專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提高哺乳動(dòng)物核移植胚胎早期發(fā)育率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)、胚胎工程與發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種提高哺乳動(dòng)物核移植(NT)胚胎早期發(fā)育率的方法。
背景技術(shù)：
核移植(Nuclear transfer，NT)是研究核質(zhì)互作關(guān)系中諸多重要問(wèn)題的最有效方法。應(yīng)用不同分化程度的細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞的方法，已經(jīng)在兩棲類(lèi)動(dòng)物獲得發(fā)育完全的個(gè)體。在最近的二十年期間，核移植方法在哺乳動(dòng)物中發(fā)展神速，并已開(kāi)始應(yīng)用于生產(chǎn)。
大量結(jié)果表明，在同種動(dòng)物之間，把中II期卵母細(xì)胞/受精卵作為受體細(xì)胞(供質(zhì)細(xì)胞)，把不同分化程度的細(xì)胞作為供核細(xì)胞，兩者所組成的重構(gòu)胚在移入寄母生殖道后，在牛、羊、豬、兔、猴、小鼠等多種動(dòng)物中均已獲得相應(yīng)的核移植后代；甚至把經(jīng)過(guò)修飾的體細(xì)胞作供核細(xì)胞，采用類(lèi)似的徑路，也相應(yīng)獲得轉(zhuǎn)基因的核移植牛、綿羊、山羊、豬、兔等。
但至今為止，獲得克隆動(dòng)物的成功仍然較低，一般為1-3％，其原因很多，如重排序、印跡等使NT胚胎的著床前、后的發(fā)育受到影響。其中，在體細(xì)胞克隆動(dòng)物制備過(guò)程中所使用的供核細(xì)胞需經(jīng)體外的長(zhǎng)期培養(yǎng)，尤其是經(jīng)過(guò)基因遺傳修飾(如隨機(jī)整合或定點(diǎn)打靶)的單克隆體細(xì)胞，隨著代次的增加，其染色體的變異等可能是影響NT的重排序及著床后發(fā)育的一個(gè)重要因素。因此，研究人員將體外培養(yǎng)的細(xì)胞(未饑餓)冷凍保存于液氮中，使用前再?gòu)?fù)蘇，培養(yǎng)數(shù)天后再使用，或?qū)Ⅲw外培養(yǎng)的細(xì)胞(饑餓)冷凍保存于液氮中，復(fù)蘇后直接用于核移植試驗(yàn)，但以上的研究表明，NT胚胎的著床前發(fā)育率一般仍較低。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)新的提高哺乳動(dòng)物核移植胚胎早期發(fā)育率的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種提高核移植胚胎早期發(fā)育率的方法。該方法不僅提高了核移植胚胎早期發(fā)育率，而且解決了核移植試驗(yàn)中供核細(xì)胞的使用與長(zhǎng)期保存，以及長(zhǎng)期培養(yǎng)對(duì)染色體變異等產(chǎn)生的影響，也解決了凍存細(xì)胞復(fù)蘇直接用于試驗(yàn)造成NT胚胎早期發(fā)育率低的缺點(diǎn)。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種提高非人哺乳動(dòng)物核移植胚胎早期發(fā)育率的方法，包括步驟(a)將非人哺乳動(dòng)物的供核細(xì)胞經(jīng)饑餓處理2-5天；(b)冷凍保存步驟(a)的供核細(xì)胞；(c)復(fù)蘇步驟(b)的供核細(xì)胞；(d)在非饑餓條件下培養(yǎng)步驟(c)的供核細(xì)胞2-5天(e)將步驟(d)的供核細(xì)胞饑餓處理1-4天；(f)將步驟(e)的供核細(xì)胞用于核移植。
在一優(yōu)選例中，所述的饑餓處理?xiàng)l件為含0.1-1％FCS的DMEM培養(yǎng)液。
在另一優(yōu)選例中，所述的非饑餓條件為含10-20％FCS的DMEM培養(yǎng)液。
在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動(dòng)物選自下組牛、羊、豬、狗、貓、兔、猴、小鼠。
