專利名稱：耐鹽基因mgx的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因耐鹽抗旱植物，更具體地說轉(zhuǎn)基因西紅柿、油菜、煙草等耐鹽抗旱植物。
世界各國多年來投入了大量的人力和資金，對(duì)自然界中的鹽生植物進(jìn)行了大量的研究，企圖通過了解這些喜鹽植物的抗鹽機(jī)理，來解決耕地的鹽化及干旱地區(qū)的生態(tài)建設(shè)問題。研究發(fā)現(xiàn)，這些天然的鹽生植物，大致通過以下方式在鹽化的土地上生存1.植物具有特殊的根系，在攝取土壤中的養(yǎng)份時(shí)，根系不吸取過多的鹽份，將鹽離子保留在土壤中，不吸收到植物體內(nèi)；2.植物的葉片形成特殊的一種叫鹽腺的結(jié)構(gòu)，將其體內(nèi)過多的鹽份排到體外；3.在植物體細(xì)胞內(nèi)將鹽份區(qū)域化到特定的區(qū)域，如液泡內(nèi)。
以上第一種方式?jīng)]有多大的應(yīng)用研究價(jià)值，因?yàn)橹参锊晃胀寥乐械柠}份繼續(xù)保留在土壤內(nèi)，從而土地?zé)o法脫鹽；第二種機(jī)理涉及植物體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生理代謝，十分復(fù)雜，至今仍無重大進(jìn)展；第三種機(jī)理最具有應(yīng)用研究價(jià)值，但一直未能找到相關(guān)的抗鹽基因。一直到2001年，本人把從擬南芥菜中克隆的一個(gè)相關(guān)的基因(AtNHX1)在西紅柿及油菜中表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)基因西紅柿及油菜可以在相當(dāng)于三分之一海水鹽濃度的情況下正常生長，轉(zhuǎn)基因抗鹽作物才宣告誕生(詳見相關(guān)論文1.Hong-xia Zhang and EduardoBlumwald，(2001)Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulatesalt in foliage but not in fruit.Nature Biotechnology.19(8)765-768；2.Hong-xia Zhang，Joanna N.Hodson，John P.William and EduardoBlumwald(2001)Engineering salt tolerant Brassica plantsCharacterization of yield and seed oil quality in transgenic plantswith increased vacuolar sodium accumulation.Proceedings of theNational Academy of Sciences，USA98(22)12832-12836)。
本發(fā)明涉及的科學(xué)術(shù)語如下△“轉(zhuǎn)基因”，系指導(dǎo)入植物個(gè)體的一段外源的雙鏈脫氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以游離在染色體外，也可以整合到染色體的基因組上；可以通過生殖過程傳遞到后代，也可以不傳遞到后代。外源基因可以是從任何生物基因組中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在體外擴(kuò)增的。
△“類似基因”，系指任何同MGX4的DNA編碼序列中任何區(qū)域同源性在40％以上的DNA片段，或任何DNA片段，其編碼的氨基酸序列同MGX4編碼的氨基酸序列中任何區(qū)域有40％以上的同源律。類似基因(DNA)片段可以是從任何生物基因組中克隆的，也可以是人工合成或用PCR在體外擴(kuò)增的。
△“基因片段”，系指長度在300個(gè)堿基對(duì)(bp)以上的同MGX4的DNA序列中的任何域區(qū)同源律在40％以上的任何DNA片段，或任何編碼100個(gè)氨基酸以上的DNA片段，其編碼的氨基酸序列同MGX4編碼的氨基酸序列中的任何區(qū)域同源性在40％以上。該基因片段可以是從任何生物基因組中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在體外擴(kuò)增的。
△“植物”系指整個(gè)植物界包括低等植物、高等植物、藻類以及任何利用光合作用生存的水生物，主要包括光合水生物、藻類、厥類、裸子植物(松、柏等)、被子植物(蔬菜、糧食作物、油料作物、藥用植物、苗木、花卉、苗木包括所有木本植物)。
△“抗逆植物”，指任何具有抗鹽、抗旱、抗寒、抗熱、抗蟲等特性的植物。
本發(fā)明將MGX4基因(序列附后)在西紅柿中表達(dá)后，使轉(zhuǎn)基因西紅柿可以在相當(dāng)于二分之一海水鹽濃度的營養(yǎng)液中正常生長并結(jié)出果實(shí)，其抗鹽性比已發(fā)表的表達(dá)擬南芥菜ATNHX1基因的轉(zhuǎn)基因西紅柿更好，同時(shí)本研究中還將MGX4基因在煙草中表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因煙草可以在相當(dāng)于三分之一海水鹽濃度的培養(yǎng)基上萌發(fā)，并在相當(dāng)于海水鹽濃度的土壤中正常生長。
