專利名稱：一種防治松材線蟲的生物毒素及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治松材線蟲的生物毒素及制備方法，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域目前國內(nèi)外對(duì)松材線蟲尚無有效的藥劑及防治方法，一般情況下，發(fā)生了松材線蟲后都是采用保守控制方法，即將感病松樹砍伐并燒毀，以切斷傳播。而對(duì)植物寄生根結(jié)線蟲和胞囊線蟲有效的生物制劑，對(duì)松材線蟲則根本沒有活性。尋找對(duì)松材線蟲有效的防治方法和藥劑，已經(jīng)迫在眉睫。
本發(fā)明采用的真菌是Pseudohalonectria adversaria(ZD1)，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國.北京.中關(guān)村；保藏日期2003年5月26日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCC NO.0931。P.adversaria(ZD1)屬于水生真菌，系本發(fā)明人從大量水生真菌菌株中篩選出的一株對(duì)松材線蟲具有良好殺線蟲活性的菌株。
本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)Pseudohalonectria屬的真菌對(duì)松材線蟲都具有良好的殺蟲效果，從Pseudohalonectria屬中篩選確定了一株性狀最好的菌株P(guān)seudohalonectriaadversaria(ZD1)開展進(jìn)一步研究。本發(fā)明將ZD1菌株通過液體發(fā)酵和麥粒固體發(fā)酵后，提取具有殺松材線蟲活性的代謝產(chǎn)物，制備成生物殺線蟲毒素。
本發(fā)明真菌P.adversaria(ZD1)培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)液體培養(yǎng)基配方為1-4％大豆；1-5％葡萄糖；1-2％淀粉；0.1-0.5％酵母浸膏；0.2-1％氯化鈉；0.02-0.1％磷酸二氫鉀；0.02-0.1％硫酸鎂；0.1-0.6％碳酸鈣，余下為水。
麥粒固體培養(yǎng)基配方為0.2-1％碳酸鈣；1-3％大豆粉；0.2-1％硫酸氨；0.5-3％過磷酸鈣；小麥麥粒92％-96％。
本發(fā)明分為液體發(fā)酵提取水溶性殺線蟲生物毒素和麥粒固體發(fā)酵提取脂溶性殺線蟲生物毒素兩種方法。
液體發(fā)酵提取殺線蟲生物毒素的制備方法1、將ZD1的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，18-26℃下培養(yǎng)6-12天，獲得試管種；2、將試管種接種到250ml三角瓶(每瓶裝70ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為前述液體培養(yǎng)基配方，于20-30℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200-300rpm，培養(yǎng)時(shí)間5-8天。
3、將含菌絲的發(fā)酵液放入離心機(jī)中，3600轉(zhuǎn)離心20分鐘，過濾后得水溶性殺松材線蟲生物毒素。
麥粒固體發(fā)酵提取殺松材線蟲生物毒素的制備方法1、試管種培養(yǎng)方法與前述液體發(fā)酵生產(chǎn)方法1相同；2、采用前述麥粒固體培養(yǎng)基配方。將小麥用清水浸泡24小時(shí)后，撈起放入沸水中煮，以煮熟但皮不破為適。撈起濾水與輔料混合后裝入1000ml的三角瓶中，每瓶裝700ml，120℃滅菌30分鐘后，接入試管種，于22-26℃培養(yǎng)15-20天，直到菌絲長滿。
3、將已長滿菌絲的麥粒挖出，凍干，用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶劑浸提，浸提后濃縮，得總粗提物。將粗提物溶于少量二甲亞砜(DMSO)，再用一定濃度的吐溫-20(Tween-20)溶液溶解，得脂溶性殺松材線蟲生物毒素乳濁液。在該乳濁液中，二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％。
用液體發(fā)酵培養(yǎng)提取的主要是水溶性殺線蟲生物毒素，而用麥粒固體發(fā)酵生產(chǎn)提取的主要是脂溶性殺線蟲生物毒素。
本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)松材線蟲的藥效試驗(yàn)藥效試驗(yàn)11、試驗(yàn)用藥劑按液體培養(yǎng)方法生產(chǎn)殺線蟲生物毒素；以未接種的培養(yǎng)基3600轉(zhuǎn)離心20分鐘后過濾作為對(duì)照。
2、松材線蟲制備在100ml三角瓶中放入15g經(jīng)水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養(yǎng)4至7天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經(jīng)0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲，28℃培養(yǎng)15至20天。用無菌水將線蟲洗下，制成含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
3、試驗(yàn)方法取直徑6cm培養(yǎng)皿，滅菌后加入2ml試驗(yàn)用藥劑，然后加入20μl，線蟲懸浮液(300條)，置25℃培養(yǎng)，定時(shí)用解剖鏡檢查線蟲的死活，在生理刺激下線蟲無反應(yīng)則確定為線蟲死亡，根據(jù)死亡率計(jì)算出生物殺線蟲毒素的藥效。
