后比較第一次和第二次blast的結(jié)果。當?shù)诙蝏last的結(jié)果成功獲得最相似的B型CDK核酸或蛋白質(zhì)時，則找到直向同源物，例如該生物體是鼠耳芥，則找到了平行進化同源物。在大家族的情況下，可以使用ClustalW，然后通過相鄰相接樹來幫助顯示聚簇。
蛋白質(zhì)的“替代變體”是氨基酸序列中至少一個殘基被移除，在它的位置上插入了不同殘基的那些蛋白質(zhì)。氨基酸替代一般是單個殘基，但是根據(jù)多肽上的功能性約束可以是聚簇的；插入一般遵守大約1至10個氨基酸殘基的規(guī)律，缺失將在大約1至20個殘基的范圍內(nèi)。氨基酸替代優(yōu)選包括保守氨基酸的替代。用于本發(fā)明的方法的替代變體將是包含以下的那些(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；和(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235))。
蛋白質(zhì)的“插入變體”是一個或多個氨基酸殘基被引入到蛋白質(zhì)中的預(yù)定位置的那些蛋白質(zhì)。插入可以包括氨基末端和/或羧基末端的融合，和序列內(nèi)插入一個或多個氨基酸。一般，氨基酸序列內(nèi)的插入將比氨基或羧基末端的融合小，遵守大約1至10個殘基的規(guī)律。蛋白質(zhì)或肽氨基或羧基末端融合的例子包括用于酵母雙雜交系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體包被蛋白、(組氨酸)6-Tag、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-tag、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag100表位、c-myc表位、FLAG-表位、lacZ、CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。用于本發(fā)明的方法的插入變體將是包含以下的那些(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
蛋白質(zhì)的“缺失變體”特征在于從蛋白質(zhì)中去除一個或多個氨基酸。蛋白質(zhì)的氨基酸變體可以使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的肽合成技術(shù)容易的得到，例如固相肽合成等，或通過重組DNA操作。產(chǎn)生蛋白質(zhì)替代、插入或缺失變體的DNA序列操作方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。例如，對于本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言，在DNA預(yù)定位置上產(chǎn)生替代突變的技術(shù)是公知的，包括M13誘變、體外T7-Gen誘變(USB，Cleveland，OH)、QuickChange Site Directed誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導(dǎo)的定點誘變或其他定點誘變方案。用于本發(fā)明的方法的缺失變體將是包含以下的那些(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
尋找和確定B型CDK同源物的方法在本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員的領(lǐng)域內(nèi)是公知的。比較用的比對序列的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。這些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch1970(J.Mol.Biol.48(3)，443-453)的算法來發(fā)現(xiàn)兩個完全序列的比對，其最大化配對的數(shù)目，最小化缺口的數(shù)目。BLAST算法則計算相同序列的百分比，并進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計分析。進行BLAST分析的軟件可通過生物技術(shù)信息國家中心公開獲得。
術(shù)語“衍生物”指相對于蛋白質(zhì)的天然產(chǎn)生形式的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO2、SEQ ID NO4和SEQ ID NO6中任意一個所代表的，可以包括自然或非自然產(chǎn)生的氨基酸殘基的替代、缺失或加入的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。B型CDK蛋白的“衍生物”包括相對于該肽天然產(chǎn)生形式的氨基酸序列，可以包括自然產(chǎn)生的氨基酸殘基的改變、糖基化、?；蚍亲匀划a(chǎn)生的氨基酸殘基的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。衍生物也可以相對于其來源的氨基酸序列，包含一個或多個非氨基酸取代基，例如，報告分子或其他配體，共價或非共價結(jié)合到氨基酸序列上，和相對于天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的非自然產(chǎn)生的氨基酸殘基，所述的報告分子或其它配體例如報告分子的結(jié)合有利于其檢測。用于本發(fā)明的方法的衍生物將是包含以下的那些(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235)。
B型CDK蛋白的“活性片段”包含(i)沒有錯配，或在從左向右數(shù)的2位和/或4位上有錯配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶結(jié)構(gòu)域；(iii)T環(huán)激活激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell9(2)，223-235)。
更方便的，根據(jù)本發(fā)明的方法也可以使用突變的植物CDK來進行，其中CDK突變體相對于對應(yīng)的野生型CDK蛋白質(zhì)具有至少是基本相似的，優(yōu)選提高的生物活性。
本發(fā)明進一步提供迄今未知的篩選方法，其用于鑒定相對于對應(yīng)的未突變的或野生型CDK具有提高的CDK活性的植物CDK。這些具有提高的CDK活性的植物來源的CDK突變體可以用于根據(jù)本發(fā)明的方法或可以發(fā)現(xiàn)在其他領(lǐng)域內(nèi)的用途。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供了相對于對應(yīng)的未突變的CDK具有基本相似的或提高的CDK活性的突變的植物CDK的方法，該方法包括以下步驟
(i)提供植物來源的CDK突變體；
(ii)鑒定ICK不反應(yīng)的突變體；
(iii)鑒定具有細胞周期蛋白結(jié)合活性的突變體；并且可選地接有，
(iv)步驟(ii)和(ii)中得到的突變體的酵母互補測試。
在植物ICK中具有基本相似的或提高的CDK活性。
如果需要，對于突變野生型CDK的新篩選方法可以由以下步驟進行。這些步驟包括
(a)提供野生型CDK的氨基酸；和
(b)在至少一個氨基酸位置上基本突變每個CDK氨基酸。
使用常規(guī)技術(shù)，可將突變導(dǎo)入CDK，例如易錯聚合酶鏈式反應(yīng)。突變可以隨機導(dǎo)入或通過定點誘變導(dǎo)入。
雖然鑒定CDK突變體的方法已經(jīng)通過CDK A型蛋白突變體證明，但是這個方法同樣很適用于鑒定其他CDK突變體。
通過根據(jù)本發(fā)明的上述篩選方法可得到的具體優(yōu)選突變體(突變體1至3)的例子列在下表A中。該突變體是A型CDK突變體；即來自稻的A；1CDK(見SEQ ID NO8)。這些突變體可以具體用于使用本文上述新方法改變植物生長特性的方法中。
或者，具有由表A中的七個氨基酸改變中的至少一個組成的突變的CDK也可以用于根據(jù)本發(fā)明的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法中的這種突變體的適宜性可以如下容易的確定通過將該突變體通過上述的新篩選方法，以確定該突變體相對于對應(yīng)的未突變的CDK，是否具有基本相似的或提高的CDK活性。
表A與細胞周期蛋白結(jié)合，但不與ICK結(jié)合的突變體
該突變體通過在合適氨基酸殘基上的改變來表示。例如，在突變體1的情況下，4位上的Y被H替代；79位的V被D替代；152位的A被T替代。突變位置從SEQ ID NO8的第一個甲硫氨酸計算。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供了改變植物生長特性的方法，其包括調(diào)節(jié)、優(yōu)選增加包含上表A中的七個氨基酸改變中的至少一個的CDK突變體的活性和/或水平。突變的氨基酸本身可以直接導(dǎo)入植物細胞或?qū)胫参锉旧?包括導(dǎo)入植物的組織、器官或任何其他部分)。
同樣感興趣的是沒有活性，但仍然能夠結(jié)合CKI的CDK，由此組成CKI陷阱(trap)。這種迄今未知的方法包括以下步驟
(i)提供CDK突變體；
(ii)鑒定ICK結(jié)合突變體；和
(iii)鑒定非細胞周期蛋白結(jié)合突變體。
步驟(i)至(iii)中的每一個均在上述方法中進行。
如有必要，該新篩選方法可以進行突變野生型CDK的步驟。這些步驟包括
(a)提供野生型CDK的氨基酸；和
(b)在至少一個氨基酸位置上基本突變每個CDK氨基酸。
使用常規(guī)技術(shù)，可將突變導(dǎo)入CDK，例如易錯聚合酶鏈式反應(yīng)(error prone PCR)。突變可以隨機導(dǎo)入或定點誘變導(dǎo)入。
通過上述篩選方法可得到的具體適宜CDK突變體列在下表B中。該突變體是A型CDK突變體，即A、來自鼠耳芥的A；1CDKl(見SEQ IDNO7和SEQ ID NO8)。
表B與ICK結(jié)合，但不與細胞周期蛋白結(jié)合的突變體
突變位置從SEQ ID NO8的第一個甲硫氨酸計算。
根據(jù)本發(fā)明的第三個實施方案，提供了分離的CDK核酸分子，其包含
(a)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ IDNO12和SEQ ID NO13中任一個代表的CDK突變體的編碼核酸；
(b)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ IDNO12和SEQ ID NO13中任一個代表的CDK突變體的同源物、衍生物或活性片段的編碼核酸，其中同源物、衍生物或活性片段包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個；
(c)能夠與上面(a)或(b)中的核酸雜交的核酸，其中該雜交序列編碼的蛋白質(zhì)包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個；
(d)遺傳密碼導(dǎo)致的上面(a)至(c)的核酸的簡并核酸；
(e)(a)至(d)的核酸的等位基因變體，該等位基因變體編碼的蛋白質(zhì)包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個；
(f)(a)至(e)的核酸的可變剪接變體，該可變剪接變體編碼的蛋白質(zhì)包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個。
根據(jù)本發(fā)明的第四個實施方案，提供了CDK突變體，包括
(a)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ IDNO12和SEQ ID NO13中任一個代表的氨基酸；和
(b)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ IDNO12和SEQ ID NO13代表的氨基酸的片段，該片段包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個。
根據(jù)本發(fā)明的第五個實施方案，提供利于導(dǎo)入和/或表達用于根據(jù)本發(fā)明的方法的核苷酸序列的遺傳構(gòu)建體和載體。因此，根據(jù)本發(fā)明的第五個實施方案，提供的遺傳構(gòu)建體包含
(i)B型CDK基因/核酸；或
(ii)編碼CDK突變體的核酸，該CDK突變體包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個；
(iii)能夠驅(qū)動(i)或(ii)的核酸表達的一個或多個控制序列；和任選
(iv)轉(zhuǎn)錄終止序列。
用于根據(jù)本發(fā)明的方法的構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員公知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建。該基因構(gòu)建體可以插入適合轉(zhuǎn)化進植物并適合在轉(zhuǎn)化的細胞內(nèi)表達目的基因的載體，該載體可以商業(yè)購得。
編碼CDK突變體的核酸可以是上文中描述的任何編碼突變體的核酸。
B型CDK基因/核酸可以分離自單子葉或雙子葉物種，優(yōu)選分離自十字花科，進一步優(yōu)選自鼠耳芥。該核酸優(yōu)選是1類B型CDK，例如選自
圖1中顯示的1類CDK的實例的1類B型CDK，也就是，來自鼠耳芥的CDK B1；1、來自鼠耳芥的CDK B1；2、來自番茄(番茄)的CDK B1；1、來自金魚草的CDK B1；1、來自紫苜蓿(紫苜蓿)的CDK B1；1和來自杜氏藻的CDK B1。進一步優(yōu)選1類B型CDK是來自鼠耳芥的CDK B1；1和來自鼠耳芥的CDK B1；2?；蛘?，該核酸優(yōu)選是2類B型CDK，例如選自
圖1中顯示的例子的2類B型CDK，也就是，來自鼠耳芥的CDK B2；1、來自鼠耳芥的CDK B2；2、來自金魚草的CDK B2；1、來自Mesembryanthemum crassifolium的CDK B2；1、來自紫苜蓿的CDK B2；1、來自番茄的CDK B2；1和來自稻(Oryza sativa)的CDK B1。2類B型CDK進一步優(yōu)選是來自鼠耳芥的CDK B2；2。
最優(yōu)選的CDK B1；1核酸如SEQ ID NO1所代表或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B1；1蛋白是SEQ ID NO2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最優(yōu)選的CDK B1；2核酸是SEQ ID NO3代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B1；2蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最優(yōu)選的CDK B2；2核酸是SEQ ID NO5代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B2；2蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。每個CDK B1；1、CDK B1；2和CDK B2；2核酸/蛋白也包括上文中描述的核酸和氨基酸變體。
然后用構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化植物，所述的構(gòu)建體或載體含有目的序列(即編碼B型CDK蛋白的B型CDK核酸或編碼CDK突變體的核酸)，該序列可操作性的和一個或多個控制序列(至少一個啟動子)連接。
術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”、“控制序列”和“啟動子”在本文中均可以互換使用，并指能夠影響它們連接的序列表達的調(diào)節(jié)核酸序列。前述術(shù)語包括來自典型真核基因組的基因(包括精確啟始轉(zhuǎn)錄的TATA盒，有或沒有CCAAT盒序列)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，和響應(yīng)發(fā)育和/或外在刺激、或以組織特異的方式改變基因表達的其他調(diào)節(jié)元件(即，上游激活序列、增強子和沉默子)。該術(shù)語也包括來自典型原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，其中它可以包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其給予、激活或增強核酸在細胞、組織或器官中的表達。術(shù)語“控制序列”、“調(diào)節(jié)序列”、“調(diào)節(jié)元件”和“啟動子”在本文中可以互換使用。本文使用的術(shù)語“可操作性連接”指在啟動子序列和目的序列之間的功能性連接，這樣啟動子序列能夠起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。