將該MGX4抗鹽基因，裝配于強(qiáng)力組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒35S強(qiáng)力啟動(dòng)子(CaMV35S)之下，構(gòu)建成可以在植物中表達(dá)的載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，使該基因在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)大量表達(dá)，使該基因編碼的蛋白(Na+-H+交換泵)的含量大幅度提高，將細(xì)胞液中的鈉離子“包裝”到液胞內(nèi)，從而使轉(zhuǎn)基因植物獲得耐鹽抗旱的特性。本發(fā)明的關(guān)鍵是克隆到了抗鹽基因并將其在目的植物中大量表達(dá)。由于擬南芥菜并非喜鹽植物，為研究開發(fā)性能更好的抗鹽轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明以海生植物紅樹為材料，克隆到抗鹽基因MGX4，該基因編碼的蛋白為Na+-H+交換泵，該蛋白定位在植物細(xì)胞內(nèi)的液泡膜上，其功能為將細(xì)胞液中的鈉離子轉(zhuǎn)移到液泡中，而將液泡內(nèi)的氫離子交換到液泡外的細(xì)胞液中，從而使植物吸收的大量鹽份(Na+)區(qū)域化到液泡內(nèi)，而細(xì)胞液中Na+的含量保持在較低的水平，各種生理代謝活動(dòng)可以正常進(jìn)行，因此表達(dá)該基因的植物體具有抗鹽特性。MGX4基因的序列如下agctcgattgcgtttggtgatatcacatcgtcgaaaacgattacacctcatcgtgtgata 600atgagtctgggtattggagtccttctcaaatccggcggggcgtcggtctcgaaacacgac 120M S L G I G V L L K S G G A S V S K X D 20ctaatcgtctcggtcaacatctggatcgcgctggcatgcagctgcattgtcatcaaccac 180L I V S V N I W I A L A C S C I V I N H 40ttgctggatgggaaccgatggctgaacgagtccgccaccgcgcttgtcatgcaactctta 240L L D G N R W L N E S A T A L V M Q L L 60accacaggcgtcatcctgatcgttactaatgggacaaactcacgcattgttgtgtggaac 300T T G V I L I V T N G T N S R I V V W N 80gaggacctgtttttcatatatatacttccgccgttaatcttcaatgtcgggtttcaagta 360E D L F F I Y I L P P L I F N V G F Q V 100aagagaaagcaatggttccgcaactttatacagattattttgttttccgctattagtact 420K R K Q W F R N F I Q I I L F S A I S T 120ctgattggctttgtagcaatctctctttctgcttgtgggttgttcaagaaaatcgatgtt 480L I G F V A I S L S A C G L F K K T D V 140ggtccaatcgagcttgggaaatatgttgcaattactgctcttttcggggcaacagagact 540G P I E L G K Y V A I T A L F G A T E T 160ctttgcaacttacaggtgcttaaccagcatgaaacacccgtactctatagtatcgtttgg 600L C N L Q V L N Q H E T P V L Y S I V W 180tcggaaggtctagttaatgaagccacaaccgttctactcttcaatgtcattgataacatc 660S E G L V N E A T T V L L F N V I D N I 200cacattgataattttgaagctattgttgtcttgcaattcgtctctcgatttatttacgta 720H I D N F E A I V V L Q F V S R F I Y V 220ttctggaccagcaacatacttactgtagctggtgggttggcaagtgcatacgtaatcgat 780F W T S N I L T V A G G L A S A Y V I D 240gaactcccatttgccgatcataacactgatagaaaggtttctgtaatgatagcaatggca 840E L P F A D H N T D I K V S V M I A M A 260tacgcttcatacatggcgtcaatgctgatagacctgtacggaattcttgatgtcttctgg 900Y A S Y M A S M L I D L Y G I L D V F W 