專利名稱：一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的綠色添加劑及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的綠色添加劑及其生產(chǎn)方法，更具體地說(shuō)，涉及一種含豬的生長(zhǎng)激素(PGH)的玉米、水稻、小麥、大豆、油菜粉等作物及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，用植物作表達(dá)載體來(lái)表達(dá)外源蛋白已有不少報(bào)道，但將PGH基因于植物體上表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。目前的動(dòng)物促生長(zhǎng)添加劑技術(shù)中，有化學(xué)合成的促生長(zhǎng)添加劑，如β-激動(dòng)劑(俗稱“瘦肉精”)和生長(zhǎng)激素，但因其是人工合成，具有頑固的熱穩(wěn)定性，使用后會(huì)在動(dòng)物組織中形成累積性殘留。由于這類化合物具有口服活性，違法使用會(huì)給消費(fèi)者帶來(lái)一些不良影響(如頭暈眼花，嘔吐等癥狀)，目前正受到國(guó)家的“封殺”。由于這類化合物具有口服活性，違法使用會(huì)給消費(fèi)者帶來(lái)一些不良影響(如頭暈眼花，嘔吐等癥狀)，目前正受到國(guó)家的“封殺”。此外，市場(chǎng)上還有一些抗生素型促生長(zhǎng)添加劑，它們通過(guò)抑制腸道內(nèi)的有害細(xì)菌而達(dá)到促生長(zhǎng)的目的，由于它們屬于抗生素，必然面臨耐藥性和藥物殘留的問(wèn)題。
用植物高效表達(dá)生長(zhǎng)激素，既避免了生長(zhǎng)激素必須注射所造成的不便；又可作為一種綠色環(huán)保促生長(zhǎng)添加劑，不僅滿足了當(dāng)今市場(chǎng)的需求，無(wú)毒副作用、無(wú)殘留，同時(shí)又可減少飼料轉(zhuǎn)化為脂肪的浪費(fèi)，大幅提高飼料的利用率。
總而言之，生長(zhǎng)激素(PGEF)，具有增強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，如糖、氨基酸和電解質(zhì)，改善腸道消化功能，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，減少胰島素的分泌、促進(jìn)蛋白和糖的生成，減少脂肪沉積、促進(jìn)脂肪溶解，從而提高畜禽的瘦肉比例，提高飼料的轉(zhuǎn)化率。且生長(zhǎng)激素與乳化因子結(jié)構(gòu)相似(與胎盤的乳蛋白基因同源性為85％)，亦可起到與乳化因子相同的作用--提高乳奶的產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)技術(shù)簡(jiǎn)單、作物中的重組蛋白具有生物活性，可明顯地促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的綠色添加劑及其生產(chǎn)方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案生產(chǎn)一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的添加劑，包括玉米、水稻、小麥、大豆和油菜粉等作物，這些作物含有生長(zhǎng)激素蛋白并可明顯地促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，用以表達(dá) 生長(zhǎng) 激 素 的 修 飾基 因 為 ATCTAGAATGGCCTTCCCGGCCATGCCCCTGTCGAGCCTGTTCGCCAACGCCGTGCTGCGCGCCCAGCACCTGCACCAGCTGGCCGCCGACACGTACAAGGAGTTCGAGCGCGCCTACATCCCGGAGGGTCAGCGCTACTCGATCCAGAACGCCCAGGCCGCCTTCTGCTTCTCGGAGACGATCCCGGCGCCGACGGGTAAGGACGAGGCCCAGCAGAGGTCGGACGTGGAGCTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTGATTCAGTCGTGGCTGGGGCCCTTCATCCGCTGAGTCGACA上述PGH修飾基因序列通過(guò)植物反應(yīng)器能表達(dá)出相應(yīng)的重組蛋白，并形成三級(jí)結(jié)構(gòu)。
在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，進(jìn)行基因重組和重組蛋白的制備，即(1)將上述生長(zhǎng)激素修飾基因插入質(zhì)粒載體采用分子生物學(xué)的方法來(lái)人工合成PGH基因，該基因含啟動(dòng)子和終止子，基因經(jīng)修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端為植物的信號(hào)肽基因，片段兩端為內(nèi)切酶位點(diǎn)(Xba I和sal I)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接重組，構(gòu)建各自的重組質(zhì)粒；(2)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤(rùn)，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉(zhuǎn)基因種子；(3)取種子種入土壤，獲得可作為飼料添加劑的植物根、莖、葉、果實(shí)或種子。
在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，首先通過(guò)對(duì)豬、牛、羊(綿羊和山羊)、人的生長(zhǎng)激素基因進(jìn)行大量的分析和重組，選取具有相同保守區(qū)的片段進(jìn)行重組。同時(shí)為了提高在植物中的表達(dá)量，我們把目的片段與植物本身的一段信號(hào)肽基因相融合，來(lái)防止mRNA的降解。然后人工合成此段基因，與植物的表達(dá)載體連接重組，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和基因槍轉(zhuǎn)化的方法，把目的基因整合進(jìn)植物的基因組中。