方便的，B型CDK核酸可以可操作性的和任何啟動子連接。在CDKB1；1的情況下，表達優(yōu)選由未成熟的膨脹的(expanding)組織中有活性的啟動子的驅(qū)動，例如未成熟的葉子、花、莖和根。本文定義的這種“未成熟的膨脹組織優(yōu)選的啟動子”指主要在未成熟的膨脹組織內(nèi)表達的啟動子，但沒必要一定在這種組織內(nèi)。該“未成熟的膨脹組織優(yōu)選的啟動子”優(yōu)選是來自稻的β-蘋果青霉素EXPB8啟動子。其他合適的啟動子包括任何蘋果青霉素啟動子，pLEAFY等。優(yōu)選地，在CDKBl；2和CDK B2；2的情況下，表達以組成型方式驅(qū)動，最優(yōu)選地，其中的組成型啟動子是GOS2啟動子。組成型啟動子在生長和發(fā)育的大多數(shù)(但不必全部)時期均有轉(zhuǎn)錄活性。組成型植物啟動子的例子如下表C所示。下表C所示的啟動子可有利的用于進行根據(jù)本發(fā)明的方法。
表C組成型啟動子的例子
誘導(dǎo)型驅(qū)動子具有響應(yīng)發(fā)育、化學(xué)、環(huán)境或物理刺激的誘導(dǎo)的或增加的轉(zhuǎn)錄起始。例如當植物暴露于各種應(yīng)激條件時，應(yīng)激誘導(dǎo)型驅(qū)動子被激活。在如下所示的表D中給出適于實施根據(jù)本發(fā)明的方法的應(yīng)激誘導(dǎo)型驅(qū)動子。該驅(qū)動子也可用于實施本發(fā)明的方法，因為在應(yīng)激下誘導(dǎo)的改變的生長(例如增加的生長)也可有許多優(yōu)點。
表D應(yīng)激誘導(dǎo)的啟動子的實例
表C和表D中所列的啟動子僅為舉例的目的，本發(fā)明并不限于本文所列舉的這些。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠容易的提供可用于執(zhí)行本發(fā)明的其他啟動子。所列啟動子也可以被修飾，以提供所需的特殊表達。
任意的，一個或多個終止子序列也可以用于導(dǎo)入植物的構(gòu)建體中。術(shù)語“終止子”包括是轉(zhuǎn)錄單元末端的DNA序列的控制序列，其發(fā)出3’加工和初轉(zhuǎn)錄物的聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄的終止的信號。其他的調(diào)節(jié)元件包括轉(zhuǎn)錄增強子和翻譯增強子。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將意識到終止子序列和增強子序列可以適合用于執(zhí)行本發(fā)明。這種序列可以是已知的或本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易獲得的。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可以進一步包含復(fù)制起點序列，其在特定細胞類型的保持和/或復(fù)制中是需要的。一個例子是作為附加型遺傳元件(即質(zhì)粒分子或粘粒分子)在細菌細胞中保持所需要的遺傳構(gòu)建體。優(yōu)選的復(fù)制起點包括，但不限于f1-ori和colE1。
該遺傳構(gòu)建體可任選包括可選擇的標記基因。本文中所用的術(shù)語“可選擇的標記基因”包括賦予細胞表型的任何基因，在該細胞中所述可選擇的標記基因表達，利于鑒別和/或選擇轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的細胞。合適的標記可以選自賦予抗生素抗性或除草劑抗性的標記。含有重組DNA的細胞由此能夠在殺死未轉(zhuǎn)化細胞的抗生素或除草劑濃度存在下存活。可選擇的標記基因的例子包括提供抗除草劑Basta的bar基因；給予抗生素卡那霉素抗性的npt基因；給予潮霉素抗性的hpt基因。可視標記，例如綠色熒光蛋白(GFP，Haseloff等人，1997(Proc Natl Acad Sci USA.94(6)，2122-2127))，β-葡糖醛酸酶(GUS)或螢光素酶，也可以用作選擇標記。合適的選擇標記基因的例子包括氨芐青霉素抗性(Ampr)、四環(huán)素抗性基因(Tcr)、細菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、草銨膦(phosphinothricin)抗性基因、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptll)、潮霉素抗性基因和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因等。
本發(fā)明也包括可根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的植物。因此，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的植物，該植物具有選自一個或多個增加產(chǎn)量、提高生長速度和改變的結(jié)構(gòu)的改良植物生長特性，和該植物具有提高的B型CDK的表達和/或活性和/或水平。
本發(fā)明也提供具有選自一個或多個增加產(chǎn)量、提高生長速度和改變的結(jié)構(gòu)的改良植物生長特性的植物，該植物具有提高的B型CDK的表達和/或活性和/或水平。
根據(jù)本發(fā)明的第六個實施方案，提供了生產(chǎn)具有選自一個或多個增加產(chǎn)量、提高生長速度和改變的結(jié)構(gòu)的改良植物生長特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括在植物中導(dǎo)入和表達本發(fā)明的核酸分子。
更具體的，本發(fā)明提供生產(chǎn)具有改變的生長特性的植物的方法，該方法包括
(i)在植物或植物細胞中導(dǎo)入或表達B型CDK基因/核酸；或
(ii)編碼CDK突變體的核酸，該CDK突變體包含表A中顯示的七個氨基酸位置改變中的至少一個；
(iii)在促進植物再生和成熟植物生長的條件下培養(yǎng)植物細胞。
該核酸分子本身可以直接導(dǎo)入植物細胞或?qū)胫参锉旧?包括導(dǎo)入植物的組織、器官或任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，該核酸優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入植物。
該編碼CDK突變體的核酸可以是上文中描述的任何突變體的編碼核酸。
該B型CDK基因/核酸優(yōu)選是1類B型CDK，例如選自
圖1種顯示的1類CDK例子的1類B型CDK，也就是，來自鼠耳芥的CDK B1；1、來自鼠耳芥的CDK B1；2、來自番茄(番茄)的CDK B1；1、來自金魚草的CDK B1；1、來自紫苜蓿(紫苜蓿)的CDK B1；1和來自杜氏藻的CDK B1。進一步優(yōu)選1類B型CDK是來自鼠耳芥的CDK B1；1或來自鼠耳芥的CDK B1；2?；蛘?，該核酸優(yōu)選是2類B型CDK，例如選自
圖1中顯示的例子的2類B型CDK，也就是，來自鼠耳芥的CDK B2；1、來自鼠耳芥的CDK B2；2、來自金魚草的CDK B2；1、來自Mesembryanthemum crassifolium的CDK B2；1、來自紫苜蓿的CDK B2；1、來自番茄的CDK B2；1和來自稻(Oryza sativa)的CDK B1。2類B型CDK進一步優(yōu)選是來自鼠耳芥的CDK B2；2。
最優(yōu)選的CDK B1；1核酸是SEQ ID NO1代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B1；1蛋白是SEQ ID NO2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最優(yōu)選的CDK B1；2核酸是SEQ ID NO3代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B1；2蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最優(yōu)選的CDK B2；2核酸是SEQ ID NO5代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B2；2蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。每個CDK B1；1、CDK B1；2和CDK B2；2核酸/蛋白也包括上文中描述的核酸和氨基酸變體。
本文中的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包括將外源多核苷酸轉(zhuǎn)入宿主細胞中，與轉(zhuǎn)化所用方法無關(guān)。隨后能夠無性繁殖的植物組織，無論是器官發(fā)生或胚胎發(fā)生，可以被本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并且由此再生整個植物。選擇的具體組織根據(jù)被轉(zhuǎn)化的具體物種的可用的無性繁殖系統(tǒng)和最適合性而不同。代表性的組織目標包括葉盤(leaf disk)、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、愈傷組織、存在的分生組織(即，頂端分生組織、腋芽和根分生組織)，和誘導(dǎo)分生組織(即，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。該多核苷酸可以是瞬時的或穩(wěn)定的導(dǎo)入宿主細胞，并可以非整合保持，例如，作為質(zhì)粒?；蛘?，其可整合入宿主基因組。然后，得到的轉(zhuǎn)化植物細胞可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方式再生轉(zhuǎn)化植物。
植物品種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在是相當常規(guī)的技術(shù)。有利的，任何幾個轉(zhuǎn)化方法可用于在合適的祖細胞中導(dǎo)入目的基因。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔法、增加自由DNA攝取的化學(xué)制品、直接向植物中注射DNA、粒子槍轟擊、使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化和微注射。方法可選自原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇法(Krens，F(xiàn).A.等人，1982，Nature 296，72-74；Negrutiu等人，1987年6月，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R.D.等人，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；植物材料的微注射(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；用病毒(非整合性)感染的包被DNA或RNA的顆粒的轟擊(Klein T.M.等人，1987，Nature 327，70)等。表達B型CDK基因的轉(zhuǎn)基因稻植物優(yōu)選通過使用任何公知的稻轉(zhuǎn)化方法的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，所述公知的稻轉(zhuǎn)化方法例如如下描述的任何一種公開的歐洲專利申請EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6(2)271-282，1994)，其公開的內(nèi)容在此全部引為參考。在玉米轉(zhuǎn)化的情況下，優(yōu)選的方法是Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996年6月；14(6)745-50)或Frame等人(Plant Physiol.2002年5月；129(1)13-22)中描述的，其公開的內(nèi)容在此全部引為參考。
一般轉(zhuǎn)化后，選擇一個或多個由和目的基因共轉(zhuǎn)化的植物可表達基因編碼的標記存在的植物細胞或細胞群，接著，轉(zhuǎn)化的材料再生為整個植物。
DNA轉(zhuǎn)化和再生后，測定假設(shè)轉(zhuǎn)化了的植物中目的基因的存在、復(fù)制數(shù)和/或基因組組構(gòu)，例如使用Southern分析。或者或另外，新導(dǎo)入的DNA的表達水平可以使用Northern和/或Western分析監(jiān)控，這兩個技術(shù)均是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過各種方法繁殖，例如通過無性繁殖或傳統(tǒng)的繁殖技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可以自交產(chǎn)生純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，通過傳統(tǒng)的繁殖技術(shù)T2植物進一步繁殖。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以有多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細胞和非轉(zhuǎn)化細胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(即，所有的轉(zhuǎn)化細胞均含有表達盒)；轉(zhuǎn)化的和非轉(zhuǎn)化的組織的嫁接體(即，轉(zhuǎn)化的根莖嫁接到未轉(zhuǎn)化的幼芽上)。
本發(fā)明無疑可擴展到通過本文描述的任何方法產(chǎn)生的任何植物細胞或植物上，并且可擴展到所有植物部分和其繁殖體上。本發(fā)明進一步擴展到包含由任何一種前述方法產(chǎn)生的初級轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞、組織、器官或完整植物的后代，唯一的前提是后代顯示的遺傳型和/或表型特征與采用根據(jù)本發(fā)明的方法在父代中產(chǎn)生的這些特征相同。本發(fā)明也包括含有編碼能夠調(diào)節(jié)B-型CDK蛋白的蛋白的分離核酸分子的宿主細胞，優(yōu)選其中的蛋白是B-型CDK蛋白。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細胞是植物細胞。本發(fā)明也擴展到植物的可收獲部分，例如但不限于種子、葉子、果實、花、莖培養(yǎng)物、根莖、塊莖和鱗莖。
本文中的術(shù)語“植物”包括完整植物、植物的原種(ancestor)和后代和植物部分，包括種子、芽、莖、根(包括塊莖)和植物細胞，組織和器官。術(shù)語“植物”所以也包括懸浮培養(yǎng)物、胚胎、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、配子體、孢子體、花粉和小孢子。在本發(fā)明的方法中特別有用的植物包括藻類、蕨類和所有屬于綠色植物總科(superfamily)的植物，尤其是單子葉和雙子葉植物，包括飼料或草料的豆類、觀賞植物、糧食作物、樹、或灌木，其選自秋葵屬(Abelmoschus spp.)、槭屬(Acer spp.)、獼猴桃屬(Actinidiaspp.)、冰草屬(Agropyron spp.)、蔥屬(Allium spp.)、莧屬(Amaranthus spp.)、鳳梨(Ananas comosus)、番荔枝屬(Annonaspp.)、旱芹(Apium garaveolens)、鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)、落花生屬(Arachis spp.)、波羅蜜屬(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麥(Avena sativa)、陽桃(Averrhoacarambola)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、蕓苔屬(Braaaica spp.)、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒屬(Capsicum spp.)、番木瓜(Carica Papaya)、大花假虎刺(Carissa mccrocarpa)、紅花(Carthamus tinctorius)、山核桃屬(Carya spp.)、栗屬(Castanea spp.)、菊苣(Cichorium endivia)、樟屬(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘屬(Citrusspp.)、椰子屬(Cocos spp.)、咖啡屬(Coffea Spp.)、可樂果屬(Cola spp.)、芋(Colocasia esculenta)、榛屬(Corylus spp)、山楂屬(Crataegus spp.)、甜瓜屬(Cucumis spp.)、南瓜屬(Cucurbitaspp.)、菜薊屬(Cynara spp.)、野胡蘿卜(Daucus carota)、山螞蝗屬(desmodium spp.)、龍眼(Dimocarpus longan)、薯蕷屬(Dioscorea spp.)、柿樹屬(Diospyros spp.)、稗屬(Echinochloaspp.)、