280cctggaatagtatgttcacattactcctggcatcaagtgacagaaggatttaaagttacc 960P G I V C S H Y S W H Q V T E G F K V T 300aacaagcattcatttgtaactttaggattcattatcgaactattcctctggctctatgtt 1020N K H S F V T L G F I I E L F L W L Y I 320aacatggatatattggacctagaggactggagattagctagtcagagtcctaagagacca 1080N N D I L D L E D W R I A T Q S P K R P 340attctgttaactgcatttattttgacattggttatgattggaagagtcgcatttatattc 1140I L L T A F I L T L V M I G R V A F I F 360cctttgaatttcgcatccaccctacaaaaaagggacgccgatccaagaatcaacttcgaa 1200P L N F A S T L Q K R D A D P R I N F E 380acacaactaatcttatggttcgctagtctcatcagaggagcaatttcagttgcggttctt 1260T Q L I L W F A S L I R G A I S V A V L 400tataccaagtttaacgcaactggtcactctgaaatccgactcaatgtcatcatgttaacc 1320Y S K F N A T G H S E I R L N V I M L T 420agcacacttattgttattctattcggcacaatggctttcaacctggtgacgcgcccggta 1380S T L I V I L F G T M A F N L V T R P V 440gcaagtatcctcctcccaccagacactggactgtcaacgggttctctggtctcacaacag 1440A S I L L P P D T G L S T G S L V S Q Q 460actatgctggacccaatccttactggcatgatcgggtctgagtttgatgtagggacgatc 1500T M L D P I L T G M I G S E F D V G T I 480acctcccctcaatacaccctccagttccttctcggcgcgccagctcgcaccgtccataaa 1560S S P Q Y T L Q F L L G A P A R T V H K 500gtttgggacaagtgggacgagcggttcatgcacccggtgttcggggggaaaggtttcgcc 1620V W D K W D E R F M H P V F G C K G F A 520ccctttctccctggtacgccggcggagaggactgtccctaaatctcacgtgggcaacgtg 1680P F L P G T P A E R T V P K S H V G N V 540Acggacgcttatggcagtatcgacctagctttcctctgattcctggataaataatgttca 1740T D A Y G S I D L A F L * 552本發(fā)明包括如下步驟1.構(gòu)建可以在植物中強(qiáng)力表達(dá)的基因表達(dá)載體；2.借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，經(jīng)上述基因表達(dá)載體導(dǎo)入被轉(zhuǎn)化的植物染色體基因組內(nèi)，并在安裝于抗鹽基因MGX4上游的強(qiáng)力組成型表達(dá)啟動(dòng)子的帶動(dòng)下，在轉(zhuǎn)基因植物中大量表達(dá)；3.對(duì)第一代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行DNA(Southern Blots)，RNA(Northern Blots)及蛋白(Western Blots)分析，并檢測(cè)其抗鹽性能；4.對(duì)上述蛋白分析呈陽性的第一代個(gè)體進(jìn)行繼代繁殖，并分析其后代(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4)中Na+-H+交換泵的含量及個(gè)體的抗鹽性；5.對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行中試及大田試驗(yàn)，并申請(qǐng)通過國家相關(guān)部門的品種鑒定。
本發(fā)明以海生植物紅樹為材料，將其中可以使植物體內(nèi)的鹽份區(qū)域化到液泡內(nèi)的抗鹽基因克隆出來。具體操作如下1.將1個(gè)月紅樹幼苗分別用50mM NaCl及300mM NaCl澆灌2周，每周2次，分別從嫩葉中提取mRNA(詳細(xì)方法見CLONTECH，extract-N-RNA kit說明書)，用差異顯示(differential display)的方法，共分離出79個(gè)只在300mM NaCl處理后的紅樹幼苗中大量表達(dá)的DNA片段。
