專利名稱：黃藤無性系組培繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黃藤培育方法，特別是黃藤無性系組培繁殖方法。屬于熱帶林木特別是黃藤的栽培及移植技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃藤(Daemonorops margaritae Beccari.)是棕櫚科(Palmae)省藤亞科(Calamoideae)省藤族(Calameae)黃藤屬(Daemonorops)的具刺、攀緣、叢生藤本植物，是華南熱帶、南亞熱帶地區(qū)森林特有的伴生植物。藤莖具有良好的工藝特性，是制作家具和工藝品的優(yōu)良原料。藤嫩梢富含人體所需的多種營(yíng)養(yǎng)成分，可做蔬菜食用。果實(shí)可萃取“麒麟血竭”。種子質(zhì)地堅(jiān)硬，是制作“佛珠”的傳統(tǒng)材料。因此，黃藤是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景的多用途珍貴森林植物，也是華南地區(qū)廣泛栽培的主要商品藤種。目前，海南、廣東、廣西、云南、福建等省區(qū)已大面積栽培黃藤。
現(xiàn)有技術(shù)中，黃藤主要采用種子繁殖，育苗技術(shù)已成功用于造林苗木的培育。但種子繁殖存在如下方面缺點(diǎn)(1)受到季節(jié)的影響，一年只能培育1-2季苗木。黃藤種子在常規(guī)室溫條件下不耐貯藏，給種子繁殖增加了新的難度。(2)黃藤的最適采種季節(jié)為11～12月，由于該季節(jié)產(chǎn)地的濕度小，室溫條件下種子容易失水，從而迅速失去發(fā)芽能力。即使在恒溫(15度)、恒濕(介質(zhì)含水率保持在50％～65％)的最佳貯藏條件下貯藏六個(gè)月，發(fā)芽率也降低至65％左右。(3)種子繁殖只能繁殖常規(guī)苗木，不能繁殖無性系苗木。由于黃藤為異花授粉植物，且馴化程度不高，所以天然林和現(xiàn)有人工林中的黃藤的雜合程度高，種子繁殖的苗木造林后在生長(zhǎng)、萌蘗、材性等方面分化大，既不利于平均產(chǎn)量的提高，也不利于藤林的集約化經(jīng)營(yíng)和藤條采收與銷售。
上世紀(jì)九十年代開始，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所開始研究黃藤的組培快繁技術(shù)。但棕櫚科植物組培技術(shù)研究難度大，經(jīng)過兩個(gè)五年計(jì)劃的研究，也只能以種胚作外植體才能組培快繁成功，而用頂芽、萌蘗芽、根、葉等無性器官做外植體，則不能組培快繁成功。因而，原有的藤組培技術(shù)僅局限于種苗繁殖，即通過組織培養(yǎng)工廠化快繁苗木，但仍然不能繁殖無性系苗木。與種子繁育苗木相比，組培快繁的成本高，市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力低下，因而現(xiàn)有以種胚做外植體的黃藤組培技術(shù)尚無應(yīng)用前景，不可能產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益。由于林木基因組雜合程度高，實(shí)生苗造林分化大，林木育種通常是走無性系育種的道路，即從育種群體中選出優(yōu)樹，然后通過無性繁殖的方法繁殖良種?，F(xiàn)有只能以種胚為外植體的組培技術(shù)尚無法滿足無性系育種和無性系推廣的要求。如果不解決黃藤無性系組培快繁的技術(shù)問題，將嚴(yán)重制約黃藤無性系育種、良種的中試和良種的推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題，即本發(fā)明的目的，是為了克服現(xiàn)有技術(shù)種子繁殖法存在的受季節(jié)影響大、種子發(fā)芽率低、繁殖速度慢的缺點(diǎn)，提供黃藤無性系組培繁殖方法。