(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotrya japonica)、紅果仔(Eugenia uniflora)、蕎麥屬(Fagopyrum spp.)、水青岡屬(Fagus spp.)、無花果(Ficus carica)、金橘屬(Fortunellaspp.)、草莓屬(Fragaria spp.)、銀杏(Ginkgo biloba)、大豆屬(Glycine spp.)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵屬(Helianthus spp.)、木槿屬(Hibiscus spp.)、大麥屬(Hordeumspp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、胡桃屬(Iuglans spp.)、萵苣(Lactuca sativa)、山黧豆屬(Lathyrus spp.)、浮萍屬(Lemnaspp.)、兵豆(Lens culinaris)、亞麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脈根屬(Lotus.Spp.)、棱角絲瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆屬(Lupinus spp.)、硬皮豆屬(Macrotyloma spp.)、西印度櫻桃(Malpighia emarginata)、蘋果屬(Malus spp.)、滿美果(Mammea americana)、芒果(MangiferaIndica)、木薯屬(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨屬(Melilotus spp.)、薄荷屬(Mentha spp.)、苦瓜屬(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉屬(Musa spp.)、煙草屬(Nicotiana spp.)、樨欖屬(Olea spp.)、仙人掌屬(Opuntia spp.)、烏足豆屬(Ornithopus spp.)、稻屬(Oryzaspp.)、黍糜(Panicum miliaceum)、Passiflora edulis歐防風(fēng)(Pastinaca sativa)、鱷梨屬(Persea spp.)、皺葉歐芹(Petroselinum crispum)、菜豆屬(Phaseolus spp.)、刺葵屬(Phoenix spp.)、酸漿屬(Physalis spp.)、松屬(Pinus spp.)、阿月渾子(Pistacia vera)、豌豆屬(Pisum spp.)、早熟禾屬(Poaspp.)、楊屬(Populus spp.)、牧豆樹屬(prosopis spp.)、李屬(Prunus spp.)、番石榴屬(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬(Quercus spp.)、蘿卜(Raphanussativus)、大黃(Rheum rhabarbarum)、茶藨子屬(Ribes spp.)、懸鉤子屬(Rubus spp.)、甘蔗屬(Saccharum spp.)、接骨木屬(Sambucus spp.)、黑麥(Secale cereale)、胡麻屬(Sesamum spp.)、茄屬(Solanum spp.)、高粱(Sorghum bicolor)、菠菜屬(Spinaciaspp.)、蒲桃屬(Syzygium spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可(Theobroma CaCao)、車軸草屬(Trifolium spp.)、triticosecalerimpaui、小麥屬(Triticum spp.)、越桔屬(Vaccinium spp.)、野豌豆屬(Vicia spp.)、豇豆屬(Vigna spp.)、葡萄屬(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、野生稻(Zizania palustris)、棗屬(Ziziphusspp.)及其它。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，植物是作物植物，例如大豆、向日葵、油菜、紫苜蓿、油菜籽或棉花。進一步優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的植物是單子葉植物，例如甘蔗。最優(yōu)選的，植物是谷類，例如稻、玉米、小麥、高粱、粟和大麥。
有利的，實施根據(jù)本發(fā)明的方法得到具有各種改變的生長特性的植物，該改變的生長特性包括增加產(chǎn)量、提高生長速度和改變的結(jié)構(gòu)，都相對于相應(yīng)的野生植物而言。
本文中定義的術(shù)語“增加產(chǎn)量”包括植物的一部分或幾部分的生物量(重量)的增加，尤其是地上(可收獲)部分，增加根的生物量或增加其他任何可收獲部分的生物量，相對于相應(yīng)的野生植物的相應(yīng)部分。該術(shù)語也包括種子產(chǎn)量的增加，種子產(chǎn)量包括種子生物量(種子重量)的增加，并可以是每株植物的種子重量或單個種子的增加，和/或(飽滿)種子數(shù)量的增加和/或種子大小的增加和/或種子體積的增加，都相對于相應(yīng)的野生植物而言。種子大小和/或種子體積的增加也可能影響種子的成分。種子產(chǎn)量的增加可歸于花的數(shù)量和/或大小的增加。產(chǎn)量的增加也可能增加收獲系數(shù)，收獲系數(shù)以總生物量與可收獲部分例如種子的產(chǎn)量比表示。產(chǎn)量的增加也可能增加千粒重(TKW)，從該數(shù)量的飽滿種子總重量推算出千粒重。TKW的增加可能由于種子大小和/或種子重量的增加。
以谷物為例，可由以下一個或多個原因說明產(chǎn)量增加每公頃或畝植物數(shù)量的增加，每株植物穗量的增加，排數(shù)量的增加，每排谷粒數(shù)量，谷粒重量，千粒重，穗長度/直徑等等。以稻為例，可由以下一個或多個方面的增加說明產(chǎn)量增加每公頃或畝植物數(shù)量，每株植物圓錐花序的數(shù)量，每個圓錐花序的小穗數(shù)量，每個圓錐花序的花數(shù)量，種子飽滿率的增加，千粒重的增加等等。產(chǎn)量的增加也可能導(dǎo)致改變的結(jié)構(gòu)，或可能由于改變結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，實施根據(jù)本發(fā)明的方法得到具有改變的產(chǎn)量的植物。優(yōu)選的，改變的產(chǎn)量至少包括以下特征之一相對于對比植物，面積的增加，圓錐花序數(shù)量的增加，高度的增加，種子數(shù)量的增加，飽滿種子數(shù)量的增加，種子總重量的增加，千粒重(TKW)的增加和收獲系數(shù)的增加。所以，根據(jù)本發(fā)明，提供一種提高植物產(chǎn)量的方法，該方法包括調(diào)節(jié)B型CDK在植物中的表達和/或調(diào)節(jié)B型CDK蛋白在植物中的活性和/或水平。
由于根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物提高了產(chǎn)量，顯然，這些植物表現(xiàn)出生長速度提高(至少在生命周期的部分時段)，相對于相應(yīng)的野生植物。提高生長速度可能是植物的一部分或多部分(包括種子)，或整個植物特異的。生長速度提高的植物甚至可能出現(xiàn)提前開花。生長速度的提高可能出現(xiàn)在植物的生命周期的一個或多個階段，或出現(xiàn)在整個植物生命周期。在植物生命周期的早期提高生長速度表現(xiàn)為強化了的生命力。生長速度的增加可能改變植物的收獲時間，使植物比未增加生長速度時的可能收獲時間提前收獲。如果充分提高生長速度，可以允許再次播種相同植物品種(例如緊隨稻植物的播種和收獲之后，再一次播種和收獲稻植物，都在一個常規(guī)生長期)或不同植物品種(例如緊隨稻的播種和收獲之后，再一次播種和任選地收獲大豆、土豆或其他合適的植物)，因此增加每年每畝生物量產(chǎn)量(由于任何特定植物生長和收獲次數(shù)的增加(例如在1年里))。生長速度的提高也可允許在比對應(yīng)的野生植物生長區(qū)域更廣闊的區(qū)域培育轉(zhuǎn)基因植物，由于地域限制，種植谷物通常由在種植(早季)或者在收獲(晚季)時的不利環(huán)境條件決定。如果收獲周期縮短，該不利環(huán)境條件可以避免。從生長實驗獲得的生長曲線上獲得的各種參數(shù)可以確定較快的生長速度，該參數(shù)可以是T-Mid(植物達到最大大小的50％時所用的時間)和T-90(植物達到最大大小的90％時所用的時間)。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，實施根據(jù)本發(fā)明的方法得到具有改變的生長速度的植物。所以，根據(jù)本發(fā)明，提供提高植物生長速度的方法，該方法包括調(diào)節(jié)B型CDK在植物中的表達和/或調(diào)節(jié)B型CDK蛋白在植物中的活性和/或水平。在實例中，轉(zhuǎn)基因植物達到成熟所用的時間比對比植物降低，表明了生長速度的增加。
產(chǎn)量的增加也包括在無應(yīng)激條件下以及在應(yīng)激條件下植物與野生植物相比更好的性能。一般植物響應(yīng)暴露于壓力而生長得更慢。然而，因為根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)量和增加的生長速度，很明顯，在壓力條件下，轉(zhuǎn)基因植物也將比對應(yīng)的同樣暴露于相同壓力條件下的野生植物生長得更快。該壓力條件一般是每天植物可以接觸的生物和/或非生物(環(huán)境)壓力。典型的非生物或環(huán)境壓力包括由反常的熱或冷/冷凍溫度導(dǎo)致的溫度壓力；鹽壓力；水壓力(干旱或過多的水)。非生物壓力也可以由化學(xué)制品產(chǎn)生。生物壓力一般是病原體，例如細菌、病毒、真菌和昆蟲導(dǎo)致的壓力。
本文定義的術(shù)語“改變的結(jié)構(gòu)”包括葉子、芽、莖、分蘗、花序(對于單子葉和雙子葉植物)、圓錐花序、花粉、胚珠、種子、胚、胚乳、種皮和糊粉的任何一個或多個的表現(xiàn)上的任何變化。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選特征，實施根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有改變的結(jié)構(gòu)的植物。該改變結(jié)構(gòu)通過至少以下一種表現(xiàn)地上面積的增加、圓錐花序數(shù)量的增加和高度的增加。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了改變植物結(jié)構(gòu)的方法，其包括調(diào)節(jié)B型CDK核酸/基因在植物中的表達，和/或調(diào)節(jié)B型CDK蛋白在植物中的活性和/或水平。
根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有如上文所述的改變的生長特性的植物。這些有利的生長特性可以結(jié)合其他商業(yè)上有利的特性，例如進一步增加產(chǎn)量的特性、對各種壓力的抗性、改變各種結(jié)構(gòu)特征的特性和/或生化和/或生理特征。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，提供B型CDK的用途。例如，B型CDK可用于繁殖過程。該核酸序列或其部分可以在染色體上，包含至少編碼B型CDK蛋白的核酸序列，并優(yōu)選包含一個或多個相關(guān)家族成員。這種繁殖過程的一個例子中，鑒別了DNA標記，該DNA標記可以遺傳性的連接到能夠調(diào)節(jié)植物中編碼B型CDK蛋白的核酸的表達的基因上，該基因可以是編碼B型CDK蛋白本身的基因，或任何其他能夠直接或間接影響B(tài)型CDK基因的表達和/或B型CDK蛋白的活性和/或水平的基因。然后，該DNA標記可用于篩選具有改變的生長特性的植物的繁殖過程中。
B型CDK的等位基因變體可用于特定的傳統(tǒng)繁殖過程，例如標記輔助的繁殖。這種繁殖過程有時需要在植物中通過植物的誘變處理導(dǎo)入等位基因變異。一個合適的誘變方法是EMS誘變。然后，通過例如PCR鑒定等位基因變體。然后進行篩選步驟，篩選目的序列的較好的等位基因變體，該較好的等位基因變體產(chǎn)生改變的植物生長特性。一般通過監(jiān)控含有目的序列的不同等位基因變體的植物的生長表現(xiàn)來進行篩選，例如，SEQ ID NO1的不同等位基因變體。生長表現(xiàn)的監(jiān)控能夠在溫室或田野中進行。另外任選的步驟包括植物(其中通過鑒定較好的等位基因變體)與另一種植物雜交。這可以例如用于產(chǎn)生目的表型特征的組合。等位基因變體也包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)，和小插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常是小于100bp。SNP和INDEL在大多數(shù)生物體自然產(chǎn)生的多態(tài)株中形成大量的序列變異體。
本發(fā)明也涉及B型CDK核酸和/或基因，和B型CDK蛋白在改變植物生長特性中的用途，優(yōu)選在改變一種或多種以下特征中的用途增加植物的面積、增加第一圓錐花序的數(shù)量、增加植物的高度、增加種子的數(shù)量、增加飽滿種子的數(shù)量、增加種子的總重量、增加生長速度、增加收獲系數(shù)和增加千粒重(TKW)。
該B型CDK核酸可分離自單子葉或雙子葉物種，優(yōu)選來自十字花科，進一步優(yōu)選來自鼠耳芥。該核酸優(yōu)選是1類B型CDK，例如選自
圖1種顯示的1類CDK例子的1類B型CDK，也就是，來自鼠耳芥的CDK B1；1、來自鼠耳芥的CDK B1；2、來自番茄(番茄)的CDK B1；1、來自金魚草的CDK B1；1、來自紫苜蓿(紫苜蓿)的CDK B1；1和來自杜氏藻的CDK B1。進一步優(yōu)選的1類B型CDK是來自鼠耳芥的CDKB1；1和來自鼠耳芥的CDK B1；2?；蛘?，該核酸優(yōu)選是2類B型CDK，例如選自
圖1中顯示的例子的2類B型CDK，也就是，來自鼠耳芥的CDK B2；1、來自鼠耳芥的CDK B2；2、來自金魚草的CDK B2；1、來自Mesembryanthemum crassifolium的CDK B2；1、來自紫苜蓿的CDKB2；1、來自番茄的CDK B2；1和來自稻的CDK B1。2類B型CDK進一步優(yōu)選是來自鼠耳芥的CDK B2；2。
最優(yōu)選的CDK B1；1核酸是SEQ ID NO1代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B1；1蛋白是SEQ ID NO2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最優(yōu)選的CDK B1；2核酸是SEQ ID NO3代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B1；2蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。最優(yōu)選的CDK B2；2核酸是SEQ ID NO5代表的序列或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B2；2蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。每個CDK B1；1、CDK B1；2和CDK B2；2核酸/蛋白也包括本文描述的核酸和氨基酸變體。
本發(fā)明也涉及B型CDK核酸/基因和/或B型CDK蛋白作為生長調(diào)節(jié)物的用途。上文描述的B型CDK核酸序列和上文描述的B型CDK氨基酸序列可明顯用于改變植物的生長特性。因此，發(fā)現(xiàn)該序列可用于作為生長調(diào)節(jié)物或生長刺激物。本發(fā)明也提供含有如上文描述的B型CDK蛋白的組合物，作為生長調(diào)節(jié)物。
相反，根據(jù)本發(fā)明的序列也可以是農(nóng)用化學(xué)品化合物的目的靶標。因此，本發(fā)明包括上述B型CDK核酸作為農(nóng)用化學(xué)品化合物(例如除草劑)靶標的用途。
附圖描述
現(xiàn)在本發(fā)明將根據(jù)以下附圖進行描述，其中
圖1是顯示各種植物的CDK的關(guān)系的進化樹。
圖2是
圖1的進化樹中CDK A分支的放大圖。
圖3是鼠耳芥CDKB1；1基因在公認的(putative)β-蘋果青霉素啟動子，EXPB8(SEQ ID NO14)控制下，在稻中表達的雙載體(binaryvector)圖。