2.對(duì)這些片段進(jìn)行序列分析后，共選擇出6個(gè)可能與抗鹽基因相關(guān)的片段做探針，從用300mMNaCl處理后的紅樹幼苗構(gòu)建的cDNA文庫中克隆出全序列，其中只有MGX4編碼的蛋白為膜蛋白，并同擬南芥菜中克隆出的ATNHX1基因有一定的同源性?？果}基因MGX4同擬南芥菜AtNHX1基因具有大約55％的同源性1 atgagtctgggtattggagtccttctcaaatccggcggggcgtcggtctc 50|| || ||||| ||| ||1 ......atgttggattctctagtgtcgaaactgccttcgttatcgacatc 44. . . . .51 gaaacacgacctaatcgtctcggtcaacatctggatcgcgctggcatgca 100| |||| | || || | || ||| | || ||||45 tgatcacgcttctgtggttgcgttgaatctctttgttgcacttctttgtg 94.. . . .101 gctgcattgtcatcaaccacttgctggatgggaaccgatggctgaacgag 150|| ||||| ||| | |||| | ||| ||||| |||||||95 cttgtattgttcttggtcatcttttggaagagaatagatggatgaacgaa 144. . . . .151 tccgccaccgcgcttgtcatgcaactcttaaccacaggcgtcatcctgat 200||| |||||| | | |||||||||| || |145 tccatcaccgccttgttgattgggctaggcactggtgttaccattttgtt 194. . . . .201 cgttactaatgggacaaactcacgcattgttgtgtggaacgaggacctgt 250||| ||| || | || ||| | || | || | | || || || |195 gattagtaaaggaaaaagctcgcatcttctcgtctttagtgaagatcttt 244. . . . .251 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GVILISbjct185 LKYTGLAVSDHDSIVAINIFIALLCGCIVFGHLLEGNRWVNESTTALVLGLITGGVILIC 364Query205 TNGTNSRIVVWNEDLFFIYILPPLIFNVGFQVKRKQWFRNFIQIILFSAISTLIGFVAIS 384T G NSRI++++ED+FFIY+LPP+IFN GFQVK+KQ+FRNF IILF A TLI FV I+Sbjct365 TKGVNSRILIFSEDIFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRNFATIILFGAAGTLISFVIIT 544Query385 LSACGLFKKIDVGPIELGKYVAITALFGATETLCNLQVLNQHETPVLYSIVWSEGLVNEA 564A GLF K+DVGP+ELG Y+AI A+F AT+++C LQVLNQ E P+LYS+V+ EG+VN+ASbjct545 FGAMGLFSKLDVGPLELGDYLAIGAIFSATDSVCTLQVLNQDEAPLLYSLVFGEGVVNDA 724Query565 TTVLLFNVIDNIHIDNFEAIVVLQFVSRFIYVFWTSNILTVAGGLASAYVIDELPFADHN 744T+V+LFN I NI I++F+ V+LQF+ +F+Y+F+TS +L VA GL SAY+I +L FA H+Sbjct725 TSVVLFNAIQNIDINHFDVFVLLQFIGKFLYLFFTSTVLGVAAGLLSAYIIKKLCFARHS 904Query745 TDRKVSVXXXXXXXXXXXXXLIDLYGILDVFWPGIVCSHYSWHQVTEGFKVTNKHSFVTL 924TDR+V++ L+DL GIL VF+ GIV SHY+WH VTE +VT KH+F TLSbjct905 TDREVAIMILMAYLSYMLSMLLDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTESSRVTTKHTFATL 1084Query925 GFIIELFLWLYVNMDILDLEDWRLASQSPKRPILLTAFILTLVMIGRVAFIFPLNFASTL 1104FI E+FL+LYV MD LD++ W+LAS SPK+PI L+A IL LVM+GR AF+FPL+F S LSbjct1085 SFIAEIFLFLYVGMDALDIDKWKLASSSPKKPIALSAVILGLVMVGRAAFVFPLSFLSNL 1264Query1105 QKRDADPRINFETQLILWFASLIRGAISVAVLYTKFNATGHSEIRLNVIMLTSTLIVILF 1284K+++ P+I+F Q+I+W+A L+RGA+S+A+ Y KF +GH+ +R+N +M+TST+IV+LFSbjct1265 