在另一優(yōu)選例中，所述的供核細(xì)胞包括來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織、器官的細(xì)胞、體外培養(yǎng)的體細(xì)胞、及遺傳修飾過(guò)的體細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(f)包括將步驟(e)的供核細(xì)胞用作供核細(xì)胞，移入去除遺傳物質(zhì)的哺乳動(dòng)物的中II期卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)，經(jīng)電融合、化學(xué)激活后，將NT胚胎經(jīng)瓊脂糖包理后移入臨時(shí)寄母輸卵管內(nèi)或在體外培養(yǎng)、獲得早期發(fā)育的NT胚胎。較佳地，所述的電融合條件是0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mM MgSO4，在140-160V/mm，80μs條件下3次電刺激；然后，融合卵在以下條件下化學(xué)方法激活10μM伊屋諾霉素5分鐘+2μM 6-DMAP 3-6小時(shí)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種處理供核細(xì)胞的方法，包括步驟(a)將供核細(xì)胞經(jīng)饑餓處理2-5天；(b)冷凍保存步驟(a)的供核細(xì)胞；
(c)復(fù)蘇步驟(b)的供核細(xì)胞；(d)在非饑餓條件下培養(yǎng)步驟(c)的供核細(xì)胞2-5天(e)將步驟(d)的供核細(xì)胞饑餓處理1-4天，獲得供核細(xì)胞。
在本發(fā)明的一優(yōu)選例中，所述的供核細(xì)胞是非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。


圖1顯示了本發(fā)明方法的技術(shù)路線圖。
圖2貼壁生長(zhǎng)的(A)與懸浮的(B)經(jīng)基因打靶的單克隆山羊胎兒成纖維細(xì)胞。
圖3包理在瓊脂內(nèi)的發(fā)育的NT胚胎。箭頭所指為囊胚。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)在冷凍保存前對(duì)供核細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理，并且在復(fù)蘇后再次進(jìn)行饑餓處理，可以大幅提高核移植胚胎早期發(fā)育率。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明方法包括步驟將哺乳動(dòng)物的供核細(xì)胞經(jīng)饑餓處理2-5天后，再冷凍保存，使用前復(fù)蘇，在非饑餓培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-5天，再饑餓1-3天的細(xì)胞用作供核細(xì)胞，移入去除遺傳物質(zhì)的哺乳動(dòng)物的中II期卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)，經(jīng)電融合、化學(xué)激活后，將NT胚胎經(jīng)瓊脂糖包理后移入臨時(shí)寄母輸卵管內(nèi)或在體外培養(yǎng)、獲得較高的早期發(fā)育的NT胚胎。
本發(fā)明的核心步驟是對(duì)供核細(xì)胞的處理(包括哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的培養(yǎng))，它包括(i)首先，提供所需的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
根據(jù)所需克隆動(dòng)物的種類(lèi)和要求，用常規(guī)方法選擇組織或器官建立細(xì)胞系。一種常用的方法為將組織、器官或末分化細(xì)胞用胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，用DMEM或RM1640等培養(yǎng)液(加10-20％胎牛血清，F(xiàn)CS)培養(yǎng)，傳代，遺傳分析，或進(jìn)行遺傳修飾。
(ii)接著，將以上所有類(lèi)型的供核細(xì)胞，進(jìn)行饑餓處理。