以未接菌的培養(yǎng)基的浸提液作對(duì)照，每處理重復(fù)三次。
4、試驗(yàn)結(jié)果表1 液體發(fā)酵生物毒素對(duì)松材線蟲殺蟲效果



結(jié)果表明本發(fā)明產(chǎn)品水溶性生物殺線蟲毒素對(duì)松材線蟲有良好的殺蟲效果，其12小時(shí)平均死亡率達(dá)77.5％，最高達(dá)81.6％；48小時(shí)平均死亡率達(dá)87.4％，最高達(dá)89.3％，48小時(shí)平均藥效達(dá)87.1％。
藥效試驗(yàn)21、試驗(yàn)用藥劑麥粒固體培養(yǎng)基配方為1％碳酸鈣；3％大豆粉；0.5％硫酸氨；0.5％過磷酸鈣；小麥麥粒95％。按前述麥粒固體發(fā)酵提取殺松材線蟲生物毒素的制備方法制備試驗(yàn)用藥劑。
對(duì)照藥劑按前述麥粒固體發(fā)酵生產(chǎn)方法，但麥粒固體培養(yǎng)基中不接入試管種。
2、松材線蟲制備與藥效試驗(yàn)1相同。
3、試驗(yàn)方法與藥效試驗(yàn)1相同。
4、試驗(yàn)結(jié)果表2 粒麥固體發(fā)酵生物毒素對(duì)松材線蟲殺蟲效果

結(jié)果表明本發(fā)明脂溶性生物毒素對(duì)松材線蟲有良好的殺蟲效果，與水溶性物質(zhì)相比，其藥效產(chǎn)生較慢，在12小時(shí)和24小時(shí)藥效不顯著，36小時(shí)藥效顯著并超過水溶性生物毒素，死亡率達(dá)98％，顯示其良好的應(yīng)用開發(fā)前景。
再將試管種接種到250ml三角瓶中(每瓶裝70ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為2％大豆；2％葡萄糖；0.5％淀粉；0.2％酵母浸膏；0.4％氯化鈉；0.05％磷酸二氫鉀；0.05％硫酸鎂；0.2％碳酸鈣，余下為水；于22℃下?lián)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為250rpm，培養(yǎng)時(shí)間8天。
再將含菌絲的發(fā)酵液放入離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速為3600轉(zhuǎn)，時(shí)間為20分鐘，過濾后得水溶性殺松材線蟲生物毒素。
實(shí)施例二試管種培養(yǎng)方法與實(shí)施例一相同。
將試管種接種到麥粒固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為1％碳酸鈣；3％大豆粉；0.5％硫酸氨；0.5％過磷酸鈣；小麥麥粒95％。將小麥麥粒用清水浸泡24小時(shí)后，撈起放入煮沸的水中煮，以煮熟但皮不破為適，撈起濾水后與輔料混合后裝入1000ml的三角瓶中，每瓶裝700ml，120℃滅菌30分鐘后，接種后置于22℃培養(yǎng)20天。
然后將固體培養(yǎng)的菌株挖出，凍干，用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶劑浸提，浸提后濃縮，得總粗提物。將粗提物溶于少量二甲亞砜(DMSO)，再用一定濃度的吐溫-20(Tween-20)溶液溶解，得殺松材線蟲生物制劑乳濁液。在該乳濁液中，二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％。
實(shí)施例三基本同實(shí)施例二，不同之處是培養(yǎng)基配方，其配方為0.5％碳酸鈣；1％大豆粉；0.5％硫酸氨；2％過磷酸鈣；小麥麥粒96％。
實(shí)施例四基本同實(shí)施例二，不同之處是培養(yǎng)基配方，其配方為1％碳酸鈣；3％大豆粉；1％硫酸氨；3％過磷酸鈣；小麥麥粒92％。
權(quán)利要求
1.一種防治松材線蟲的生物毒素，由生產(chǎn)菌株及輔料按液體和麥粒固體培養(yǎng)后提取制備，其特征在于該生物毒素的生產(chǎn)菌株為Pseudohalonectria adversaria ZD1，ZD1菌株已于2003年5月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.0931。
2.一種防治松材線蟲的生物毒素的制備方法，由液體發(fā)酵和固體發(fā)酵制備，其特征在于2.1麥粒固體培養(yǎng)基配方為0.2-1％碳酸鈣、1-3％大豆粉、0.2-1％硫酸氨、0.5-3％過磷酸鈣、小麥麥粒92-96％；2.2麥粒固體發(fā)酵制備生物殺線蟲毒素的方法是，將長滿菌絲的麥粒挖出，凍干；用氯仿和甲醇，按1∶1比例配制成溶劑浸提，浸提后濃縮，得總粗提物，將粗提物溶于少量二甲亞砜，再用一定濃度的吐溫-20溶液溶解，得殺松材線蟲生物制劑乳濁液；在該乳濁液中，二甲亞砜的終濃度不超過3％，吐溫-20的終濃度不超過0.3％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治松材線蟲的生物毒素及制備方法，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本生物毒素的生產(chǎn)菌株P(guān)seudohalonectria adversaria(ZD1)已于2003年5月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.0931。ZD1通過液體和麥粒固體培養(yǎng)后，從代謝產(chǎn)物中提取有效的水溶和脂溶性物質(zhì)制備成殺線蟲生物毒素。本發(fā)明對(duì)松材線蟲有良好的毒殺效果，具良好的應(yīng)用開發(fā)前景。
文檔編號(hào)A01N63/04GK1468523SQ0313513
公開日2004年1月21日 申請(qǐng)日期2003年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月3日
發(fā)明者張克勤, 董瑾艷, 蔡磊, 趙智嫻 申請(qǐng)人:云南大學(xué)