SKKESHPKISFNGGVIIWWAGLMRGAVSIALAYNKFTTSGHTAVRVNAVMITSTIIVVLF 1444Query1285 GTMAFNLVTRPVASILLPPDTG 1350TM F L+T+P+ ++L+PP GSbjct1445 STMVFGLLTKPLINLLIPPRPG 1510將該MGX4抗鹽基因，裝配于強(qiáng)力組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒35S強(qiáng)力啟動(dòng)子(CaMV35S)之下，構(gòu)建成可以在植物中表達(dá)的載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，使該基因在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)大量表達(dá)，使該基因編碼的蛋白(Na+-H+交換泵)的含量大幅度提高，將細(xì)胞液中的鈉離子“包裝”到液胞內(nèi)，從而使轉(zhuǎn)基因植物獲得耐鹽抗旱的特性。本發(fā)明的關(guān)鍵是克隆到了抗鹽基因并將其在目的植物中大量表達(dá)。由于擬南芥菜并非喜鹽植物，為研究開發(fā)性能更好的抗鹽轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明以海生植物紅樹為材料，克隆到抗鹽基因MGX4，該基因編碼的蛋白為Na+-H+交換泵，該蛋白定位在植物細(xì)胞內(nèi)的液泡膜上，其功能為將細(xì)胞液中的鈉離子轉(zhuǎn)移到液泡中，而將液泡內(nèi)的氫離子交換到液泡外的細(xì)胞液中，從而使植物吸收的大量鹽份(Na+)區(qū)域化到液泡內(nèi)，而細(xì)胞液中Na+的含量保持在較低的水平，各種生理代謝活動(dòng)可以正常進(jìn)行，因此表達(dá)該基因的植物體具有抗鹽特性。植物表達(dá)載體pHXZ的構(gòu)建將該基因的編碼序列同強(qiáng)力組成型表達(dá)啟動(dòng)子35S融合，構(gòu)建成植物表達(dá)載體pHXZ，具體操作如下將植物二元表達(dá)載體pBI121首先用限制性內(nèi)切酶SstI消化后，用T4DNA聚合酶切成平頭，再用限制性內(nèi)切酶SalI切割，將載體上原有的GUS基因切去，將載體純化后回收；同時(shí)，將MGX4抗鹽基因同樣用SalI消化，再用Smal酶切，然后將其用T4DNA連接酶同回收的載體連接，得到植物表達(dá)載體pHXZ。
2、本發(fā)明從紅樹中克隆到MGX4的基因，該基因的編碼蛋白質(zhì)為Na+-H+交換泵，其功能為將細(xì)胞液中的鈉離子轉(zhuǎn)移到液泡中，而將液泡內(nèi)的氫離子交換到液泡外的細(xì)胞液中，從而使植物吸收的大量鹽份(Na+)區(qū)域化到液泡內(nèi)，而細(xì)胞液中Na+的含量保持在較低的水平，各種生理代謝活動(dòng)可以正常進(jìn)行，因此表達(dá)該基因的植物體具有抗鹽特性。采用這種機(jī)理使細(xì)胞液中Na+的含量保持低水平，可以使各種生理代謝活動(dòng)得以正常進(jìn)行，是較為理想的除鹽方法之一。
序列表(1)一般信息(i)發(fā)明名稱耐鹽基因MGX4及它的耐鹽抗旱植物品種的培育方法(ii)序列數(shù)目2(2)序列SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1837bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ii)序列描述SEQ NO11 agctcgattgcgtttggtgatatcacatcgtcgaaaacgattacacctcatcgtgtgata61 atgagtctgggtattggagtccttctcaaatccggcggggcgtcggtctcgaaacacgac121 ctaatcgtctcggtcaacatctggatcgcgctggcatgcagctgcattgtcatcaaccac181 ttgctggatgggaaccgatggctgaacgagtccgccaccgcgcttgtcatgcaactctta241 accacaggcgtcatcctgatcgttactaatgggacaaactcacgcattgttgtgtggaac301 gaggacctgtttttcatatatatacttccgccgttaatcttcaatgtcgggtttcaagta361 aagagaaagcaatggttccgcaactttatacagattattttgttttccgctattagtact421 ctgattggctttgtagcaatctctctttctgcttgtgggttgttcaagaaaatcgatgtt481 ggtccaatcgagcttgggaaatatgttgcaattactgctcttttcggggcaacagagact541 ctttgcaacttacaggtgcttaaccagcatgaaacacccgtactctatagtatcgtttgg601 tcggaaggtctagttaatgaagccacaaccgttctactcttcaatgtcattgataacatc661 cacattgataattttgaagctattgttgtcttgcaattcgtctctcgatttatttacgta721 