饑餓處理的條件指血清濃度低于1％的培養(yǎng)條件，例如含0.1-1％或0.25-0.75％小牛血清(FCS)的DMEM液。饑餓處理時(shí)間通常為2-5天，較佳地為2-4天；然后，冷凍保存供核細(xì)胞。一種優(yōu)選的技術(shù)方案是在含0.5％FCS的培養(yǎng)液中，饑餓處理2-5天后。
冷凍保存可保存于-80℃冰箱中(短期)或在液氮中(長(zhǎng)期)。例如，在冷凍液(含20％DMSO、80％FCS液)冷凍保存于-80℃冰箱中，每支凍存管含1000-5000個(gè)細(xì)胞。
(iii)然后，復(fù)蘇冷凍保存的供核細(xì)胞，并在非饑餓條件下培養(yǎng)供核細(xì)胞。
復(fù)蘇采用常規(guī)方法，而非饑餓條件就是常規(guī)的培養(yǎng)條件，通常是血清濃度大于5％(如10-20％FCS)的培養(yǎng)條件。特別優(yōu)選的例子是含10％、15％或20％FCS的DMEM培養(yǎng)液。非饑餓條件下的培養(yǎng)時(shí)間通常為1-6天，較佳地為2-5天，具體時(shí)間根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的豐度而定，最佳的豐度為75％左右。
一種優(yōu)選的技術(shù)方案是在核移植試驗(yàn)前，將該細(xì)胞在37℃水浴中解凍，然后去除冷凍液，加入含10-20％的FCS的DMEM液，培養(yǎng)2-5天。
(iv)再次饑餓處理，獲得用于核移植試驗(yàn)的供核細(xì)胞。
再次饑餓處理的條件基本上與冷凍前的饑餓處理?xiàng)l件相同，即含0.1-1％(如0.5％)小牛血清(FCS)的DMEM液中培養(yǎng)。饑餓處理時(shí)間通常為1-4天，較佳地為1-3天。
一種優(yōu)選方法是是在含0.5％FCS的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2天，再饑餓1-4天，用胰蛋白酶消化成懸浮的細(xì)胞，即得到用于核移植試驗(yàn)的供核細(xì)胞。
除了對(duì)供核細(xì)胞的進(jìn)行至少兩次饑餓處理(即在冷凍保存前的饑餓處理和在冷凍復(fù)蘇后的饑餓處理)之外，制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的其他技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有區(qū)別。因此，本領(lǐng)域常規(guī)的各種制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)都可用于本發(fā)明。
為了人們更清楚地了解本發(fā)明，以下對(duì)包括制備卵母細(xì)胞、核轉(zhuǎn)移等相關(guān)技術(shù)也作一描述。
一、供質(zhì)(提供卵母細(xì)胞)母畜超數(shù)排卵技術(shù)(或應(yīng)用體外成熟卵母細(xì)胞)超數(shù)排卵是指采用制劑誘導(dǎo)動(dòng)物一次排出正常排卵數(shù)若干倍的方法。通過(guò)激素[孕馬血清促性激素(PMSG)；促卵泡激素(FSH)、促卵泡激素釋放因子(LRH)]處理，使母畜呈非季節(jié)性排卵，并且在一次排卵中，能排出較多的卵子。具體方法是每只動(dòng)物肌注氯前列烯醇(PG)0.06-0.1mg/次，間隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后開(kāi)始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg計(jì)(不同種動(dòng)物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時(shí)。間隔24小時(shí)發(fā)情時(shí)注射LRH，25ug/次，注射LRH后_28-30小時(shí)回收卵母細(xì)胞。
二、臨時(shí)寄母的激素處理(與NT胚胎發(fā)育同步)為與提供卵母細(xì)胞胞質(zhì)的供質(zhì)母羊同步，臨時(shí)寄母間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質(zhì)母羊超排注射PG前12小時(shí)，受體也同時(shí)注射PG，受體注射LRH的時(shí)間及劑量同供體。
