專利名稱：殼聚糖作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殼聚糖應(yīng)用技術(shù)的改進(jìn)，即殼聚糖的新用途。具體講是，殼聚糖作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑的應(yīng)用，屬于觀賞魚飼料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，觀賞魚市場(chǎng)的開發(fā)前景廣闊，從世界市場(chǎng)看，觀賞魚出口亞洲居首位，供應(yīng)量占全球市場(chǎng)總量的50％以上，但我國(guó)觀賞魚出口貿(mào)易很小。從重量上看，1995年世界出口13571噸，而中國(guó)出口僅460噸(占3.4％)；從金額上看，1999年出口金額232.2萬美元，僅占世界觀賞魚出口額的1.4％。事實(shí)上，我國(guó)觀賞魚市場(chǎng)很活躍，但總成不了規(guī)模，沒有自己的特點(diǎn)。觀賞魚養(yǎng)殖廠家大多是一個(gè)模式，一個(gè)套路，在世界觀賞魚行業(yè)中名聲不大。究其原因主要是養(yǎng)殖品種檔次低，體形，色澤沒有特點(diǎn)。而就觀賞魚的商品價(jià)值而言，其中一個(gè)非常重要的指標(biāo)在于魚體的色彩，一旦失去鮮艷的顏色，就會(huì)影響欣賞價(jià)值。然而在現(xiàn)有的養(yǎng)殖條件下，一些觀賞魚的體色與自然狀態(tài)下生活的同種個(gè)體有某些差異。其主要表現(xiàn)在顏色減退，部分漂亮的條紋消失，造成養(yǎng)殖觀賞魚這種體色變異的原因，可能是它們的生活環(huán)境不同，而更主要的原因是缺少先進(jìn)有效的防病保健營(yíng)養(yǎng)飼料和水質(zhì)管理技術(shù)，使觀賞魚很難上新的臺(tái)階。而對(duì)于影響觀賞魚體色素沉淀的重要因素有(1)飼料和動(dòng)物體內(nèi)的過氧化物含量過高，影響其體色素沉淀，因而保護(hù)動(dòng)物體內(nèi)脂肪和色素免受氧化破壞是一重要措施；(2)魚色素沉積是魚的健康狀況的另一重要因素，如消化道疾病，寄生蟲病，沙門氏菌病等會(huì)降低觀賞魚對(duì)飼料中各種成分(包括色素)的消化和吸收，影響色素沉著。隨著觀賞魚養(yǎng)殖業(yè)向名、特、優(yōu)、新方向發(fā)展，改善養(yǎng)殖對(duì)象體色問題已日趨緊迫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種調(diào)節(jié)觀賞魚體色和體重的海洋生物制品。由于殼聚糖天然無毒，無副作用，具有廣譜抗菌性，抗氧化活性，調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥用活性，這幾種活性與觀賞魚魚體色素沉積息息相關(guān)。因此，本發(fā)明對(duì)殼聚糖作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑的應(yīng)用進(jìn)行了研究。本發(fā)明有望改善我國(guó)在觀賞魚養(yǎng)殖業(yè)的落后現(xiàn)象，縮短我國(guó)在觀賞魚領(lǐng)域與國(guó)際的差距。
本發(fā)明的任務(wù)是由以下技術(shù)方案完成的，研制了殼聚糖作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑的應(yīng)用。
所述觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料，其含有重量比為1——25％的殼聚糖。
所述的殼聚糖，其脫乙酰度為60——85％，分子量為20——76萬。
所述的飼料，其包括基礎(chǔ)飼料，粘合劑和賦形劑。
所述的基礎(chǔ)飼料，其包括粗蛋白，粗脂肪，酵母粉，紫菜，適量的鉀、銅、鐵離子。
所述的粘合劑和賦形劑，其為面粉，或/和羧甲基纖維素，或/和明膠，或/和糊精，骨粉，魚粉，或糖衣，或膠囊。
所述的飼料，其還添加天然色素，或/和甜菜堿。
所述的天然色素，其為花青素，或蝦青素，或原花色素，或辣椒色素。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由于殼聚糖具有抗氧化活性，而抗氧化劑能降低餌料和動(dòng)物體內(nèi)過氧化物的含量，保護(hù)脂肪和色素免受氧化破壞，因此，殼聚糖可以作為抗氧化劑添加到飼養(yǎng)觀賞魚的飼料中。由于殼聚糖是陽(yáng)性趨化劑，在觀賞魚動(dòng)物體內(nèi)殼聚糖上的陽(yáng)性基團(tuán)氨基可吸收單核細(xì)胞而從血管中游出，聚集在組織中形成吞噬細(xì)胞，或直接刺激局部組織，促進(jìn)細(xì)胞增生，進(jìn)而演變?yōu)榫奘杉?xì)胞。因此該殼聚糖可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，促進(jìn)體液免疫和細(xì)胞免疫功能。該殼聚糖為典型的B細(xì)胞活化劑，可提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能和水解酶的活性。因此，殼聚糖在觀賞魚體中可能是有增加血淋巴吞噬細(xì)胞的能力，是一種很好的調(diào)節(jié)觀賞魚機(jī)體免疫力的添加劑。由于殼聚糖分子中的氨基帶正電，而大多數(shù)的致病菌都呈陰離子性狀，殼聚糖可與病原菌表面鞭毛及套膜吸附凝聚。帶正電的殼聚糖與帶負(fù)電的病原菌可以相互結(jié)合，而后可排出體外，從而抑制了病原菌的生長(zhǎng)。因此，殼聚糖可抑制觀賞魚中病原菌的繁殖而增強(qiáng)了觀賞魚的抗病能力。所以，殼聚糖在抗氧化，提高免疫力，抑制病原菌的作用效果佳，對(duì)觀賞魚的增色及增重具有一定的作用，可以作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑。
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于下列實(shí)施例中。本發(fā)明采用的殼聚糖是由青島百成海洋生物資源有限責(zé)任公司生產(chǎn)提供的。
一、殼聚糖的抗氧化活性作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)研究，其具體方法為(1)、配制PH＝7的磷酸緩沖溶液3000ml。
(2)、配制濃度為3×10-3mol/L的氮氨酸溶液。
(3)、配制濃度為18×10-6mol/L的核黃素溶液。
(4)、配制濃度為225×10-6mol/L的氮藍(lán)四唑(NBT)溶液。
(5)、配制系列濃度的殼聚糖溶液(0.5×10-2～0.05×10-2g/ml)。
(6)、各取(2)，(3)溶液0.5ml加入比色管，再加入(4)溶液0.5ml，比色管在日光燈下照射直至變色，此為空白樣。
(7)、各取(2)、(3)溶液0.5ml加入比色管，再加入(4)溶液0.5ml，并向比色管加入0.5ml(5)溶液，將比色管在日光燈下照射約30min。
(8)、將(6)，(7)樣放入分光光度計(jì)中，測(cè)定各樣品的吸光度。
對(duì)自由基的清除率按下式計(jì)算