ttctggaccagcaacatacttactgtagctggtgggttggcaagtgcatacgtaatcgat781 gaactcccatttgccgatcataacactgatagaaaggtttctgtaatgatagcaatggca841 tacgcttcatacatggcgtcaatgctgatagacctgtacggaattcttgatgtcttctgg901 cctggaatagtatgttcacattactcctggcatcaagtgacagaaggatttaaagttacc961 aacaagcattcatttgtaactttaggattcattatcgaactattcctctggctctatgtt1021 aacatggatatattggacctagaggactggagattagctagtcagagtcctaagagacca1081 attctgttaactgcatttattttgacattggttatgattggaagagtcgcatttatattc1141 cctttgaatttcgcatccaccctacaaaaaagggacgccgatccaagaatcaacttcgaa1201 acacaactaatcttatggttcgctagtctcatcagaggagcaatttcagttgcggttctt1261 tataccaagtttaacgcaactggtcactctgaaatccgactcaatgtcatcatgttaacc1321 agcacacttattgttattctattcggcacaatggctttcaacctggtgacgcgcccggta1381 gcaagtatcctcctcccaccagacactggactgtcaacgggttctctggtctcacaacag1441 actatgctggacccaatccttactggcatgatcgggtctgagtttgatgtagggacgatc1501 acctcccctcaatacaccctccagttccttctcggcgcgccagctcgcaccgtccataaa1561 gtttgggacaagtgggacgagcggttcatgcacccggtgttcggggggaaaggtttcgcc1621 ccctttctccctggtacgccggcggagaggactgtccctaaatctcacgtgggcaacgtg1681 Acggacgcttatggcagtatcgacctagctttcctctgattcctggataaataatgttca1741 ttacttcatcgataaatttcttgcttcaagatttattttcatataaaaaaacggaaaaat1801 tcgctatagactacgcaaaaaaaaaaaagggcgccga(3)序列SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度552AA(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(ii)序列描述SEQ NO21 M S L G I G V L L K S G G A S V S K X D21 L I V S V N I W I A L A C S C I V I N H41 L L D G N R W L N E S A T A L V M Q L L61 T T G V I L I V T N G T N S R I V V W N81 E D L F F I Y I L P P L I F N V G F Q V101 K R K Q W F R N F I Q I I L F S A I S T121 L I G F V A I S L S A C G L F K K I D V141 G P I E L G K Y V A I T A L F G A T E T161 L C N L Q V L N Q H E T P V L Y S I V W181 S E G L V N E A T T V L L F N V I D N I201 H I D N F E A I V V L Q F V S R F I Y V221 F W T S N I L T V A G G L A S A Y V I D241 E L P F A D H N T D I K V S V M I A M A261 Y A S Y M A S M L I D L Y G I L D V F W281 P G I V C S H Y S W H Q V T E G F K V T301 N K H S F V T L G F I I E L F L W L Y I321 N N D I L D L E D W R I A T Q S P K R P341 I L L T A F I L T L V M I G R V A F I F361 P L N F A S T L Q K R D A D P R I N F E381 T Q L I L W F A S L I R G A I S V A V L401 Y S K F N A T G H S E I R L N V I M L T421 S T L I V I L F G T M A F N L V T R P V441 A S I L L P P D T G L S T G S L V S Q Q461 T M L D P I L T G M I G S E F D V G T I481 S S P Q Y T L Q F L L G A P A R T V H K501 V W D K W D E R F M H P V F G C K G F A521 P F L P G T P A E R T V P K S H V G N V541 T D A Y G S I D L A F L *