三、卵母細(xì)胞的收集提供卵母細(xì)胞的母畜在注射LRH后26-30小時(shí)，進(jìn)行卵母細(xì)胞的收集。收集是通過(guò)手術(shù)的方法，在母畜的腹部作一切口，將母畜的輸卵管與卵巢暴露在體外，用沖卵液(F10+5％FCS)從輸卵管中沖出卵母細(xì)胞，將收集的卵母細(xì)胞培養(yǎng)在M16液中。
四、卵母細(xì)胞去核與移核將卵母細(xì)胞移入含CB的M2手術(shù)液中20分鐘后，將供核細(xì)胞與卵母細(xì)胞一同置于玻片上，在顯微鏡下，用持卵針固定卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞排出的極體處于鐘表3點(diǎn)位，去核針正對(duì)著或稍偏離極體去除極體與一部分胞質(zhì)。去核之后立即將1個(gè)供核細(xì)胞移入去核卵周隙內(nèi)，重復(fù)下一枚卵的操作，直至所卵母細(xì)胞操作完成后，將移入供核細(xì)胞的卵母細(xì)胞置于M16液培養(yǎng)30min。
五、融合與NT胚胎的激活將移入供核細(xì)胞的卵母細(xì)胞在激活液(0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mM MgSO4)中，在140-160V/mm，80μs電刺激三次，在M16液中培養(yǎng)30min，觀察是否融合。未融合的卵再融合一次。融合的NT胚胎在M16液中培養(yǎng)4-6小時(shí)，再用化學(xué)方法激活(10μM離子霉素，Ionomycin5分鐘+2μM 6-二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine，6-DMAP)4-6小時(shí))，激活后胚胎移入M16培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)或經(jīng)瓊脂糖包理后移入臨時(shí)寄母輸卵管內(nèi)培養(yǎng)。
六、重構(gòu)胚體內(nèi)培養(yǎng)應(yīng)用手術(shù)的方法，將激活后的NT胚胎用1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖包理后，吸入移卵管內(nèi)，從輸卵管喇叭口處插入將卵移進(jìn)輸卵管內(nèi)，隨后在輸卵管與子宮連接部用縫線結(jié)扎。在體內(nèi)培養(yǎng)4-7天后(不同種的動(dòng)物培養(yǎng)的時(shí)間不同)，剪下輸卵管，用培養(yǎng)液沖出胚胎，觀察胚胎發(fā)育情況。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1)顯著地提高NT胚胎的早期發(fā)育率。
2)解決了供核細(xì)胞的使用與長(zhǎng)期保存之間的矛盾，使長(zhǎng)期培養(yǎng)所造成的對(duì)染色體變異等產(chǎn)生的影響，以及凍存細(xì)胞復(fù)蘇后直接用于試驗(yàn)造成NT胚胎早期發(fā)育率低的缺點(diǎn)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1奶山羊體細(xì)胞的幾種處理方式對(duì)核移植胚胎早期發(fā)育的影響1材料與方法1.1.試劑均為胚胎級(jí)試劑，除另有說(shuō)明外均為Sigma產(chǎn)品。
1.2方法1.2.1供質(zhì)卵母細(xì)胞采集奶山羊應(yīng)用FSH按常規(guī)進(jìn)行超數(shù)排卵，在注射LRH后29-30小時(shí)，采用手術(shù)回收卵母細(xì)胞，用含5％小牛血清(FCS，Gibco)的F-10(Gibco)培養(yǎng)液沖洗輸卵管。收集卵母細(xì)胞，透明質(zhì)酸酶去除附著的顆粒細(xì)胞。收集的卵母細(xì)胞置于M16液中，37.5℃，5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.2.2供核細(xì)胞1.2.2.1薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞薩能奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞按照文獻(xiàn)[21]方法培養(yǎng)獲得。即從懷孕35天母山羊經(jīng)手術(shù)采集胎兒，去頭、四肢以及內(nèi)臟后，將其剪成泥狀，加入胰蛋白酶(0.25％Trypsin/1mM EDTA)，37℃，消化20min，接著加入含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，500g離心15min。棄去上清，將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液內(nèi)，接種至培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中，37℃、5％CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)豐度達(dá)85％后，按常規(guī)傳代培養(yǎng)。