其中，A0為空白樣的吸光度，A為樣品的吸光度。試驗(yàn)結(jié)果，見表1表1 不同質(zhì)量濃度的殼聚糖對(duì)清除O2·-活性的影響

由表1可以看出殼聚糖對(duì)O2·-具有明顯的清除活性，清除率可達(dá)62.8％。質(zhì)量濃度越低，清除O2·-活性相對(duì)較差。此表說明殼聚糖具有抗氧化活性，而抗氧化劑能降低餌料和動(dòng)物體內(nèi)過氧化物的含量，保護(hù)脂肪和色素免受氧化破壞，因此，殼聚糖可以作為抗氧化劑添加到飼養(yǎng)觀賞魚的餌料中。
二、殼聚糖作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑的應(yīng)用在動(dòng)物機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用中的實(shí)驗(yàn)研究(1)、試驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體重18-22克，雌雄各半，由山東省新藥藥理研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，合格證號(hào)970102(2)、殼聚糖對(duì)小鼠機(jī)體免疫功能的測(cè)定取健康昆明種小鼠40只，按體重隨機(jī)分為4組，每組10只，分別設(shè)為殼聚糖高(300mg/kg)、低(100mg/kg)劑量組，免疫低下模型組及空白對(duì)照組，每日灌胃給藥，給藥時(shí)除空白對(duì)照組外各組動(dòng)物皮下注射氫化可的松0.5ml(80mg/kg)，同時(shí)殼聚糖組灌胃給予各劑量藥物，模型組及空白組灌胃給予等量0.5％羧甲基纖維素鈉溶液。連續(xù)7天后停止注射氫化可的松，繼續(xù)給予其它藥物至14天，于最后一次給藥后2小時(shí)摘眼球取血，離心取血清，免疫擴(kuò)散板法測(cè)血清IgG含量。脫臼處死動(dòng)物，取其胸腺脾臟稱重。
(3)、試驗(yàn)結(jié)果，見表2，表3。
表2 殼聚糖連續(xù)給藥14天對(duì)小鼠免疫器官重量的影響

x±s※p≤0.05※※p≤0.01 vs 模型組Δp≤0.05ΔΔp≤0.01 vs空白組N＝10由表2可見，連續(xù)給予氫化可的松后，各組動(dòng)物胸腺重量與對(duì)照組比較均明顯減輕，脾臟除陽(yáng)性對(duì)照組外也均明顯減輕，表明給予氫化可的松后可引起動(dòng)物免疫器官重量明顯減輕。殼聚糖高劑量、低劑量組動(dòng)物的免疫器官重量均明顯高于模型組。
表3 殼聚糖連續(xù)給藥14天對(duì)免疫低下模型小鼠血清IgG含量的影響