權(quán)利要求
1.一種用耐鹽基因MGX4培育耐鹽植物的方法包括耐鹽基因MGX4用該基因的編碼序列與強(qiáng)力組成型表達(dá)啟動(dòng)子35S融合，拼建成植物表達(dá)載體pHXZ，將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，感染植物子葉或植物外植體，共培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將再生的轉(zhuǎn)基因幼苗切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，有根幼苗轉(zhuǎn)移到土壤栽培得耐鹽植物新品種。
2.根椐權(quán)利要求1所述用耐鹽基因MGX4培養(yǎng)耐鹽植物的方法其特征在于帶有耐鹽基因MGX4的核苷酸序列為agctcgattgcgtttggtgatatcacatcgtcgaaaacgattacacctcatcgtgtgata 600atgagtctgggtattggagtccttctcaaatccggcggggcgtcggtctcgaaacacgac 120M S L G I G V L L K S G G A S V S K X D 20ctaatcgtctcggtcaacatctggatcgcgctggcatgcagctgcattgtcatcaaccac 180L I V S V N I W I A L A C S C I V I N H 40ttgctggatgggaaccgatggctgaacgagtccgccaccgcgcttgtcatgcaactctta 240L L D G N R W L N E S A T A L V M Q L L 60accacaggcgtcatcctgatcgttactaatgggacaaactcacgcattgttgtgtggaac 300T T G V I L I V T N G T N S R I V V W N 80gaggacctgtttttcatatatatacttccgccgttaatcttcaatgtcgggtttcaagta 360E D L F F I Y I L P P L I F N V G F Q V 100aagagaaagcaatggttccgcaactttatacagattattttgttttccgctattagtact 420K R K Q W F R N F I Q I I L F S A I S T 120ctgattggctttgtagcaatctctctttctgcttgtgggttgttcaagaaaatcgatgtt 480L I G F V A I S L S A C G L F K K I D V 140ggtccaatcgagcttgggaaatatgttgcaattactgctcttttcggggcaacagagact 540G P I E L G K Y V A I T A L F G A T E T 160ctttgcaacttacaggtgcttaaccagcatgaaacacccgtactctatagtatcgtttgg 600L C N L Q V L N Q H E T P V L Y S I V W 180tcggaaggtctagttaatgaagccacaaccgttctactcttcaatgtcattgataacatc 660S E G L V N E A T T V L L F N V I D N I 200cacattgataattttgaagctattgttgtcttgcaattcgtctctcgatttatttacgta 720H I D N F E A I V V L Q F V S R F I Y V 220ttctggaccagcaacatacttactgtagctggtgggttggcaagtgcatacgtaatcgat 780F W T S N I L T V A G G L A S A Y V I D 240gaactcccatttgccgatcataacactgatagaaaggtttctgtaatgatagcaatggca 840E L P F A D H N T D I K V S V M I A M A 260tacgcttcatacatggcgtcaatgctgatagacctgtacggaattcttgatgtcttctgg 900Y A S Y M A S M L T D L Y G I L D V F W 280cctggaatagtatgttcacattactcctggcatcaagtgacagaaggatttaaagttacc 960P G I V C S H Y S W H Q V T E G F K V T 300aacaagcattcatttgtaactttaggattcattatcgaactattcctctggctctatgtt 1020N K