本發(fā)明的技術(shù)問題可以通過采取如下措施解決黃藤無性系組培繁殖方法，其特點(diǎn)是1)萌蘗芽外植體的采集，在采集萌蘗芽外植體的過程中防止芽體外傷和芽心的震裂，并使萌蘗芽外植體的高度為15-40cm；2)外植體的消毒，采用兩次消毒法，首先，用洗衣粉將外植體清洗干凈，剝?nèi)?-2層葉鞘，用75％酒精消毒15-20秒，0.1％升汞消毒8-10分鐘，無菌水漂洗1次5分鐘，第二步剝?nèi)ザ嘤嗳~鞘并修剪至適合于培養(yǎng)的大小，即萌蘗芽外植體3-4cm長(zhǎng)、頂芽外植體5-6cm長(zhǎng)，再用0.1％升汞消毒1-2分鐘，無菌水漂洗3次，分別為5分鐘、5分鐘、10分鐘；3)防止褐變，采用半光氨酸或抗壞血酸溶液泡洗前述萌蘗芽外植體，或采用半光氨酸或抗壞血酸混合溶液泡洗前述萌蘗芽外植體，可以有效地抑制芽外植體的褐變，所述的半光氨酸和抗壞血酸的濃度分別為2mg/l和10mg/l；4)叢芽誘導(dǎo)與繼代增殖，叢芽誘導(dǎo)和繼代增殖的培養(yǎng)基配方為KNO3、NH4NO3、CaCl2、MgSO4和KH2PO4，其配比分別為1.5MS、0.5MS、1.0MS、1.0MS、2.5MS；叢芽誘導(dǎo)周期35～40天，繼代培養(yǎng)的周期為45～50天；5)生根培養(yǎng)，高度大于2 cm的芽苗最為適合生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1.0mg/L NAA+2.0mg/L IBA+0.33MS大量元素+20.g/L蔗糖溶液+1.0MS微量元素+1.0MS維生素和氨基酸，生根培養(yǎng)的時(shí)間需要50～60天，對(duì)未生根的芽苗除去外層葉鞘后，進(jìn)行第二次生根培養(yǎng)。
為了更好地解決本發(fā)明的技術(shù)問題，還可采用如下方案經(jīng)過生根培養(yǎng)后再進(jìn)行田間移植，將高度大于4cm、根長(zhǎng)度大于4cm，具有2片以上葉子的苗木移植至田間，適合黃藤組培苗移植的介質(zhì)有細(xì)沙、泥炭土和黃心土，也可以將三者按1∶1∶2的比例混合，作為黃藤組培苗的移植介質(zhì)。
移植介質(zhì)以1/1000的高錳酸鉀溶液消毒，移植后每個(gè)星期用1/800的百菌清和多菌靈輪流噴施。
施肥方法為1/1000的復(fù)合肥溶液每周噴施一次，移植后1～7天，95％的遮蔭網(wǎng)遮蔭，8～30天，85％的遮蔭網(wǎng)遮蔭，31～60天，70％的遮蔭網(wǎng)遮蔭，隨后采用50％遮蔭網(wǎng)遮蔭，一直管理到苗木出圃造林。
在前述第4)步叢芽誘導(dǎo)和繼代增殖的培養(yǎng)基配方增加激素，激素成份為BA 4.0mg/L+IBA 0.25mg/L+2，4-D 0.75mg/L。
在前述第5)生根培養(yǎng)中將芽苗高度和大小接近的2～4個(gè)芽切分在同一小芽叢，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，移植后即可培育成叢芽苗。
本發(fā)明具有如下突出效果與原有種子育苗相比，本方法具有種苗繁殖速度快、種苗生產(chǎn)不受季節(jié)限制的優(yōu)點(diǎn)，與已發(fā)表的以種胚為外植體的組培技術(shù)相比，本組培方法具有能夠繁殖優(yōu)良無性系的優(yōu)點(diǎn)。原有組培技術(shù)以種胚做外植體，繁殖材料的遺傳基礎(chǔ)無法完全控制，繁殖的苗木與種子繁殖的苗木相比沒有品質(zhì)差別，但組培繁育苗木的成本比種子繁育苗木高出許多，難以與種子繁育的苗木在市場(chǎng)上競(jìng)爭(zhēng)，因而原有以種胚外植體的組培技術(shù)的應(yīng)用前景不大。本方法以萌蘗芽做外植體，可以繁殖經(jīng)過選育和測(cè)定的優(yōu)良無性系，生產(chǎn)的是良種的苗木，具有強(qiáng)大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，因而本技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1熱帶林業(yè)研究所組培室從廣州龍洞所內(nèi)和高要金雞坑林場(chǎng)多次采集萌蘗芽外植體，應(yīng)用本發(fā)明辦法，用鋸將萌蘗芽從母株上鋸下來，萌蘗芽外植體的大小為15-40cm高，采用本發(fā)明的兩次消毒法步驟，消毒成功率最高可達(dá)59.1％，平均成功率為34.9％--38.4％。具體方法、步驟如下