圖4是鼠耳芥CDKB1；2基因在GOS2啟動子(SEQ ID NO15)控制下，在稻中表達的雙載體(binary vector)圖。
圖50是鼠耳芥CDKB2；2基因在GOS2啟動子(SEQ ID NO15)控制下，在稻中表達的雙載體(binary vector)圖。
圖6詳細例示了用于實施根據(jù)本發(fā)明的方法的序列。
圖7是一些代表性CDK B型序列的CLUSTAL W(1.82)多序列比對。黑體是B型CDK中發(fā)現(xiàn)的基序；下劃線是催化激酶結(jié)構(gòu)域，斜體表示T環(huán)激酶結(jié)構(gòu)域(Magyar等人，1997(Plant Cell 9(2)，223-235))。
實施例
現(xiàn)在參考以下實施例詳細描述本發(fā)明，所述實施例僅為說明目的。
DNA操作除非另有說明，重組DNA技術(shù)按照(Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual(分子克隆實驗室手冊)，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港實驗室出版)，CSH，New York)中描述的或Ausubel等人(1994)編著的CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols第一卷和第二卷描述的標準方案進行。BIOS科學(xué)出版公司(英國)和Blackwell科學(xué)出版社(英國)出版，R.D.D.Croy編著的Plant MolecularBiology Labfase(1993)描述了植物分子工作的標準材料和方法。
實施例1基因克隆-CDK B1；1
用鼠耳芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板通過PCR擴增鼠耳芥屬CDKB1；1。從幼苗中提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄后，cDNA被克隆到pCMV Sport 6.0中。該庫的平均插入大小為1.5kb，克隆的初始數(shù)目為1.59×107cfu。初始滴度確定為9.6×105cfu/ml，第一次擴增后為6×1011cfu/ml。提取質(zhì)粒后，200ng模板用于50μ1 PCR昆合物中。包括用于Gateway重組的AttB位點的引物prm0350(有義，啟始密碼是黑體，AttB1位點是斜體5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGAGAAGTACGAGAAGCTAGA3’)和prm0351(反義，互補，終止密碼是黑體，AttB2位點是斜體5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGAACTGAGACTTGTCAAAGG3’)被用于PCR擴增。在標準條件下，使用Hifi Taq DNA聚合酶進行PCR。采用標準方法擴增并純化930bp的PCR片段。然后執(zhí)行Gateway程序的第一步，BP反應(yīng)，其間，將PCR片段與pDONR201質(zhì)粒體內(nèi)重組，來生產(chǎn)按照Gateway術(shù)語學(xué)的“進入克隆(entry clone)”，p0438。作為Gateway技術(shù)的一部分，pDONR201購自Invitrogen。
實施例2載體構(gòu)建-CDK B1；1
隨后進入克隆p0438被用在與用于稻轉(zhuǎn)化的目標載體p3169的LR反應(yīng)。該載體在T-DNA邊緣內(nèi)含有功能元件植物可選擇性標記、植物可篩選性植物標記，和用于LR在體內(nèi)與已經(jīng)克隆到進入克隆里的目的序列重組的Gateway盒。將公認在未成熟膨脹組織中用于表達的β-蘋果青霉素啟動子定位在該Gateway盒的上游。
LR重組步驟后，如圖3中所示的得到的表達載體(CDK B1；1β-蘋果青霉素-過表達)被轉(zhuǎn)化進入農(nóng)桿菌，并隨后轉(zhuǎn)化進入稻植物。使轉(zhuǎn)化后的稻植物生長，并隨后如實施例7所述檢驗其各種參數(shù)。
實施例3基因克隆-CDK B1；2
用鼠耳芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板通過PCR擴增鼠耳芥屬CDKB1；2。從幼苗中提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄后，cDNAs被克隆到pCMV Sport 6.0中。該庫的平均插入大小為1.5kb，克隆的初始數(shù)目為1.59×107cfu。初始滴度確定為9.6×105cfu/ml，第一次擴增后為6×1011cfu/ml。提取質(zhì)粒后，200ng模板用于50μl PCR混合物中。包括Gateway重組的AttB位點的引物prm439(有義，啟始密碼是黑體，AttB1位點是使斜體5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGAGAAATACGAGAAGCTC 3’)和prm440(反義，互補，終止密碼是黑體，AttB2位點是斜體5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGTCAGAACTGAGATTTGTC 3’)被用于PCR擴增。在標準條件下，使用Hifi Taq DNA聚合酶進行PCR。采用標準方法擴增并純化936bp的PCR片段。然后執(zhí)行Gateway程序的第一步BP反應(yīng)，其間，將PCR片段與p DONR201質(zhì)粒體內(nèi)重組，來生產(chǎn)按照Gateway術(shù)語學(xué)的“進入克隆”，即p538。作為Gateway技術(shù)的一部分，質(zhì)粒pDONR201購自Invitrogen。
實施例4載體構(gòu)建-CDK B1；2
隨后進入克隆p538被用在與用于稻轉(zhuǎn)化的目標載體p640的LR反應(yīng)中。該載體在T-DNA邊緣包含功能元件植物可選擇性標記、植物可篩選性標記，和用于LR在體內(nèi)與已經(jīng)克隆到進入克隆里的目的序列重組的Gateway盒。用于上調(diào)的GOS2啟動子定位在該Gateway盒的上游。
LR重組后，如圖4中所示的得到的表達載體(CDK B1；2GOS2-過表達)被轉(zhuǎn)化進入農(nóng)桿菌，并隨后轉(zhuǎn)化進入稻植物。允許轉(zhuǎn)化后的稻植物生長，并隨后如實施例7所述檢驗其各種參數(shù)。
實施例5基因克隆-CDK B2；2
用鼠耳芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板通過PCR擴增鼠耳芥屬CDKB2；2。從幼苗中提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄后，cDNA被克隆到pCMV Sport 6.0中。該庫的平均插入大小為1.5kb，克隆的初始數(shù)目為1.59×107cfu。初始滴度確定為9.6×105cfu/ml，第一次擴增后為6×1011cfu/ml。提取質(zhì)粒后，200ng模板用于50μl PCR混合物中。包括Gateway重組的AttB位點的引物prm2213(有義，啟始密碼是黑體，AttB1位點是斜體5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGGACAACAATGGAGTTAA 3’)和prm2214(反義，互補，終止密碼是黑體，AttB2位點是斜體5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGAGAGAGGACTTGTCAG 3’)被用于PCR擴增。在標準條件下，使用Hifi Taq DNA聚合酶實施PCR。采用標準方法擴增并純化948bp的PCR片段。然后執(zhí)行Gateway程序的第一步BP反應(yīng)，其間，將PCR片段與pDGNR201質(zhì)粒體內(nèi)重組，來生產(chǎn)按照Gateway術(shù)語學(xué)的“進入克隆”，即p2660。作為Gateway技術(shù)的一部分，質(zhì)粒pDONR201購自Invitrogen。
實施例6載體構(gòu)建-CDK B2；2
隨后進入克隆p2660被用在與用于稻轉(zhuǎn)化的目標載體p640的LR反應(yīng)。該載體在T-DNA邊緣包含功能元件植物可選擇性標記、植物可篩選性標記，和用于LR在體內(nèi)與已經(jīng)克隆到進入克隆里的目的序列重組的Gateway盒。用于過表達的pGOS2啟動子定位在該Gateway盒的上游。
LR重組后，如圖5所示的得到的表達載體(CDK B2；2GOS2-過表達)被轉(zhuǎn)化進入農(nóng)桿菌，并隨后轉(zhuǎn)化進入稻植物。允許轉(zhuǎn)化后的稻植物生長，并隨后如實施例7所述檢驗其各種參數(shù)。
實施例7評價和結(jié)果
大致產(chǎn)生了15到20個獨立的T0稻轉(zhuǎn)化體。將最初的轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)到用于培育和收獲T1種子的溫室。保留5個事件，其中T1的后代轉(zhuǎn)基因有/無比為3∶1。對這些事件中的每個事件，大致10個T1幼苗含有轉(zhuǎn)基因(雜合子和純合子)，并且大致10個T1幼苗缺少轉(zhuǎn)基因(零合子(nullizygote))，這是通過監(jiān)測可視標記的表達來選擇的。
統(tǒng)計分析t-檢驗和F-檢驗
采用雙因素ANOVA(變量分析)統(tǒng)計模型全面評價植物表型特征。對目的基因轉(zhuǎn)化后的所有事件的所有植物的所有被測量參數(shù)實施F-檢驗。實施F-檢驗檢測所有轉(zhuǎn)化事件對基因的影響，并測定對基因的全面影響或“全局基因影響”。F-檢驗值確定的顯著數(shù)據(jù)指示“基因”影響，意味著觀察到的表型不僅僅是由基因的存在或位置決定。在F-檢驗情況下，全局基因影響的顯著性閥值設(shè)定在5％的概率水平。
為了在一個事件內(nèi)檢測基因影響，例如line-specific影響，在每個事件內(nèi)執(zhí)行t-檢驗，使用來自轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)零合植物(nullplant)的數(shù)據(jù)?！傲愫现参铩被颉傲愫戏蛛x子”是按照處理轉(zhuǎn)基因植物相同的方法處理的植物，但轉(zhuǎn)基因從中分離出來。也可將零合植物描述為純合陰性轉(zhuǎn)化子。t-檢驗的顯著性閥值設(shè)定在10％概率的水平。在一群轉(zhuǎn)化事件內(nèi)，一些事件可以低于或高于該t-檢驗閥值。這是基于一個假設(shè)，即基因只可能對基因組的某些位置有作用，并且依賴該位置的影響不是經(jīng)常出現(xiàn)。也可以將這類基因影響指為“基因線性作用”。比較t-值和t-分布或者比較F-值和F-分布，獲得P值。P值代表零假設(shè)(零假設(shè)是指“沒有轉(zhuǎn)基因影響”)正確的概率。
7.1植物生長測量
將所選的T1植物(大約有10個帶有轉(zhuǎn)基因，大約有10個不帶轉(zhuǎn)基因)轉(zhuǎn)到溫室。每株植物接受一個獨一無二的條形碼標記，清晰地將表型數(shù)據(jù)與相應(yīng)植物聯(lián)系。所選的T1植物培育在直徑為10cm的盆里的土壤里，環(huán)境條件設(shè)定如下光照時間＝11.5小時，日光強度＝30,000lux或更強，日間溫度＝28℃或更高，夜間溫度＝22℃，相對濕度＝60-70％。轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的零合子在隨機位置相伴生長。從播種期到成熟期，將每株植物數(shù)次經(jīng)過數(shù)字成像室并成像。每次至少從6個不同角度拍攝數(shù)字圖像(2048×1536像素，16百萬彩色)。采用圖像分析軟件，從所有植物的所有數(shù)字圖像中以自動化方式獲取以下所述參數(shù)。
結(jié)果如下表所示，每行對應(yīng)一個事件。給出了陽性植物和陰性植物的數(shù)量差異(dif)以及這些植物之間百分比差(％dif)。P-值代表對每個植物株實施t-檢驗的概率。最后一行表示所有事件的平均數(shù)。在該行里，P-值是F-檢驗的P-值。
(a)地上植物面積
通過計算區(qū)別于背景的植物地上部分的總像素數(shù)量確定植物地上面積。該值是在同一時間點從不同角度拍攝的照片的平均值，并通過校準轉(zhuǎn)化成以平方毫米表示的實體面積值。實驗顯示，該法測量的植物地上面積與植物地上部分的生物量相關(guān)。
表2 T1地上植物面積-CDKB1；1
如表1所示，第3株顯示轉(zhuǎn)基因植物的地上面積相對于對照植物有顯著增長，t-檢驗的p-值為0.0011。第2株和第4株顯示地上植物面積與對照植物相比也出現(xiàn)增長?？梢钥闯鲛D(zhuǎn)基因植物的地上面積相對于對照植物有10％的總體增長。
表3T1地上植物面積-CDKB1；2
如表2所示，第11株和12株顯示地上植物面積顯著增長，t-檢驗的p-值分別為0.0002和0.0573。由F-檢驗的p值為0.0178可見，總體基因影響也明顯。可以看出轉(zhuǎn)基因植物的地上面積相對于對照植物有11％的總體增長。第11株的T2代(見下表4)也證實，相對于相應(yīng)的零合子有30％增長，并且t-檢驗的p值為0.0002。
表4T2植物地上面積-CDKB1；2
(b)植物高度
植物的高度由越過上部盆邊緣的水平線和與植物地上部分相應(yīng)的最高像素之間的距離確定。該值是在同一時間點從不同角度拍攝的照片的平均值，并通過校準轉(zhuǎn)化成以毫米表示的實體距離。實驗顯示，該法測量的植物高度與用刻度尺手工測量的植物高度相關(guān)。
表5T1高度-CDK B1；1
結(jié)果在表5中顯示。如表所示，第3株顯示植物高度相對于對應(yīng)的對照植物(t-檢驗p值為0.0045)有明顯增長。
表6T1高度-CDK B1；2
表7T2高度-CDK B1；2
表6顯示第11株和12株T1代高度增長。如表7所示，第11株顯示T2代植物的高度相對于對照植物顯著增長，并且t-檢驗的p值為0.019。
7.2與種子相關(guān)的參數(shù)測量
將成熟的初級圓錐花序(primary panicles)收獲，裝袋，打條形碼標記，然后在37℃的烘箱中干燥3天。然后將圓錐花序脫粒，并將所有的種子收集起來并計數(shù)。使用鼓風(fēng)機將飽滿種粒(husk)與空的分離。將空殼丟棄，余下部分再次計數(shù)。在分析天平上稱量飽滿種粒。該過程產(chǎn)生一組以下描述的與種子相關(guān)的參數(shù)。
(c)每株植物的種子總數(shù)
通過計數(shù)從植物中收獲的種粒(husk)數(shù)量測量該參數(shù)。
表8T1總種子數(shù)-CDK B1；1
結(jié)果顯示在上表8中。如表所示，第3株顯示轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子總數(shù)量相對于對照植物產(chǎn)生的種子總數(shù)量有顯著增長(t-檢驗的p值為0.0002)。
表9T2總種子數(shù)-CDK B1；2
如表9顯示，第11株顯示轉(zhuǎn)基因植物的種子總數(shù)相對于對照植物的種子總數(shù)顯著增長(t-檢驗的p值為0.0047)。
(d)飽滿種子數(shù)量
通過計數(shù)分離后余下的飽滿種粒(husk)數(shù)量確定飽滿種子的數(shù)量。
表10T1飽滿種子數(shù)量-CDK B1；1
結(jié)果顯示在上表10中。如表所示，第3株顯示飽滿種子數(shù)量相對于對照植物的飽滿種子數(shù)量有顯著增長(t-檢驗的p值為0.0072)。
表11T1飽滿種子數(shù)量-CDKB1；2
表12T2飽滿種子數(shù)量-CDK B1；2
如表11所示，第11株顯示飽滿種子數(shù)量相對于對照植物的飽滿種子數(shù)量有顯著增長，t-檢驗的p值為0.0091。觀察到轉(zhuǎn)基因植物的飽滿種子數(shù)量與對應(yīng)對照植物的飽滿種子數(shù)量總體差異為14％。T2代結(jié)果顯示在表12中，第11株表現(xiàn)特別好。
(e)每株植物的總種子產(chǎn)量
通過稱量每株植物上收獲的所有飽滿谷粒(husk)確定總種子產(chǎn)量。
表13T1種子總重量-CDK B1；1
結(jié)果顯示在上表13中。如表所示，第3株顯示轉(zhuǎn)基因植物種子總重量相對于相應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因植物的種子總重量有顯著增長(t-檢驗的p值為0.005)。觀察到轉(zhuǎn)基因植物的種子總重量相對于對照植物的種子總重量有16％的總體增長。
表14T1種子總重量-CDK B1；2
如表14所示，第11株顯示轉(zhuǎn)基因植物種子總重量相對于對照植物的種子總重量有顯著增長，t-檢驗的p值為0.0139。T2代結(jié)果顯示在下表15中，第11株表現(xiàn)尤其好。
表15T2種子總重量-CDK B1；2
(f)植物收獲指數(shù)