H S F V T L G F I I E L F L W L Y I 320aacatggatatattggacctagaggactggagattagctagtcagagtcctaagagacca 1080N N D I L D L E D W R I A T Q S P K R P 340attctgttaactgcatttattttgacattggttatgattggaagagtcgcatttatattc 1140I L L T A F I L T L V M I G R V A F I F 360cctttgaatttcgcatccaccctacaaaaaagggacgccgatccaagaatcaacttcgaa 1200P L N F A S T L Q K R D A D P R I N F E 380acacaactaatcttatggttcgctagtctcatcagaggagcaatttcagttgcggttctt 1260T Q L I L W F A S L I R G A I S V A V L 400tataccaagtttaacgcaactggtcactctgaaatccgactcaatgtcatcatgttaacc 1320Y S K F N A T G H S E I R L N V I M L T 420agcacacttattgttattctattcggcacaatggctttcaacctggtgacgcgcccggta 1380S T L I V I L F G T M A F N L V T R P V 440gcaagtatcctcctcccaccagacactggactgtcaacgggttctctggtctcacaacag 1440A S I L L P P D T G L S T G S L V S Q Q 460actatgctggacccaatccttactggcatgatcgggtctgagtttgatgtagggacgatc 1500T M L D P I L T G M I G S E F D V G T I 480acctcccctcaatacaccctccagttccttctcggcgcgccagctcgcaccgtccataaa 1560S S P Q Y T L Q F L L G A P A R T V H K 500gtttgggacaagtgggacgagcggttcatgcacccggtgttcggggggaaaggtttcgcc 1620V W D K W D E R F M H P V F G C K G F A 520ccctttctccctggtacgccggcggagaggactgtccctaaatctcacgtgggcaacgtg 1680P F L P G T P A E R T V P K S H V G N V 540Acggacgcttatggcagtatcgacctagctttcctctgattcctggataaataatgttca 1740T D A Y G S I D L A F L * 552
3.根椐權(quán)利要求1所述用耐鹽基因MGX4培養(yǎng)耐鹽植物的方法其特征在于耐鹽基因MGX4的編碼序列與強(qiáng)立組成型表達(dá)啟動(dòng)子35S融合，用限制性內(nèi)切酶Sstl消化后，用T4DNA聚合酶切成平頭，再用內(nèi)切酶SalI切割，將載體上原有的GUS基因切去，將載體純化回收；MGX4基因用Sall消化后，再用Sma I酶切，然后由T4DNA連接酶，同回收的載體連接得pHXZ載體。
4.根椐權(quán)利要求1所述用耐鹽基因MGX4培養(yǎng)耐鹽植物的方法其特征在于帶有耐鹽基因MGX4的pHXZ載體通過將耐鹽基因?qū)朕r(nóng)桿菌中，用含有pHXZ的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液感染萌發(fā)6-10天的植物外植體，在共生培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-2天后，轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，約培養(yǎng)2-4周后，將再生的轉(zhuǎn)基因幼苗切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；約二周后，再將已生根的幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中培養(yǎng)，培育出耐鹽植物。
5.根椐權(quán)利要求1所述用耐鹽基因MGX4培養(yǎng)耐鹽植物的方法其特征在于通過該方法培育出的耐鹽植物如西紅柿、油菜、煙草、苗木和草籽等。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以紅樹等抗旱植物為材料，克隆到抗鹽基因MGX
文檔編號(hào)A01H1/00GK1448511SQ02111229
公開日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2002年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月2日
發(fā)明者張洪霞 申請(qǐng)人:張洪霞