1)萌蘗芽外植體的采集，采集萌蘗芽外植體的關(guān)鍵在于防止芽體外傷和芽心的震裂。如果芽體有傷口，泥土容易進(jìn)入芽體內(nèi)部，無法消毒成功。芽心震裂后，傷口處即迅速褐變，易導(dǎo)致芽心的死亡。因而，不能用鋤頭將萌蘗芽挖離母株，也不能用刀砍，必須用鋸將萌蘗芽從母株上鋸下來。萌蘗芽處于土壤之中，必須盡量避免在雨天及雨后1-3天內(nèi)采集。否則，污染率明顯上升。
適宜的萌蘗芽外植體的大小為15-40cm高。萌蘗芽過小，外植體消毒后易死亡，且沒有形成足夠的次級(jí)萌蘗芽原基，離體培養(yǎng)后容易出現(xiàn)持續(xù)的單芽高生長(zhǎng)但不萌發(fā)次級(jí)萌蘗芽的現(xiàn)象。萌蘗芽過大，尤其是超50cm后，萌蘗芽已開始抽莖，莖尖不在基部。要保留莖尖，則外植體過大，養(yǎng)分吸收供應(yīng)不上，莖尖無法生長(zhǎng)，且露出在培養(yǎng)基外面的部分褐變嚴(yán)重，最終導(dǎo)致整個(gè)芽的死亡。不保留莖尖，外植體也會(huì)缺乏莖尖而死亡。外植體的采集季節(jié)對(duì)消毒成功率、芽的生長(zhǎng)和叢芽的誘導(dǎo)均有顯著的影響。從2月至8月的各個(gè)月采集的外植體表明2月-3月初和9月份采集的外植體，因土壤干燥，容易消毒成功，4-8月份雨水較多，溫度較高，雨后采集的外植體難以消毒成功。但2-3月份采集外植體在培養(yǎng)基長(zhǎng)時(shí)間不生長(zhǎng)，難以誘導(dǎo)叢芽。4-8月份采集的外植體容易萌發(fā)，其基部的次級(jí)蘗芽也易萌發(fā)，易增殖，其中，以6-8月份生長(zhǎng)旺季采集的外植體最好，增殖率最高。
2)外植體的消毒，針對(duì)芽被多層葉鞘包裹的特點(diǎn)，采用兩次消毒法。首先，用洗衣粉將外植體清洗干凈(萌蘗芽外植體必須清洗干凈)，剝?nèi)?-2層葉鞘，用75％酒精消毒15-20秒，0.1％升汞消毒8-10分鐘，無菌水漂洗1次5分鐘，第二步剝?nèi)ザ嘤嗳~鞘并修剪至適合于培養(yǎng)的大小(萌蘗芽外植體3-4cm長(zhǎng)，頂芽外植體5-6cm長(zhǎng))，再用0.1％升汞消毒1-2分鐘，無菌水漂洗3次，分別為5分鐘，5分鐘，10分鐘。消毒成功率大于40％。
3)防止褐變，棕櫚藤萌蘗芽外植體消毒后褐變十分嚴(yán)重，不加處理會(huì)迅速死亡。經(jīng)過系列研究發(fā)現(xiàn)，采用暗處理、附加活性碳等方法難以達(dá)到預(yù)期效果，使用聚乙烯吡咯烷酮?jiǎng)t會(huì)導(dǎo)致外植體產(chǎn)生嚴(yán)重的白色分泌物，采用半光氨酸和抗壞血酸可以有效地抑制芽外植體的褐變，二者結(jié)合效果更好。適宜于防止藤類芽外植體抗褐變的半光氨酸和抗壞血酸的濃度分別為2mg/l和10mg/l。
4)叢芽誘導(dǎo)與繼代增殖，叢芽誘導(dǎo)和繼代增殖的培養(yǎng)基配方為KNO3、NH4NO3、CaCl2、MgSO4和KH2PO4分別為1.5MS；0.5MS；1.0MS；1.0MS；2.5MS。激素為BA 4.0mg/L+IBA 0.25mg/L+2，4-D 0.75mg/L。繼代培養(yǎng)的周期為45～50天，增殖倍數(shù)為3～4倍。另外，接種與培養(yǎng)方法對(duì)萌蘗芽外植體的叢芽誘導(dǎo)也有一定的影響。外植體消毒后，基部0.2-0.5cm因殺傷和褐變而死亡，死亡部分嚴(yán)重影響營(yíng)養(yǎng)的吸收，必須將芽?jī)A斜或平放，使之充分接觸培養(yǎng)基，可顯著促進(jìn)芽的生長(zhǎng)，促進(jìn)二級(jí)蘗芽的萌發(fā)，從而促進(jìn)增殖。