1.2.2.2基因轉(zhuǎn)染、篩選與單克隆細(xì)胞株的建立將構(gòu)建好的基因載體與胎兒成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)染，篩選、鑒定，獲得定點(diǎn)整合的單克隆細(xì)胞株，將該細(xì)胞在含0.5％FCS培養(yǎng)液是饑餓處理72小時(shí)后，采用以下幾種處理方式后，用于核移植試驗(yàn)。
1.2.2.2試驗(yàn)分組試驗(yàn)分為三組，其中試驗(yàn)組I和II為對(duì)照，試驗(yàn)組II為本發(fā)明方法。
(a)試驗(yàn)組I將經(jīng)基因打靶的單克隆細(xì)胞，饑餓72h后，一部分細(xì)胞凍存于-80℃冰箱，試驗(yàn)前1小時(shí)復(fù)蘇，即用于試驗(yàn)；(b)試驗(yàn)組II另一部分細(xì)胞消化傳代，在含10％FCS的DMEM液，繼續(xù)培養(yǎng)2天后，再饑餓48h，豐度在70-85％時(shí)用于試驗(yàn)；(c)試驗(yàn)組III第三部分細(xì)胞饑餓72h后，凍存于-80℃冰箱，使用前四天復(fù)蘇，培養(yǎng)2-5天，再饑餓48小時(shí)，豐度在70-85％時(shí)用于試驗(yàn)。
除供核細(xì)胞的處理有差異外，其余操作均一致。
1.2.3重構(gòu)卵的構(gòu)建及其激活1.2.3.1重構(gòu)卵的構(gòu)建卵母細(xì)胞在M16-Hepes(含Hepes 2.8mg/ml，CB 7.5μg/ml)液中洗滌3次，在M16-Hepes中處理10min；同時(shí)將培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化、分散成單個(gè)細(xì)胞后立即加入小牛血清以終止消化，經(jīng)500g離心2min后，去除上清，加入20μlM16-Hepes液。將卵母細(xì)胞與供核體細(xì)胞同時(shí)移入M16-Hepes中，在顯微鏡下將卵母細(xì)胞核去除后隨即將供核細(xì)胞移入卵周隙。去、移核方法按照Wilmut I，Schnieke AE，McWhir J，Kind AJ，Campbell KHS.Viable offspring derived fromfetal and adult mammalian cells.Nature 1997；385810-813中所述的方法。
移入供核細(xì)胞的卵在M16培養(yǎng)液中洗滌3次，置于M16液中，37℃培養(yǎng)30min后，進(jìn)行電融合(0.3mM甘露醇、0.05mM CaCl2、0.1mM MgSO4、5％BSA)，融合條件為DC、140-160V/mm，脈沖持續(xù)時(shí)間為80μs，連續(xù)刺激三次。刺激后的卵置于M16培養(yǎng)液中培養(yǎng)20-30min觀察是否融合，融合卵為重構(gòu)卵；未融合的重復(fù)一次。
1.2.3.2重構(gòu)卵的激活重構(gòu)卵在M16液中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5小時(shí)后，用含5μM離子霉素、7.5μg/ml細(xì)胞松弛素B(CB)、不含Ca2+、Mg2+的M16-Hepes液處理5min，再在2mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-diethylaminopurine，6-DMAP)、7.5μg/mlCB、不含Ca2+、Mg2+的M16-Hepes培養(yǎng)液中培養(yǎng)4-5小時(shí)。激活后的重構(gòu)胚置于M16培養(yǎng)液中作短暫培養(yǎng)。