上述PGH基因序列通過(guò)植物反應(yīng)器表達(dá)出相應(yīng)的重組蛋白，并形成三級(jí)結(jié)構(gòu)，用含重組活性蛋白的飼料添加劑，飼喂畜禽，可起到明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)作用。
在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的“綠色添加劑”的生產(chǎn)包括用目的基因的同源性分析、目的基因的人工修飾、目的基因的人工合成、基因重組、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物，促動(dòng)物生長(zhǎng)方法包括用含重組蛋白的作物制作飼料添加劑并飼喂家畜。首先通過(guò)對(duì)豬、牛、羊(綿羊和山羊)、人的生長(zhǎng)激素基因進(jìn)行大量的分析和重組，同時(shí)參照腦垂體中分離出生長(zhǎng)激素的一株變異株，由于其失缺了幾個(gè)氨基酸而更容易被翻譯后修飾，更容易形成二聚體而避開(kāi)腎臟的降解。我們就是參照此變異株而人工合成了豬的生長(zhǎng)素基因，利用植物進(jìn)行翻譯后的修飾而可抵抗一些酶的消化。同時(shí)為了提高在植物中的表達(dá)量，我們把目的片段與植物本身的一段信號(hào)肽基因相融合，來(lái)防止mRNA的降解。采用分子生物學(xué)的方法人工合成PGH基因，該基因含有啟動(dòng)子和終止子，基因經(jīng)過(guò)修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端為植物的信號(hào)肽基因，片段兩端為內(nèi)切酶位點(diǎn)(Xba I和sal I)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒；將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤(rùn)，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉(zhuǎn)基因種子，并可經(jīng)ELISA法和Western blot法檢測(cè)確證。
實(shí)施過(guò)程中，將植物種子種于小杯中，在4℃暗室中放置48小時(shí)使其同步發(fā)芽。后轉(zhuǎn)至生長(zhǎng)室20C曝光16小時(shí)，用雙蒸水，偶而用礦物質(zhì)水澆灌。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞系(Agrobacteriumtumefaciens cell line)(C58C1株)，在LB(Luri-Bertani)培養(yǎng)液中(含卡那霉素50mg/ml)培養(yǎng)離心收集細(xì)胞，于200ml MS(murashige和Skoog)培養(yǎng)液(2.35g/l)(含5％蔗糖和10g/L的6-BA(6-芐氨基嘌吟6-benzilaminopurine中重懸。待植物6-7周齡時(shí)，倒置培養(yǎng)杯將植物浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞(Agrobacterium)的重懸液中，真空5×106mpa浸潤(rùn)滲透15分鐘，用水沖洗后放于生長(zhǎng)室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中用含GM(4.7g/lMS、l％蔗糖和0.5g/LMES(嗎啉乙烷磺酸morpholine ethane sulfonicacid)和50mg/ml卡那霉素的瓊脂凝膠(8g/lPH5.7)中篩選轉(zhuǎn)基因種子。兩周后，將轉(zhuǎn)基因植物移至土壤中培育成熟即可獲得促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因種子?；蛘哂弥亟M質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)培育和Southern blot檢測(cè)確認(rèn)后獲得促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因種子。
轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)和種子中含有生長(zhǎng)激素(PGH)的外源基因，經(jīng)PCR檢測(cè)確證，所含外源蛋白可經(jīng)ELISA和Westernblot檢測(cè)確證。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下明顯的優(yōu)點(diǎn)一是生產(chǎn)技術(shù)簡(jiǎn)單，二是作物中的重組蛋白具有生物活性，可明顯地促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，家畜進(jìn)食含上述添加劑的飼料后，其瘦肉率、增重率明顯高于空白對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的描述實(shí)施例首先通過(guò)對(duì)豬、牛、羊(綿羊和山羊)、人的生長(zhǎng)激素基因進(jìn)行大量的分析和重組，選取具有相同保守區(qū)的功能片段進(jìn)行分析。同時(shí)參照由于缺失了幾個(gè)氨基酸而更能抵抗酶的消化的變異株來(lái)確定目的基因。為了提高在植物中的表達(dá)量，把目的片段與植物本身的一段信號(hào)肽基因相融合，來(lái)防止mRNA的降解。采用分子生物學(xué)的方法人工合成PGH基因，該基因含有啟動(dòng)子和終止子，基因經(jīng)過(guò)修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端為植物的信號(hào)肽基因，片段兩端為內(nèi)切酶位點(diǎn)(Xba I和sal I)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒；將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤(rùn)，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選轉(zhuǎn)基因種子，并經(jīng)ELISA法和Western blot法檢測(cè)確證。