5)生根配方和生根培養(yǎng)，高度大于2cm的芽苗最為適合生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1.0mg/L NAA+2.0mg/L IBA+0.33MS大量元素+20.g/L蔗糖溶液+1.0MS微量元素+1.0MS維生素和氨基酸。生根培養(yǎng)的時(shí)間需要50～60天，生根率可達(dá)85％以上。未生根的芽苗在除去外層葉鞘后，進(jìn)行第二次生根培養(yǎng)，即可生根。
如果想培育叢芽苗，可以將芽苗高度和大小接近的2～4個(gè)芽切分在同一小芽叢，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，移植后即可培育成叢芽苗。
6)田間移植，高度大于4cm，根長(zhǎng)度大于4cm，具有2片以上葉子的苗木最適合移植。適合黃藤組培苗移植的介質(zhì)有細(xì)沙、泥炭土和黃心土，也可以將三者按1∶1∶2的比例混合，作為黃藤組培苗的移植介質(zhì)。移植介質(zhì)以1/1000的高錳酸鉀溶液消毒，移植后每個(gè)星期用1/800的百菌清和多菌靈輪流噴施，防止雜菌滋生。施肥方法為1/1000的復(fù)合肥溶液每周噴施一次。移植后1～7天，95％的遮蔭網(wǎng)遮蔭，8～30天，85％的遮蔭網(wǎng)遮蔭，31～60天，70％的遮蔭網(wǎng)遮蔭，隨后采用50％遮蔭網(wǎng)遮蔭，一直管理到苗木出圃造林。移植成活率大于90％。
在3～11月均可移植黃藤組培苗，其中3月～6月份為黃藤組培苗的最佳移植季節(jié)，且溫度、濕度均適合苗木的進(jìn)一步培養(yǎng)，達(dá)到造林高度和要求。7-9月份，溫度過高，移植成活率略低，通過強(qiáng)度施肥，苗木尚能達(dá)到造林高度。10～11月份能夠移植成活，但苗木生長(zhǎng)季節(jié)已過，次年春季苗木尚無法達(dá)到造林高度。
本實(shí)施例中BA為6-芐基氨基嘌呤，IBA為吲哚丁酸，NAA為萘乙酸，2，4-D為2，4-二氯苯氧乙酸。
大量元素由KNO3、NH4NO3、CaCl2、MgSO4和KH2PO4構(gòu)成，微量元素由H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·4H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、Na2EDTA、Fe2SO4·7H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O構(gòu)成。
實(shí)施例2消毒成功的外植體采用本發(fā)明的防褐化誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基，2-3個(gè)月就可見叢芽產(chǎn)生，叢芽誘導(dǎo)率約10％，繼代培養(yǎng)45-50天/代后，增殖倍數(shù)為3～4倍。
權(quán)利要求
1.黃藤無性系組培繁殖方法，其特征是1)萌蘗芽外植體的采集，在采集萌蘗芽外植體的過程中防止芽體外傷和芽心的震裂，并使萌蘗芽外植體的高度為15-40cm；2)外植體的消毒，采用兩次消毒法，首先，用洗衣粉將外植體清洗干凈，剝?nèi)?-2層葉鞘，用75％酒精消毒15-20秒，0.1％升汞消毒8-10分鐘，無菌水漂洗1次5分鐘，第二步剝?nèi)ザ嘤嗳~鞘并修剪至適合于培養(yǎng)的大小，即萌蘗芽外植體3-4cm長(zhǎng)、頂芽外植體5-6cm長(zhǎng)，再用0.1％升汞消毒1-2分鐘，無菌水漂洗3次，分別為5分鐘、5分鐘、10分鐘；3)防止褐變，采用半光氨酸或抗壞血酸溶液泡洗前述萌蘗芽外植體，或采用半光氨酸或抗壞血酸混合溶液泡洗前述萌蘗芽外植體，可以有效地抑制芽外植體的褐變，所述的半光氨酸和抗壞血酸的濃度分別為2mg/l和10mg/l；4)叢芽誘導(dǎo)與繼代增殖，叢芽誘導(dǎo)和繼代增殖的培養(yǎng)基配方為KNO3、NH4NO3、CaCl2、MgSO4和KH2PO4，其配比分別為1.5MS、0.5MS、1.0MS、1.0MS、2.5MS；叢芽誘導(dǎo)周期35～40天，繼代培養(yǎng)的周期為45～50天；5)生根培養(yǎng)，高度大于2cm的芽苗最為適合生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1.0mg/L