X±s※p≤0.05※※p≤0.01 vs 模型組Δp≤0.05ΔΔp≤0.01 vs空白組N＝10由表3可見，連續(xù)給予氫化可的松后，除陽(yáng)性對(duì)照組外，各組動(dòng)物IgG含量與正常對(duì)照組比較均明顯降低，與模型組比較，殼聚糖高劑量、低劑量組動(dòng)物IgG含量均明顯升高。
三、殼聚糖作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑在動(dòng)物機(jī)體的抗菌性實(shí)驗(yàn)研究3.1供試菌種蘋果腐爛病菌(Valsa mali)。冰箱內(nèi)保存的菌種經(jīng)2次轉(zhuǎn)管復(fù)壯后備用。接種時(shí)用在新鮮菌落的外圍，直徑6mm的打孔器打取菌餅接種。
3.2供試藥品脫乙酰85％的殼聚糖，試驗(yàn)以50％多菌靈可濕性粉劑(威海韓孚生化農(nóng)藥有限公司)為陽(yáng)性對(duì)照，以0.1mol/LHCl溶液為陰性對(duì)照。
3.3培養(yǎng)基準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)采用PDA培養(yǎng)基，配方為水 1000ml；馬鈴薯 200g；蔗糖 20g； 瓊脂粉 10g培養(yǎng)基配制好后，裝入三角瓶中，每瓶容量為38ml(加2ml樣品)或40ml(加200□1和20□1樣品)，滅菌備用。
3.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)樣品對(duì)病原菌的抑菌活性采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定。樣品的原始濃度為10000ppm(10mg/ml)，擬測(cè)試3個(gè)濃度，即5ppm，50ppm和500ppm對(duì)病原菌的抑菌活性。病原菌擬采用蘋果腐爛病菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)。每處理設(shè)置2個(gè)培養(yǎng)皿，每皿接種3個(gè)菌落，對(duì)每個(gè)菌落測(cè)定最大直徑和最小直徑。全部試驗(yàn)重復(fù)一次。
3.5測(cè)試方法將滅菌的培養(yǎng)基加熱熔化，然后放置于水浴鍋中冷卻至60℃，備用。分別將2ml、200□1和20□1樣品溶液加入38ml、40ml和40ml 60℃的培養(yǎng)基中，配成含藥量分別為500ppm、50ppm和5ppm的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基均勻倒入2個(gè)直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，待完全凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中接種3塊直徑為6mm的菌餅。在25℃下培養(yǎng)48hr或72hr后，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算樣品的抑菌率。
3.6結(jié)果分析表4對(duì)蘋果腐爛病菌的抑菌效果

從上述結(jié)果可看出，殼聚糖對(duì)病原菌具有抑制作用，并且濃度越大抑制作用越強(qiáng)。
四、殼聚糖作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑對(duì)觀賞魚的增色及增重作用的實(shí)驗(yàn)研究(1)、取紅長(zhǎng)尾獅頭200尾(雌雄魚各半)，經(jīng)暫養(yǎng)12天后平均分成七組放養(yǎng)于65×35×40cm3的玻璃水族箱中，按金魚的養(yǎng)殖方式進(jìn)行養(yǎng)殖和管理。
(2)、將粗蛋白、粗纖維、殼聚糖(脫乙酰度為85％，分子量為76萬)、酵母粉、紫菜、氨基酸、特殊礦物質(zhì)、天然色素、甜菜堿等按配方比例(見表7)混合待用，然后將粘合劑(面粉和或羧甲基纖維素鈉)用溫開水或文火調(diào)成厚漿狀，在將上述混合物慢慢摻入拌合成象蒸松糕樣胚料，再經(jīng)餌料機(jī)制成顆粒狀魚飼料，曬干即可用。
(3)、將(1)中的七組，設(shè)1組為對(duì)照組并投喂(2)中不含殼聚糖的飼料，其余6組為處理組，投喂(2)中拌有不同濃度殼聚糖的量為25％、20％、15％、10％、8％、5％的殼聚糖添加劑的飼料。
(4)、(3)中的觀賞魚投喂(2)中的各飼料，以12天為一個(gè)試驗(yàn)周期，每一周期隨機(jī)地從其中的三個(gè)試驗(yàn)組中抽取雌雄魚4-5尾，進(jìn)行以下項(xiàng)目測(cè)試①用精密天平測(cè)量觀賞魚體重變化情況，可檢測(cè)出殼聚糖對(duì)觀賞魚的健康狀況，即體重的影響。結(jié)果，見表5。
②用722型分光光度計(jì)測(cè)定一次魚體表及肌肉中所沉積的胡蘿卜素在450nm波長(zhǎng)下的吸光度，可定性的看出殼聚糖對(duì)觀賞魚體色的影響。
(5)、利用胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸直線方程，計(jì)算出相應(yīng)的β-胡蘿卜素的含量。試驗(yàn)過程中測(cè)定試驗(yàn)魚魚體及肌肉中所含β-胡蘿卜素時(shí)是將試驗(yàn)魚搗碎，提取，萃取分離β-胡蘿卜素和類胡蘿卜素液比色。
回歸直線方程Y＝0.6032X+0.0018(n＝7，r＝0.997，p＜0.01)，其中，n為測(cè)定次數(shù)，r為線性相關(guān)系數(shù)，p為統(tǒng)計(jì)學(xué)的置信度，X為吸光度，Y為β-胡蘿卜素的具體含量?？啥康目闯鰵ぞ厶菍?duì)觀賞魚體色的影響，魚體類胡蘿卜素含量的增加表示顏色的加深。結(jié)果，見表6。
表5魚的體重變化情況