1.2.4重構(gòu)胚的體內(nèi)培養(yǎng)與發(fā)育的觀察應(yīng)用手術(shù)的方法，將激活后的NT胚胎用1％的低熔點(diǎn)瓊脂糖包理后，吸入移卵管內(nèi)，從輸卵管喇叭口處插入將卵移進(jìn)輸卵管內(nèi)，隨后在輸卵管與子宮連接部用縫線結(jié)扎。在體內(nèi)培養(yǎng)4-7天后，剪下輸卵管，用培養(yǎng)液沖出胚胎，觀察胚胎發(fā)育情況。
2.結(jié)果
2.1概況本次試驗(yàn)供投入羊數(shù)105頭，其中供質(zhì)羊數(shù)84頭，寄母羊21頭；平均每只供體羊經(jīng)超數(shù)排卵后獲9.3(785/84)枚，將卵細(xì)胞去核后再移入供核細(xì)胞，其移核率為92.3％(724/785)；移核卵經(jīng)電刺激后融合率為78.67％(426/541)；將融合卵經(jīng)瓊脂包埋后移入寄母輸卵管內(nèi)培養(yǎng)6天再回收，其回收率為86.69％(469/541)；回收卵發(fā)育至桑椹與囊胚期的比率為56.29％(264/469)；將發(fā)育的桑椹與囊胚期胚胎移入受體羊的子宮內(nèi)，共移124頭植受體，至35日齡時(shí)，受體羊的妊娠率為38.7％。詳見(jiàn)表1。
表1、定點(diǎn)整合體細(xì)胞克隆試驗(yàn)結(jié)果

2.2供核細(xì)胞的幾種處理方式對(duì)NT胚胎的早期發(fā)育的影響在試驗(yàn)組III中，應(yīng)用經(jīng)饑餓處理72小時(shí)，冷凍保存后，使用前復(fù)蘇，培養(yǎng)2-5天后，再饑餓24-48小時(shí)的供核細(xì)胞所組構(gòu)的NT胚胎的分裂率(89.70％、桑椹與囊胚的發(fā)育率(66.09％)，均顯著地高于試驗(yàn)組I(分裂率、桑椹與囊胚的發(fā)育率分別為70％、22.00％)與試驗(yàn)組II(分裂率、桑椹與囊胚的發(fā)育率分別為67.35％，50.51％)。
冷凍復(fù)蘇后直接用于試驗(yàn)的供核細(xì)胞所組構(gòu)的NT胚胎的分裂率及桑椹囊胚發(fā)育率最低，與其它兩試驗(yàn)組相比差異顯著。其原因可能是解凍復(fù)蘇后的細(xì)胞立即用于試驗(yàn)時(shí)，其細(xì)胞未能得到充分的恢復(fù)，影響了其在卵母細(xì)胞中的重排序，從而影響了NT胚胎的早期發(fā)育，而試驗(yàn)組III則完全避免了這點(diǎn)，具有很高的桑椹與囊胚的發(fā)育率，經(jīng)對(duì)移植受體的早期妊娠檢查，結(jié)果有近40％的受體妊娠。這表明，雖然具有很高的桑椹與囊胚的發(fā)育率，但仍不影響早期發(fā)育胚胎的著床。雖然試驗(yàn)組II的NT胚胎的早期發(fā)育率高于試驗(yàn)I，但隨著細(xì)胞在體外的傳代次數(shù)的增加(本身已為單克隆細(xì)胞株，其代次已很高)，其細(xì)胞體積增大，染色體發(fā)生的變異的幾率也隨著增加。因此，試驗(yàn)組III還具有一非常重要的優(yōu)點(diǎn)，即是解決了細(xì)胞在體外的長(zhǎng)期培養(yǎng)所造成的染色體變異的影響，能長(zhǎng)期保存，在使用時(shí)復(fù)蘇少量細(xì)胞(如四孔板中的四孔)，一次可用于四次試驗(yàn)，下批試驗(yàn)再?gòu)?fù)蘇少量細(xì)胞即可。
表2.供核細(xì)胞經(jīng)不同處理后對(duì)NT胚胎的早期發(fā)育的影響

未分裂率＝(1細(xì)胞數(shù)+瓦解數(shù)+空秀明帶)/回收卵總數(shù)a:b，a:c，P＜0.01，b:c P＜0.05；注表1是整個(gè)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，表2是三個(gè)試驗(yàn)組分開(kāi)統(tǒng)計(jì)的。
3、結(jié)論1)饑餓后的供核細(xì)胞經(jīng)冷凍保存后，復(fù)蘇培養(yǎng)2-5天后，再進(jìn)行饑餓處理后作供核細(xì)胞，能顯著地提高NT胚胎的早期發(fā)育率(66.09％)。
2)解決了供核細(xì)胞的使用與長(zhǎng)期保存之間的矛盾，使長(zhǎng)期培養(yǎng)所造成的對(duì)染色體變異等產(chǎn)生的影響，以及凍存細(xì)胞復(fù)蘇后直接用于試驗(yàn)造成NT胚胎早期發(fā)育率低的缺點(diǎn)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