本發(fā)明中收獲指數(shù)定義為總種子產(chǎn)量和地上面積(mm2)的比乘以系數(shù)106。
表16T1收獲指數(shù)-CDK B1；1
結(jié)果顯示在上表16中。如表所示，笫3株顯示轉(zhuǎn)基因植物的收獲指數(shù)相對于對照植物的收獲指數(shù)增長(t-檢驗的p值為0.0201)。
(g)千粒重
千粒重(TKW)從計數(shù)的飽滿種子數(shù)量和它們的總重量推算該參數(shù)。
表18T1千粒重(TKW)-CDK B1；2
表19T2千粒重(TKW)-CDK B1；2
T1代結(jié)果顯示在表18中。表19列出了T2代的結(jié)果。如表所示，第11株顯示轉(zhuǎn)基因植物的TKW相對于對照植物的TKW有顯著增長，t-檢驗的p值為0.0347。
(h)周期時間-CDK B2；2
將每周植物面積測量模式化，來獲得每株植物的生長曲線。繪制植物面積(mm2)隨時間(天)變化曲線，并從獲得的生長曲線計算以下參數(shù)。
表20T1增長速度-CDK B2；2
結(jié)果顯示在上表13中。如表所示，第21株和27株顯示轉(zhuǎn)基因植物的生長速度相對于對照植物的生長速度有顯著增長，兩種情況下觀察到的增長值為4天。
實施例8轉(zhuǎn)基因谷物表達B-型CDK
在未成熟膨脹組織優(yōu)選的或組成型啟動子的控制下將B型CDK克隆入適合于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的谷物轉(zhuǎn)化的植物轉(zhuǎn)化載體。從以下所述的任意資料中選擇谷物轉(zhuǎn)化的載體和方法EP0604662，EP0672752，EP0971578，EP0955371，EP0558676，Ishida等人(Nat.Biotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)；和Frame等人(Plant Physiol.2002 May；129(1)13-22)。
用這些方法制備的轉(zhuǎn)基因植物在溫室中培育用于T1種子生產(chǎn)。通過定量的實時PCR和Southern blot分析檢測轉(zhuǎn)基因的遺傳性和拷貝數(shù)量。通過反向PCR和Northern分析測定轉(zhuǎn)基因的表達水平。選擇帶有轉(zhuǎn)基因單拷貝插入和具有不同轉(zhuǎn)基因表達水平的轉(zhuǎn)基因株，用于T2種子生產(chǎn)。
在適于玉米的條件下(168光照期，26-28℃日間溫度和22-24℃夜間溫度)以及缺水、缺氮和NaCl過量的條件下，使后代種子在溫室中發(fā)芽、生長。在自交的情況下，來自同一親本株中的零合分離子以及同一栽培種的野生植物被用作對照。對自交或雜交產(chǎn)生的后代植物進行不同生物量和生長參數(shù)評價，包括植物高度，莖厚度、葉子數(shù)量、總地上面積、葉子綠色、成熟時間、開花時間、穗數(shù)量、收獲時間。也對這些株的種子進行各種參數(shù)的變化評價，例如谷粒大小、每株植物總谷粒產(chǎn)量和谷粒品質(zhì)(淀粉含量、蛋白含量和脂肪含量)。
選擇與相應(yīng)對照株相比提高最顯著的株用于進一步田間實驗和標記輔助繁殖，目標是將田間有效的轉(zhuǎn)基因性狀轉(zhuǎn)入商用種質(zhì)中。采用建立完善的方案進行對玉米生長和與產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)的田間測試。類似地，也采用建立完善的方案進行從一個種質(zhì)到另一個種質(zhì)的特異基因座漸滲(例如包含轉(zhuǎn)基因的基因座)。
實施例9B-型CDK突變體的鑒定
按照以下標準程序?qū)嵤┧蟹肿由飳W(xué)實驗。使用大腸桿菌(Escherishia coli)DB3.1菌株(F-，gyrA462，endA-，Δ(srl-recA)，mcrB，mrr，hsdS20(rB-，mB-)，supE44，ara14，galK2，lacY1，proA2，rpsL20(Smr)，xy15，λ-，leu，mtll)擴增Gateway目標載體。使用E。coli DH5-α菌株(F-，phi80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)，U169，deoR，recA1，hadR17(rk-，mk+)，gal-，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96m，relA1)擴增其他構(gòu)建體。
9.0使用的菌株和培養(yǎng)基
啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)CDK突變體菌株USl02(MATa；leu2-3；ura3；trp1-1；his3-11；ade2-1；can1-100；cdc28-1N)用于互補研究。將酵母細胞培養(yǎng)在豐富培養(yǎng)基中(YPG-gal；酵母提取物0.5％w/v；蛋白胨0.5％v/w；半乳糖1％w/v；棉子糖1％w/v；瓊脂2％w/v)或合成培養(yǎng)基中(YNB無氨基酸酵母氮源(Difco BectonDickinson，Sparks，Madison，USA)0.7％ w/v；瓊脂2％ w/v)，補充適當?shù)奶呛统渥愕陌被崛コ旌衔?amino-acid drop-out mixture)(Clontech，Palo-Alto，California，USA)中培養(yǎng)。準備感受態(tài)酵母細胞，并將其用于轉(zhuǎn)化，該轉(zhuǎn)化使用Frozen-EZ YeastTransformation II試劑盒(ZymoResearch，Orange，California，USA)，按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)進行。
9.1雙雜交載體的構(gòu)建
用Sam I將pAD-Gal4.2.1和pBD-gal4-cam(Stratagene，La，Jolla，California，USA)切開，去磷酸化，連接到Gateway盒C(LifeTechnologies，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)并導(dǎo)入大腸桿菌DB3.1。檢查該盒的方向。得到的載體pGW-AD和pGW-BD含有分別和GAL4 AD或BD結(jié)構(gòu)域融合的gateway盒的AttR1位點，這樣，通過使用Gateway程序(Life Technologies，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)，允許編碼序列符合讀框地插入GAL4 AD或BD結(jié)構(gòu)域。
使用包含AttB位點的引物(Cdc2-1-AttB1GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGG CTTCACAATGGAGCAGTACGAGAAGGAGGAG，cdc2-1-AttB2GGGGACCACTTT GTACAAGAAAGCTGGGTCCCCTGTCATTGTACCATCTCAAG)擴增稻cdc2-1(CDK A；1)細胞周期蛋白依賴性激酶全長cDNA(登錄號X60374，還參見SEQ ID NO 7和8)。采用Gateway BP程序?qū)CR產(chǎn)物導(dǎo)入pDONR201(Life Technologies，Invitrogen Ltd，Paisley，UK)。使用得到的進入克隆pDONR-cdc2-1，通過gateway LR反應(yīng)將cdc2編碼序列轉(zhuǎn)入pGW-AD和pGW-BD載體。得到的質(zhì)粒pAD-cdc2-1和pBD-cdc2-1包含融合GAL4 AD或BD結(jié)構(gòu)域的稻CDK A；1編碼序列。
按照配對雙雜交程序使用PJ69-4A(MATa，ura3-52，his3-200，ade2Δ，trp-1901，leu2-3112，gal4Δ，gal80Δ，LYS2GALlHIS3，ade2GAL2-ADE2，met2GAL7-lacZ.James等人，1996)和PJ69-4α(MATα，ura3-52，his3-200，ade2Δ，trp-1901，leu2-3112，gal4Δ，gal80Δ，LYS2GAL-1HIS3，ade2GAL2-ADE2，met2GAL7-lacZ.Uetz等人，2000)進行蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用的研究。
9.2隨機誘變
使用易錯PCR(error-prone PCR)產(chǎn)生隨機突變的CDK A；1編碼序列。將30ng pAD-cdc2-1質(zhì)粒加到PCR混合物中(dATP 0.2mM，dGTP0.2mM，dCTP 1mM，dTTP 1mM，緩沖液1X，MnCl2 0.5mM，正向引物(AGGGATGTTTAATACCACTAC)1mM，反向引物(GCACAGTTGAAGTGAACTTGC)1mM，Taq聚合酶1U)。將反應(yīng)混合物在94℃下變性5分鐘，30個循環(huán)的94℃下變性1分鐘，40℃下退火1分鐘，72℃下延伸2分鐘，最后72℃下延伸5分鐘。該程序?qū)脲e誤率為每1千個堿基對中2-3個堿基的替代(Miyazaki和Arnold(1999)。J Mol Evol 49716-720；Shafikhani等人(1997)，BioTechniques23304-310)。通過缺口修復(fù)克隆(Fusco等人(1999)Yeast 15715-720)直接將PCR片段克隆入由EcoR I和Sal I消化的線性化的pAD載體，將包含pBD-OsICK2或pBD-OsICK4質(zhì)粒的酵母菌株MaV203(Life technology)用作受體。采用反向雙雜交方法篩選CDK A；1。將酵母菌株置于包含0.2％(w/v)5-氟-乳清酸的-Leu-Trp的選擇性培養(yǎng)基上，并在28℃下培育。能夠在該培養(yǎng)基中存活的酵母克隆是不能與ICK2或ICK4相互作用的CDK A；1突變體。
9.3雙雜交配對程序
用具有目的編碼序列的pAD或pBD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株P(guān)J69-4A(MAT-a)和PJ69-4α(MAT-α)。將單個菌株分別以帶狀或平行或垂直置入-Leu或-Trp選擇性培養(yǎng)基上，并在28℃下生長1-2天。按照帶形成網(wǎng)格、AD和BD菌株在帶的交點混合的方式，將酵母菌株轉(zhuǎn)到非選擇性YPG培養(yǎng)基上。將酵母在28℃下培育8小時，以使MAT-a和MAT-α菌株之間的配對出現(xiàn)。隨后將網(wǎng)格轉(zhuǎn)到-Leu-Trp-His-Ade選擇性培養(yǎng)基上，并在28℃下培育2天。能夠在該培養(yǎng)基上生長的酵母是含有表達相互作用蛋白質(zhì)的AD和BD質(zhì)粒的MAT-a/α二倍體酵母(James等人，(1996)Genetics 1441425-1436.Uetz等人(2000)Nature 403623-627)。
9.4酵母表達載體的構(gòu)建和突變體互補
用Apa I和Sal I將酵母半乳糖誘導(dǎo)性表達載體pESC-Trp(Stratagene)切開，連接到來自pBSK-GWA的Apa I和Sal I片段上，該片段含有克隆在pBlueScript的EcoR V位點上的Gateway盒A。將產(chǎn)生的載體pE-GW導(dǎo)入E.coli DB3.1，含有的gateway盒AttR1位點直接在GAL1啟動子的下游。通過gateway LR反應(yīng)，將目的編碼序列轉(zhuǎn)入來自pDONR進入克隆的pE-GW載體。
酵母菌株US102(Loy CJ等人(1999)Mol Cell Biol.193312-3327)在CDK cdc28中突變，并且不能在37℃下生長，但能夠在24℃下生長。在37℃下，使包含用于表達目的基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因酵母菌株在含有半乳糖的培養(yǎng)基中生長。表達能拯救cdc28突變的基因的酵母菌株是那些能夠在該限制溫度下生長的酵母菌株。
結(jié)果
9.5篩選
使用易錯PCR和所述的在MaV203株中的缺口修復(fù)克隆來產(chǎn)生pAD載體中的稻CDK A；1突變體文庫。通過反向雙雜交從該庫篩選稻ICK4。大約100 000個變體被篩選出來，并獲得79個能在5-氟乳清酸中生長的克隆。通過配對雙雜交將其中的74個轉(zhuǎn)到PJ69-4A，用于進一步分析。然后將突變體編碼序列測序。觀察到的平均誘變水平是每千堿基對5.6±3.4的替代。
9.6表征
野生型稻cdc2-1能與稻ICK4和小鼠皰疹病毒細胞周期蛋白D的同源物強烈結(jié)合，與稻細胞周期蛋白D3結(jié)合不太強。研究了cdc2突變體與這3個蛋白結(jié)合的能力。也研究了它們與US102 cdc28酵母突變菌株，如野生cdc2蛋白互補的能力。
9.6.1與細胞周期蛋白結(jié)合但不與ICK結(jié)合的突變體
特別有意義的突變體是那些能與細胞周期蛋白結(jié)合、但不與ICK4結(jié)合、同時仍然保持它們與酵母突變體互補的能力的突變體。這些突變體導(dǎo)致細胞周期蛋白-CDK復(fù)合體對ICK介導(dǎo)的抑制不敏感。鑒定出的三個特別重要的突變體如下面重復(fù)的表A中所示。
表A與細胞周期蛋白結(jié)合，但不與ICK結(jié)合的突變體
突變位置從CDK A；1的第一個甲硫氨酸計算。
9.6.2與CKI結(jié)合但不與細胞周期蛋白結(jié)合的突變體
也特別令人感興趣的突變體是那些能與ICK結(jié)合、但不與細胞周期蛋白結(jié)合、并失去它們與酵母US102突變體互補的能力的突變體。這些突變體將滴定出使它們不能抑制CDK細胞周期蛋白復(fù)合體的ICK。下面的重復(fù)的表B顯示的突變體顯示該特征。
表B與CKI結(jié)合，但不與細胞周期蛋白結(jié)合的突變體
序列表
<110>CropDesign N.V.
<120>具有改變的生長特性的植物及其制備方法
<130>CD-103-PCT
<150>EP 03077811.2
<151>2003-09-05
<160>21
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>930
<212>DNA
<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)
<400>1
atggagaagt acgagaagct agagaaggtc ggagaaggaa catacgggaa agtctacaaa 60
gcgatggaga aaggaactgg taagcttgtt gctctgaaga aaactcgtct cgagatggac120
gaagaaggta ttccaccaac tgctcttcgt gagatctcgc ttctccagat gttatcaaca180
tcgatctatg ttgttcgatt actctgcgtc gaacatgttc atcaaccatc aaccaaatct240
caatctacca aatccaatct ctatctcgtt ttcgagtatc tcgatactga tcttaagaaa300
ttcatcgatt cgtataggaa aggacctaat cctaagcctc ttgagccttt tttgattcag360
aagttgatgt ttcagctttg taaaggtgtt gcgcattgtc atagtcatgg tgtgcttcac420
cgtgatctta aaccgcagaa tcttcttctg gtgaaagata aagagcttct taagattgct480
gatttgggtc ttggtcgtgc ttttactgtt cctcttaagt cttatacgca tgagattgtt540
actctttggt atagagctcc tgaagttctt cttggatcta ctcattattc aactggtgtt600
gacatgtggt ctgttggttg tatctttgct gagatggttc ggaggcaagc tcttttccct660
ggtgattctg agtttcagca attgcttcat atcttcaggt tgctaggaac accaactgag720
cagcaatggc cgggtgtttc cacactgcgt gactggcatg tttaccctaa gtgggagccg780
caagacttaa ctcttgctgt tccttctctt tcacctcaag gagttgatct tctcacgaaa840
atgctcaagt acaatccagc cgaaagaatt tcagcaaaaa cagcacttga tcacccatat900
tttgacagcc ttgacaagtc tcagttctga 930
<210>2
<211>309
<212>PRT
<213>鼠耳芥
<400>2