*魚的原始體重為4.78克，12天為一個(gè)周期。
由上表可以看出，添加殼聚糖后，魚的體重變化明顯，比用原飼料飼養(yǎng)的魚的體重高出46％左右。說明殼聚糖對(duì)魚的增重具有顯著的作用。
表6魚體顏色的變化，即魚體β-胡蘿卜素含量的變化


由于該魚飼料中添加一定量的殼聚糖，在近50天中，隨著飼喂時(shí)間延長(zhǎng)，魚體類胡蘿卜素含量增加，處理I、II、III組的魚體色較對(duì)照組有明顯的加深，魚體表色素沉積量增加2～4倍(魚體色的加深，魚體表色素沉積量就增加。因?yàn)轭惡}卜素是顯色劑，它含量越多，顏色越深)，而對(duì)照組只增加了不到2倍。由于雄激素的作用，第二性征逐漸明顯，雄魚體色較雌魚鮮艷，這與體表及肌肉沉積的β-胡蘿卜素較雌魚多有關(guān)。因此，殼聚糖作為觀賞魚養(yǎng)殖過程中的保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑，具有明顯的增色、抗氧化、提高機(jī)體免疫力、抗菌等效果。
表7觀賞魚飼料配方，經(jīng)餌料機(jī)制成顆粒飼料


本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，但其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.殼聚糖作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料，其特征在于該飼料含有重量比1--25％的殼聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料，其特征在于所述的殼聚糖，其脫乙酰度為60--85％，分子量為20--76萬。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料，其特征在于所述的飼料，其包括基礎(chǔ)飼料，粘合劑和賦形劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料，其特征在于所述的基礎(chǔ)飼料，其包括粗蛋白，粗脂肪，酵母粉，紫菜，適量的鉀、銅、鐵離子。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料，其特征在于所述的粘合劑和賦形劑，其為面粉，玉米粉，或/和羧甲基纖維素，或/和明膠，或/和糊精，骨粉，魚粉，或糖衣，或膠囊。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料，其特征在于所述的飼料，其還添加天然色素，或/和甜菜堿。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料，其特征在于所述的天然色素，其為花青素，或蝦青素，或原花色素，或辣椒色素。
全文摘要
本發(fā)明公開了天然高分子堿性多糖——?dú)ぞ厶亲鳛橹苽溆^賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑的應(yīng)用。所述觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料，其含有重量比為1－25％的殼聚糖。該殼聚糖的脫乙酰度為60－85％，分子量為20－76萬。該飼料包括基礎(chǔ)飼料，粘合劑和賦形劑。本發(fā)明首次將殼聚糖的生物活性與觀賞魚魚體色素沉積聯(lián)系在一起。提供的觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料是以殼聚糖作為制備觀賞魚保健營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑并進(jìn)行了研究。該保健營(yíng)養(yǎng)飼料在抗氧化，提高免疫力，抑制病原菌，調(diào)節(jié)免疫功能等的作用效果佳，對(duì)觀賞魚的增色及增重具有一定的作用。本發(fā)明有望改善我國(guó)在觀賞魚養(yǎng)殖業(yè)的落后現(xiàn)象，縮短我國(guó)在觀賞魚領(lǐng)域與國(guó)際的差距。
文檔編號(hào)A23K1/16GK1559258SQ20041002363
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月28日
發(fā)明者李冠天, 邢榮娥, 郭占勇, 郭京君, 閻振廣 申請(qǐng)人:李冠天