NAA+2.0mg/L IBA+0.33MS大量元素+20.g/L蔗糖溶液+1.0MS微量元素+1.0MS維生素和氨基酸，生根培養(yǎng)的時(shí)間需要50～60天，對(duì)未生根的芽苗除去外層葉鞘后，進(jìn)行第二次生根培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃藤無性系組培繁殖方法，其特征是經(jīng)過生根培養(yǎng)后再進(jìn)行田間移植，將高度大于4cm、根長(zhǎng)度大于4cm，具有2片以上葉子的苗木移植至田間，適合黃藤組培苗移植的介質(zhì)有細(xì)沙、泥炭土和黃心土，也可以將三者按1∶1∶2的比例混合，作為黃藤組培苗的移植介質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃藤無性系組培繁殖方法，其特征是移植介質(zhì)以1/1000的高錳酸鉀溶液消毒，移植后每個(gè)星期用1/800的百菌清和多菌靈輪流噴施。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃藤無性系組培繁殖方法，其特征是施肥方法為1/1000的復(fù)合肥溶液每周噴施一次，移植后1～7天，95％的遮蔭網(wǎng)遮蔭，8～30天，85％的遮蔭網(wǎng)遮蔭，31～60天，70％的遮蔭網(wǎng)遮蔭，隨后采用50％遮蔭網(wǎng)遮蔭，一直管理到苗木出圃造林。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃藤無性系組培繁殖方法，其特征是在第4)步叢芽誘導(dǎo)和繼代增殖的培養(yǎng)基配方增加激素，激素成份為BA4.0mg/L+IBA0.25mg/L+2，4-D0.75mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃藤無性系組培繁殖方法，其特征是在第5)生根培養(yǎng)中將芽苗高度和大小接近的2～4個(gè)芽切分在同一小芽叢，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，移植后即可培育成叢芽苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及黃藤無性系組培繁殖方法，其特點(diǎn)是1)萌蘗芽外植體的采集，在采集萌蘗芽外植體的過程中防止芽體外傷和芽心的震裂，并使萌蘗芽外植體的高度為15－40cm；2)外植體的消毒，采用兩次消毒法，首先，用洗衣粉將外植體清洗干凈，第二步用0.1％升汞消毒1－2分鐘，無菌水漂洗3次；3)防止褐變，采用半光氨酸或抗壞血酸溶液泡洗前述萌蘗芽外植體；4)叢芽誘導(dǎo)與繼代增殖；5)生根培養(yǎng)，高度大于2cm的芽苗最為適合生根培養(yǎng)。本方法以萌蘗芽做外植體，可以繁殖經(jīng)過選育和測(cè)定的優(yōu)良無性系，生產(chǎn)的是良種的苗木，具有強(qiáng)大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，因而本技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1526278SQ0314690
公開日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月23日
發(fā)明者尹光天, 曾炳山, 裘珍飛, 李湘陽(yáng), 劉 英, 許煌燦 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所