Met Glu Lys Tyr Glu Lys Leu Glu Lys Val Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Lys Val Tyr Lys Ala Met Glu Lys Gly Thr Gly Lys Leu Val Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Thr Arg Leu Glu Met Asp Glu Glu Gly Ile Pro Pro Thr Ala
35 40 45
Leu Arg Glu Ile Ser Leu Leu Gln Met Leu Ser Thr Ser Ile Tyr Val
50 55 60
Val Arg Leu Leu Cys Val Glu His Val His Gln Pro Ser Thr Lys Ser
65 70 75 80
Gln Ser Thr Lys Ser Asn Leu Tyr Leu Val Phe Glu Tyr Leu Asp Thr
85 90 95
Asp Leu Lys Lys Phe Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Gly Pro Asn Pro Lys
100 105 110
Pro Leu Glu Pro Phe Leu Ile Gln Lys Leu Met Phe Gln Leu Cys Lys
115 120 125
Gly Val Ala His Cys His Ser His Gly Val Leu His Arg Asp Leu Lys
130 135 140
Pro Gln Asn Leu Leu Leu Val Lys Asp Lys Glu Leu Leu Lys Ile Ala
145 150 155 160
Asp Leu Gly Leu Gly Arg Ala Phe Thr Val Pro Leu Lys Ser Tyr Thr
165 170 175
His Glu Ile Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu Leu Gly
180 185 190
Ser Thr His Tyr Ser Thr Gly Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys Ile
195 200 205
Phe Ala Glu Met Val Arg Arg Gln Ala Leu Phe Pro Gly Asp Ser Glu
210 215 220
Phe Gln Gln Leu Leu His Ile Phe Arg Leu Leu Gly Thr Pro Thr Glu
225 230 235 240
Gln Gln Trp Pro Gly Val Ser Thr Leu Arg Asp Trp His Val Tyr Pro
245 250 255
Lys Trp Glu Pro Gln Asp Leu Thr Leu Ala Val Pro Ser Leu Ser Pro
260 265 270
Gln Gly Val Asp Leu Leu Thr Lys Met Leu Lys Tyr Asn Pro Ala Glu
275 280 285
Arg Ile Ser Ala Lys Thr Ala Leu Asp His Pro Tyr Phe Asp Ser Leu
290 295 300
Asp Lys Ser Gln Phe
305
<210>3
<211>936
<212>DNA
<213>鼠耳芥
<400>3
atggagaaat acgagaagct cgaaaaggtc ggtgaaggaa cctatggaaa agtctacaaa 60
gcaatggaga aaaccaccgg aaaactcgtc gctctgaaga aaactaggct cgaaatggac120
gaagaaggta taccaccaac ggctctccgt gagatctctc ttctccaaat gctttctcaa180
tcaatctaca tcgttcgtct cctctgcgtc gaacatgtta ttcaatcgaa agattcgact240
gtttctcact ctcccaaatc caatctctat ctcgtttttg agtatctcga cactgatctc300
aagaaattta tagattctca tagaaagggc tcgaatccta gaccgctt9a ggcttctctt360
gtgcagaggt ttatgtttca gctttttaaa ggtgtggctc attgtcatag ccatggtatg420
cttcaccgtg atcttaaacc gcagaatctt ctattggata aggataaagg gattcttaag480
attgctgatt tgggtcttag tcgtgctttt actgtgcctc ttaaggctta tacacatgag540
attgttactc tttggtatag agctcctgaa gttttgcttg gttctactca ttactctact600
gctgttgata tttggtctgt tggatgcatc tttgccgaga tgattaggag gcaagctctt660
ttccctggtg attctgagtt tcagcaacta cttcatattt tcagattgtt aggaacacca720
actgagcagc aatggccggg tgtaatggca ttgcgtgact ggcatgtcta tccaaagtgg780
gagccgcaag acttatcacg tgctgttcca tctctatctc ctgaaggaat tgatcttctc840
acgcaaatgt tgaagtacaa tccagcagaa agaatttcag caaaagcagc tctcgatcat900
ccctactttg acagccttga caaatctcag ttctga 936
<210>4
<211>311
<212>PRT
<213>鼠耳芥
<400>4
Met Glu Lys Tyr Glu Lys Leu Glu Lys Val Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Lys Val Tyr Lys Ala Met Glu Lys Thr Thr Gly Lys Leu Val Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Thr Arg Leu Glu Met Asp Glu Glu Gly Ile Pro Pro Thr Ala
35 40 45
Leu Arg Glu Ile Ser Leu Leu Gln Met Leu Ser Gln Ser Ile Tyr Ile
50 55 60
Val Arg Leu Leu Cys Val Glu His Val Ile Gln Ser Lys Asp Ser Thr
65 70 75 80
Val Ser His Ser Pro Lys Ser Asn Leu Tyr Leu Val Phe Glu Tyr Leu
85 90 95
Asp Thr Asp Leu Lys Lys Phe Ile Asp Ser His Arg Lys Gly Ser Asn
100 105 110
Pro Arg Pro Leu Glu Ala Ser Leu Val Gln Arg Phe Met Phe Gln Leu
115 120 125
Phe Lys Gly Val Ala His Cys His Ser His Gly Val Leu His Arg Asp
130 135 140
Leu Lys Pro Gln Asn Leu Leu Leu Asp Lys Asp Lys Gly Ile Leu Lys
145 150 155 160
Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ser Arg Ala Phe Thr Val Pro Leu Lys Ala
165 170 175
Tyr Thr His Glu Ile Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val Leu
180 185 190
Leu Gly Ser Thr His Tyr Ser Thr Ala Val Asp Ile Trp Ser Val Gly
195 200 205
Cys Ile Phe Ala Glu Met Ile Arg Arg Gln Ala Leu Phe Pro Gly Asp
210 215 220
Ser Glu Phe Gln Gln Leu Leu His Ile Phe Arg Leu Leu Gly Thr Pro
225 230 235 240
Thr Glu Gln Gln Trp Pro Gly Val Met Ala Leu Arg Asp Trp His Val
245 250 255
Tyr Pro Lys Trp Glu Pro Gln Asp Leu Ser Arg Ala Val Pro Ser Leu
260 265 270
Ser Pro Glu Gly Ile Asp Leu Leu Thr Gln Met Leu Lys Tyr Asn Pro
275 280 285
Ala Glu Arg Ile Ser Ala Lys Ala Ala Leu Asp His Pro Tyr Phe Asp
290 295 300
Ser Leu Asp Lys Ser Gln Phe
305 310
<210>5
<211>948
<212>DNA
<213>鼠耳芥
<400>5
atggacaaca atggagttaa acccgctgtt tccgccatgg aagcctttga aaagcttgag 60
aaagtaggtg aagggactta tgggaaagtt tacagagcaa gagagaaagc tactgggatg120
atcgttgctt tgaagaagac gcgtctccat gaggatgaag aaggtgttcc tcccactact180
cttcgcgaga tctctatctt gcgtatgctc gctcgtgatc ctcacatcgt taggttgatg240
gatgttaagc aaggaataaa caaagaagga aaaactgtac tttaccttgt tttcgagtat300
gttgatactg atctcaagaa attcatcaga agctttcgtc aagctggaca gaacattcca360
caaaatactg tcaagtgctt gatgtaccag ttatgcaaag gcatggcttt ttgccatggt420
catggagtgt tgcacaggga tcttaagcct cacaatctct tgatggaccg gaagacaatg480
acgctcaaaa tagcagatct tggattagcc agagccttca ctctcccaat gaaaaagtat540
acacatgaga ttctaactct atggtataga gctccggaag ttcttcttgg agcaacccat600
tactctactg gagtggatat gtggtctgtt ggctgtattt ttgctgaact agtgaccaag660
caagcaatct ttgcgggaga ctctgagctc caacagctcc tccgtatatt caggttgttg720
ggaacaccaa acgaagaagt ttggcctgga gtaagcaaac tcaaggactg gcatgaatac780
ccgcaatgga aaccgttgag tctctccaca gctgtgccaa acctcgacga ggctggactt840
gatctcttat ctaaaatgct ggagtacgag ccagcaaaac gaatctcagc aaagaaagct900
atggagcatc cttacttcga tgatttgcct gacaagtcct ctctctga 948
<210>6
<211>315
<212>PRT
<213>鼠耳芥
<400>6
Met Asp Asn Asn Gly Val Lys Pro Ala Val Ser Ala Met Glu Ala Phe
1 5 10 15
Glu Lys Leu Glu Lys Val Gly Glu Gly Thr Tyr Gly Lys Val Tyr Arg
20 25 30
Ala Arg Glu Lys Ala Thr Gly Met Ile Val Ala Leu Lys Lys Thr Arg
35 40 45
Lau His Glu Asp Glu Glu Gly Val Pro Pro Thr Thr Leu Arg Glu Ile
50 55 60
Ser Ile Leu Arg Met Leu Ala Arg Asp Pro His Ile Val Arg Leu Met
65 70 75 80
Asp Val Lys Gln Gly Ile Asn Lys Glu Gly Lys Thr Val Leu Tyr Leu
85 90 95
Val Phe Glu Tyr Val Asp Thr Asp Leu Lys Lys Phe Ile Arg Ser Phe
100 105 110
Arg Gln Ala Gly Gln Asn Ile Pro Gln Asn Thr Val Lys Cys Leu Met
115 120 125
Tyr Gln Leu Cys Lys Gly Met Ala Phe Cys His Gly His Gly Val Leu
130 135 140
His Arg Asp Leu Lys Pro His Asn Leu Leu Met Asp Arg Lys Thr Met
145 150 155 160
Thr Leu Lys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Arg Ala Phe Thr Leu Pro
165 170 175
Met Lys Lys Tyr Thr His Glu Ile Leu Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro
180 185 190
Glu Val Leu Leu Gly Ala Thr His Tyr Ser Thr Gly Val Asp Met Trp
195 200 205
Ser Val Gly Cys Ile Phe Ala Glu Leu Val Thr Lys Gln Ala Ile Phe
210 215 220
Ala Gly Asp Ser Glu Leu Gln Gln Leu Leu Arg Ile Phe Arg Leu Leu
225 230 235 240
Gly Thr Pro Asn Glu Glu Val Trp Pro Gly Val Ser Lys Leu Lys Asp
245 250 255
Trp His Glu Tyr Pro Gln Trp Lys Pro Leu Ser Leu Ser Thr Ala Val
260 265 270
Pro Asn Leu Asp Glu Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Glu
275 280 285
Tyr Glu Pro Ala Lys Arg Ile Ser Ala Lys Lys Ala Met Glu His Pro
290 295 300
Tyr Phe Asp Asp Leu Pro Asp Lys Ser Ser Leu
305 310 315
<210>7
<211>1115
<212>DNA
<213>稻(Oryza sativa)
<400>7
acctctcctc cgattaatcc cctcccctcc tcttcctccc acttctgcgc ctgctcttcc 60
tcccctcgcc gaccctacct actcgcgccg ccgccgtcgc attgggcggc aaacggaggg120
ggggttaacc ctgatggagc agtacgagaa ggaggagaag attggggagg gcacgtacgg180
ggtggtgtac agggcgcggg acaaggtcac caacgagacg atcgcgctca agaagatccg240
gcttgagcag gaggatgagg gcgtcccctc caccgcaatc cgcgagatct cgctcctcaa300
ggagatgcat cacggcaaca tcgtcaggtt acacgatgtt atccacagtg agaagcgcat360
atatcttgtc tttgagtatc tggatctgga cctaaagaag ttcatggact cttgtccaga 420
gtttgcgaaa aaccccactt taattaagtc atatctctat cagatactcc gcggcgttgc 480
ttactgtcat tctcatagag ttcttcatcg agatttgaaa cctcagaatt tattgataga 540
tcggcgtact aatgcactga agcttgcaga ctttggttta gccagggcat ttggaattcc 600
tgtccgcacg tttactcacg aggttgtaac cttgtggtat agagctccag agatccttct 660