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1.一種提高非人哺乳動(dòng)物核移植胚胎早期發(fā)育率的方法，其特征在于，包括步驟(a)將非人哺乳動(dòng)物的供核細(xì)胞經(jīng)饑餓處理2-5天；(b)冷凍保存步驟(a)的供核細(xì)胞；(c)復(fù)蘇步驟(b)的供核細(xì)胞；(d)在非饑餓條件下培養(yǎng)步驟(c)的供核細(xì)胞2-5天(e)將步驟(d)的供核細(xì)胞饑餓處理1-4天；(f)將步驟(e)的供核細(xì)胞用于核移植。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的饑餓處理?xiàng)l件為含0.1-1％FCS的DMEM培養(yǎng)液。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非饑餓條件為含10-20％FCS的DMEM培養(yǎng)液。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動(dòng)物選自下組牛、羊、豬、狗、貓、兔、猴、小鼠。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所術(shù)的方法，其特征在于，所述的供核細(xì)胞包括來(lái)自哺乳動(dòng)物的組織、器官的細(xì)胞、體外培養(yǎng)的體細(xì)胞、及遺傳修飾過(guò)的體細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(f)包括將步驟(e)的供核細(xì)胞用作供核細(xì)胞，移入去除遺傳物質(zhì)的哺乳動(dòng)物的中II期卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)，經(jīng)電融合、化學(xué)激活后，將NT胚胎經(jīng)瓊脂糖包理后移入臨時(shí)寄母輸卵管內(nèi)或在體外培養(yǎng)、獲得早期發(fā)育的NT胚胎。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所術(shù)的制備方法，其特征在于，電融合條件是0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mM MgSO4，在140-160V/mm，80μs條件下3次電刺激；然后，融合卵在以下條件下化學(xué)方法激活10μM伊屋諾霉素5分鐘+2μM 6-DMAP 3-6小時(shí)。
8.一種處理供核細(xì)胞的方法，其特征在于，包括步驟(a)將供核細(xì)胞經(jīng)饑餓處理2-5天；(b)冷凍保存步驟(a)的供核細(xì)胞；(c)復(fù)蘇步驟(b)的供核細(xì)胞；(d)在非饑餓條件下培養(yǎng)步驟(c)的供核細(xì)胞2-5天(e)將步驟(d)的供核細(xì)胞饑餓處理1-4天，獲得供核細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的供核細(xì)胞是非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高非人哺乳動(dòng)物核移植胚胎早期發(fā)育率的方法，包括步驟(a)將非人哺乳動(dòng)物的供核細(xì)胞經(jīng)饑餓處理2－5天；(b)冷凍保存供核細(xì)胞；(c)復(fù)蘇；(d)在非饑餓條件下培養(yǎng)供核細(xì)胞2－5天(e)將供核細(xì)胞饑餓處理1－4天；(f)將供核細(xì)胞用于核移植。該方法不僅能提高胚胎發(fā)育率，還解決了核移植試驗(yàn)中帶有定點(diǎn)整合的供核細(xì)胞使用與長(zhǎng)期保存，以及長(zhǎng)期培養(yǎng)對(duì)染色體變異等產(chǎn)生的影響。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1500384SQ02145298
公開(kāi)日2004年6月2日 申請(qǐng)日期2002年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月15日
發(fā)明者成國(guó)祥, 陳建泉 申請(qǐng)人:上海杰隆生物工程股份有限公司