tggatcaagg cagtattcta caccagttga tatgtggtca gttggttgta tctttgcaga 720
aatggtgaac cagaaaccac tgttccctgg tgattctgag attgatgaat tatttaagat 780
attcagggta ctaggaactc caaatgaaca aagttggcca ggagttaget cattacctga 840
ctacaagtct gctttcccca agtggcaagc acaggatctt gcaactattg tccctactct 900
tgaccctgct ggtttggacc ttctctctaa aatgcttcgg tacgagccaa acaaaaggat 960
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ctgctatggc tttacattgg attggcatat gtatgggctg ggctcctcat ttcattcctt1080
ctgtgaacgc tgtgcccttc gtttgggcat ttttg 1115
<210>8
<21l>294
<212>PRT
<213>稻
<400>8
Met Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu Thr Ile Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Pro Thr Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile Leu
100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Arg Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Arg Arg Thr Asn Ala Leu Lys Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Gly Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Leu Leu
165 170 175
Gly Ser Arg Gln Tyr Ser Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys
180 185 190
Ile Phe Ala Glu Met Val Asn Gln Lys Pro Leu Phe Pro Gly Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Asp Glu Leu Phe Lys Ile Phe Arg Val Leu Gly Thr Pro Asn
210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Arg Tyr Glu Pro
260 265 270
Asn Lys Arg Ile Thr Ala Arg Gln Ala Leu Glu His Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>9
<211>294
<212>PRT
<213>稻
<400>9
Met Glu Gln His Glu Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu Thr Ile Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Tnr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Asp Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Pro Thr Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile Leu
100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Arg Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asr Leu Leu Ile Asp Arg Arg Thr Asn Ala Leu Lys Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Phe Gly Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Leu Leu
165 170 175
Gly Ser Arg Gln Tyr Ser Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys
180 185 190
Ile Phe Ala Glu Met Val Asn Gln Lys Pro Leu Phe Pro Gly Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Asp Glu Leu Phe Lys Ile Phe Arg Val Leu Gly Thr Pro Asn
210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Arg Tyr Glu Pro
260 265 270
Asn Lys Arg Ile Thr Ala Arg Gln Ala Leu Glu His Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>l0
<211>294
<212>PRT
<213>稻
<400>10
Met Glu Gln Tyr Glu Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu ThA Thr Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Pro Thr Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile Leu
100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Arg Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Arg Arg Thr Asn Ala Leu Lys Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Gly Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Leu Leu
165 170 175
Gly Ser Arg Gln Tyr Ser Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys
180 185 190
Ile Phe Ala Glu Met Val Asn Gln Lys Pro Leu Phe Pro Gly Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Asp Glu Leu Phe Lys Ile Phe Arg Val Leu Gly Thr Pro Asn
210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Arg Tyr Glu Pro
260 265 270
Asn Lys Arg Ile Thr Ala Arg Gln Ala Leu Glu His Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>11
<211>294
<212>PRT
<213>稻
<400>11
Met Glu Gln Tyr Va1 Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
l 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu Thr Ile Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
Phe Ala Lys Asn Pro Thr Leu Ile Lys Ser Tyr Leu Tyr Gln Ile Leu
100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Ser Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Arg Arg Thr Asn Ala Leu Glu Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Gly Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
Thr His Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Ile Leu Leu
165 170 175
Gly Ser Arg Gln Tyr Ser Thr Pro Val Asp Met Trp Ser Val Gly Cys
180 185 190
Ile Phe Ala Glu Met Val Asn Gln Lys Pro Leu Phe Pro Gly Asp Ser
195 200 205
Glu Ile Asp Glu Leu Phe Lys Ile Phe Arg Val Leu Gly Thr Pro Asn
210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Arg Tyr Glu Pro
260 265 270
Asn Lys Arg Ile Thr Ala Arg Gln Ala Leu Glu His Glu Tyr Phe Lys
275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>12
<211>294
<212>PRT
<213>稻
<400>12
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1 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu Thr Ile Ala Leu
20 25 30
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Gln Glu Asp Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala
35 40 45
Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Ile His Ser Glu Lys Arg Ile Tyr Leu Val Phe
65 70 75 80
Glu Tyr Leu Asp Leu Asp Leu Lys Lys Phe Met Asp Ser Cys Pro Glu
85 90 95
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100 105 110
Arg Gly Val Ala Tyr Cys His Ser His Arg Val Leu His Arg Asp Leu
115 120 125
Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Asp Arg Arg Thr Asn Ala Leu Lys Leu
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Arg Ile Pro Val Arg Thr Phe
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
225 230 235 240
Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
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275 280 285
Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>13
<211>294
<212>PRT
<213>稻
<400>13
Met Glu Pro Tyr Glu Lys Glu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Val Val Tyr Arg Ala Arg Asp Lys Val Thr Asn Glu Thr Ile Ala Leu
20 25 30
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Ile Arg Glu Ile Ser Leu Leu Lys Glu Met His His Gly Asn Ile Val
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Glu Gln Ser Trp Pro Gly Val Ser Ser Leu Pro Asp Tyr Lys Ser Ala
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Phe Pro Lys Trp Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Ile Val Pro Thr Leu
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Asp Pro Ala Gly Leu Asp Leu Leu Ser Lys Val Leu Arg Tyr Glu Pro
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Asp Leu Glu Met Val Gln
290
<210>14
<211>1243
<212>DNA
<213>稻
<400>14
aaaaccaccg agggacctga tctgcaccgg ttttgatagt tgagggaccc gttgtgtctg 60
gttttccgat cgagggacga aaatcggatt cggtgtaaag ttaagggacc tcagatgaac120
ttattccgga gcatgattgg gaagggagga cataaggccc atgtcgcatg tgtttggacg180
gtccagatct ccagatcact cagcaggatc ggccgcgttc gcgtagcacc cgcggtttga240
ttcggcttcc cgcaaggcgg cggccggtgg ccgtgccgcc gtagcttccg ccggaagcga300
gcacgccgcc gccgccgacc cggctctgcg tttgcaccgc cttgcacgcg atacatcggg360
atagatagct actactctct ccgtttcaca atgtaaatca ttctactatt ttccacattc420
atattgatgt taatgaatat agacatatat atctatttag attcattaac atcaatatga480
atgtaggaaa tgctagaatg acttacattg tgaattgtga aatggacgaa gtacctacga540
tggatggatg caggatcatg aaagaattaa tgcaagatcg tatctgccgc atgcaaaatc600
ttactaattg cgctgcatat atgcatgaca gcctgcatgc gggcgtgtaa gcgtgttcat660
ccattaggaa gtaaccttgt cattacttat accagtacta catactatat agtattgatt720
tcatgagcaa atctacaaaa ctggaaagca ataagaaata cgggactgga aaagactcaa780
cattaatcac caaatatttc gccttctcca gcagaatata tatctctcca tcttgatcac840
tgtacacact gacagtgtac gcataaacgc agcagccagc ttaactgtcg tctcaccgtc900
gcacactggc cttccatctc aggctagctt tctcagccac ccatcgtaca tgtcaactcg960
gcgcgcgcac aggcacaaat tacgtacaaa acgcatgacc aaatcaaaac caccggagaa 1020
gaatcgctcc cgcgcgcggc ggcgacgcgc acgtacgaac gcacgcacgc acgcccaacc 1080
ccacgacacg atcgcgcgcg acgccggcga caccggccgt ccacccgcgc cctcacctcg 1140
ccgactataa atacgtaggc atctgcttga tcttgtcatc catctcacca ccaaaaaaaa 1200
aaggaaaaaa aaacaaaaca caccaagcca aataaaagcg aca 1243
<210>15
<211>2191
<212>DNA
<213>稻
<400>15
aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60
aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact120
catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt180
tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc240
tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata300
aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga360
atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt420
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ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag540
gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt600
tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc660
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aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa780
aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca840
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tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa960
aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata 1020
ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag 1080
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tcctcaattt tgttttcaaa ttcacatcga ttatctatgc attatcctct tgtatctacc 2040
tgtagaagtt tctttttggt tattccttga ctgcttgatt acagaaagaa atttatgaag 2100
ctgtaatcgg gatagttata ctgcttgttc ttatgattca tttcctttgt gcagttcttg 2160
gtgtagcttg ccactttcac cagcaaagtt c 2191
<210>16
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>有義引物prm0350
<400>16
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag aagtacgaga agctaga57
<210>17
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反義引物prm0351
<400>17
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagaactgag acttgtcaag g 51
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>有義引物prm439
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ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag aaatacgaga agctc 55
<210>19
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反義引物prm440
<400>19
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gtcagaactg agatttgtc 49
<210>20
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>有義引物prm2213
<400>20
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggac aacaatggag ttaa 54
<210>21
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反義引物prm2214
<400>21
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagagagagg acttgtcag 49
權(quán)利要求
1.改良選自增加產(chǎn)量、增加生長速度和改變的結(jié)構(gòu)中的一種或多種植物生長特性的方法，所述方法包括在植物中增加編碼B型CDK蛋白的核酸的表達，和/或增加植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其中所述增加表達是通過在植物中導(dǎo)入和表達B型CDK核酸來實現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中所述B型CDK來自植物、藻類或真菌來源。
4.根據(jù)權(quán)利要求3中所述的方法，其中所述來自植物的B型CDK優(yōu)選來自雙子葉植物，進一步優(yōu)選來自十字花科，更優(yōu)選該核酸序列來自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述B型CDK是1類B型CDK，優(yōu)選來自鼠耳芥的CDK B1；1或來自鼠耳芥的CDK B1；2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述B型CDK是2類B型CDK，優(yōu)選來自鼠耳芥的CDK B2；2。
7.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的方法，其中所述CDK B1；1核酸是SEQID NO1代表的序列或其部分序列，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B1；1蛋白是SEQ ID NO2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的方法，其中所述CDK B1；2核酸是SEQ ID NO3代表的序列或其部分序列，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B1；2蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的方法，其中所述CDK B2；2核酸是SEQ ID NO5代表的序列或其部分序列，或可以與其雜交的核酸序列，并且其中CDK B2；2蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述B型CDK是選自下列的核酸變體或氨基酸變體
(a)B型CDK核酸/基因的功能部分；
(b)能夠與B型CDK核酸/基因雜交的序列；
(c)B型CDK核酸/基因的可變剪接變體；
(d)B型CDK核酸/基因的等位基因變體；
(e)B型CDK蛋白的同源物、衍生物或活性片段；
(f)突變的B型CDK。
11.根據(jù)權(quán)利要求5至10中任一項所述的方法，其中所述CDK B1；1核酸的表達是由在未成熟的膨脹組織中有活性的啟動子驅(qū)動的，優(yōu)選所述啟動子是β-蘋果青霉素啟動子。
12.根據(jù)權(quán)利要求5至10中任一項所述的方法，其中所述CDK B1；2核酸的表達和其中所述CDK B2；2核酸的表達是由組成型啟動子驅(qū)動的，優(yōu)選其中所述啟動子是GOS2啟動子。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述增加產(chǎn)量包括以下中的一種或多種相對于對照植物，增加面積、增加圓錐花序的數(shù)量、增加高度、增加種子的數(shù)量、增加飽滿種子的數(shù)量、增加種子的總重量、增加千粒重(TKW)和增加收獲系數(shù)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項所述的方法，其中所述改變的結(jié)構(gòu)包括以下中的一種或多種地上面積的增加、圓錐花序數(shù)量的增加和高度的增加。
15.可由權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法得到的植物。
16.構(gòu)建體，包含
(a)編碼B型CDK蛋白的B型CDK基因/核酸；或
(b)編碼CDK突變體的核酸，該CDK突變體包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個；
(c)能夠驅(qū)動(a)或(b)的核酸表達的一個或多個控制序列；和任選
(d)轉(zhuǎn)錄終止序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的構(gòu)建體，其中所述(a)中的核酸是SEQ ID NO3代表的CDK B1；2核酸或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且所述核酸編碼CDK B1；2蛋白，所述蛋白是SEQ ID NO4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求16中所述的構(gòu)建體，其中所述(a)中的核酸是SEQ ID NO5代表的CDK B2；2核酸或其部分，或可以與其雜交的核酸序列，并且所述核酸編碼CDK B2；2蛋白，所述蛋白是SEQ ID NO6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中任一項所述的構(gòu)建體，其中所述的控制序列包含組成型啟動子，優(yōu)選是GOS2啟動子。
20.生產(chǎn)具有選自增加產(chǎn)量、增加生長速度和改變的結(jié)構(gòu)中的一種或多種的改良的植物生長特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該生長特性相對于對應(yīng)的野生型植物的生長特性而被改良，所述方法包括以下步驟
(a)在植物或植物細胞中導(dǎo)入B型CDK基因/核酸；或
(b)編碼CDK突變體的核酸，該CDK突變體包括表A中顯示的七個氨基酸位置改變中的至少一個；
(c)在促進再生和成熟植物生長的條件下培養(yǎng)所述的植物細胞。
21.具有選自增加產(chǎn)量、增加生長速度和改變的結(jié)構(gòu)中的一種或多種的改良植物生長特性的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述植物相對于對應(yīng)的野生型植物，在植物中具有B型CDK核酸的增加表達，和/或植物中B型CDK蛋白的增加的活性和/或水平。
22.根據(jù)權(quán)利要求21中所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物。
23.CDK B型核酸或CDK B型氨基酸在改良植物的生長特性中的應(yīng)用，所述生長特性選自增加產(chǎn)量、增加生長速度和改變的結(jié)構(gòu)中的一種或多種。
24.用作生長調(diào)節(jié)物的組合物，包含SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6代表的蛋白質(zhì)，或前述序列中任一個的同源物、衍生物或活性片段。
25.鑒定相對于對應(yīng)的未突變植物CDK，具有提高的CDK活性的突變植物細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CDK)的篩選方法，所述方法包括以下步驟
(a)提供植物來源的CDK突變體；
(b)鑒定細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶的抑制劑(ICK)不反應(yīng)的突變體；
(c)鑒定具有細胞周期蛋白結(jié)合活性的突變體；并且可選地接有，
(d)步驟(b)和(c)中得到的突變體的酵母互補測試。
26.鑒定基本沒有活性，但能夠結(jié)合植物ICK的植物CDK的篩選方法，其包括以下步驟
(i)提供植物來源的CDK突變體；
(ii)鑒定植物來源的ICK結(jié)合的突變體；和
(iii)鑒定非細胞周期蛋白結(jié)合的突變體。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26中所述的篩選方法，其中所述CDK突變體由以下步驟提供
(i)提供野生型植物CDK；和
(ii)在至少一個氨基酸位置上突變所述CDK。
28.根據(jù)權(quán)利要求25或27中所述的篩選方法可得到的突變CDK，其中所述突變CDK如表A所示。
29.根據(jù)權(quán)利要求26或27中所述的篩選方法可得到的突變CDK，其中所述突變CDK如表B所示。
30.分離的核酸分子，其包含
(a)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13中任一個代表的CDK突變體的編碼核酸；
(b)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13中任一個代表的CDK突變體的同源物、衍生物或活性片段的編碼核酸，該同源物、衍生物或活性片段包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個；
(c)能夠與上面(a)或(b)中的核酸雜交的核酸，其中該雜交序列編碼的氨基酸包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個；
(d)由于遺傳密碼子所致的上面(a)至(c)的核酸的簡并核酸；
(e)(a)至(d)的核酸的等位基因變體，該等位基因變體編碼的氨基酸包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個；和
(f)(a)至(e)的核酸的可變剪接變體，該可變剪接變體編碼的氨基酸包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個。
31.CDK突變體，包含
(a)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13中任一個代表的氨基酸；和
(b)SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12和SEQ ID NO13代表的氨基酸的片段，該片段包含表A中所示的七個氨基酸位置改變中的至少一個，或表B中所示的八個氨基酸位置改變中的至少一個。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)植物中B型CDK核酸的表達，和/或通過調(diào)節(jié)植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平來改變植物生長特性的方法。本發(fā)明也涉及具有改變的生長特性的轉(zhuǎn)基因植物，該植物相對于對應(yīng)的野生型的植物中的表達、活性和/或水平，具有調(diào)節(jié)的植物中B型CDK核酸的表達，和/或調(diào)節(jié)的B型CDK蛋白的活性和/或水平。本發(fā)明還提供了新的篩選方法，鑒定相對于對應(yīng)的未突變CDK具有提高了CDK活性的CDK突變體。本發(fā)明同時提供了新的篩選方法，鑒定能夠結(jié)合CKI(細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑)的無活性CDK。本發(fā)明還提供通過本發(fā)明的篩選方法得到的CDK突變體。
文檔編號A01H5/00GK1845997SQ20048002544
公開日2006年10月11日 申請日期2004年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月5日
發(fā)明者W·布羅科特, V·弗蘭卡德, Y·哈茨菲爾德, V·米羅諾夫 申請人:作物培植股份有限公司