將植物的種子植入小杯中，于4℃暗室中放置48小時(shí)使其同步發(fā)芽，其后轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室20℃曝光16小時(shí)，用雙蒸水，偶爾用礦物質(zhì)水澆灌。待植物6-7周齡時(shí)，倒置培養(yǎng)杯將植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中，真空度5×106mpa浸潤(rùn)滲透15分鐘，用水沖洗后放入生長(zhǎng)室中直至成熟。在培養(yǎng)皿中，用含GM(4.7g/lMS、1％蔗糖和0.5g/lMES)和50mg/ml濃度卡那霉素的瓊脂膠凝(8g/lPH5.7)中篩選轉(zhuǎn)基因植株。兩周后，將轉(zhuǎn)基因植物移至土壤中培養(yǎng)成熟即可獲得抗禽流感的轉(zhuǎn)基因種子?；蛘哂弥亟M質(zhì)粒包裹金彈，采用基因轟擊的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過(guò)培育和Southern blot檢測(cè)確認(rèn)后獲得促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因種子。
各個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含外源基因PGH，可經(jīng)其的PCR檢測(cè)引物檢測(cè)存在。
各個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中所含的外源蛋白，經(jīng)ELISA和Western blot檢測(cè)其存在，陽(yáng)性對(duì)照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物中混有人工合成的多肽PGA(10ug/ml)，陰性對(duì)照為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物抽提物。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植物的根、莖、葉、果實(shí)或種子中含有外源蛋白PGH，能夠與蛋白中相應(yīng)的多肽血清發(fā)生明顯的反應(yīng)。在Western blot檢測(cè)中，用抗PGH的血清可檢測(cè)到特異性的條帶，分子量為1-50KDa，得出與ELISA相同的檢測(cè)結(jié)果。
家畜進(jìn)食含上述添加劑的飼料后，瘦肉率、增長(zhǎng)率明顯提高，超過(guò)了市場(chǎng)上銷售的促生長(zhǎng)型添加劑的水平。
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的綠色添加劑，包括玉米、水稻、小麥、大豆和油菜粉各類作物，其特征在于綠色添加劑ZHONG含豬的生長(zhǎng)激素(PGH)，用以表達(dá)PGH的修飾基因?yàn)锳TCTAGAATGGCCTTCCCGGCCATGCCCCTGTCGAGCCTGTTCGCCAACGCCGTGCTGCGCGCCCAGCACCTGCACCAGCTGGCCGCCGACACGTACAAGGAGTTCGAGCGCGCCTACATCCCGGAGGGTCAGCGCTACTCGATCCAGAACGCCCAGGCCGCCTTCTGCTTCTCGGAGACGATCCCGGCGCCGACGGGTAAGGACGAGGCCCAGCAGAGGTCGGACGTGGAGCTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTGATTCAGTCGTGGCTGGGGCCCTTCATCCGCTGAGTCGACA
2.權(quán)利要求1所述的飼料添加劑的生產(chǎn)方法，其特征在于進(jìn)行基因重組和重組蛋白的制備，其具體過(guò)程為(1)將PGH修飾基因插入質(zhì)粒載體采用分子生物學(xué)的方法人工合成PGH基因，該基因含有啟動(dòng)子和終止子，基因經(jīng)過(guò)修飾成為植物所偏嗜的密碼子，前端加植物的信號(hào)肽基因，片段兩端為內(nèi)切酶位點(diǎn)(Xba I和sal I)，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切表達(dá)載體和目的片段，T4連接酶連接重組，構(gòu)建相應(yīng)的重組質(zhì)粒，然后(2)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物玉米、水稻、小麥、大豆和油菜中進(jìn)行表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植物的種子將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，于含卡那霉素的LB中培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，于含蔗糖和L6-BA的MS培養(yǎng)液中重懸，再將培養(yǎng)好的植物莖葉浸入含根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的重懸液中真空浸潤(rùn)，用水沖洗，存放至成熟，用含MS、蔗糖和MES的GM和卡那霉素的瓊脂凝膠篩選含PGH的轉(zhuǎn)基因種子，再(3)取種子種入土壤，獲得可作為飼料添加劑的植物根、莖、葉、果實(shí)或種子。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的綠色添加劑及其生產(chǎn)方法,添加劑中的活性蛋白由人工合成的生長(zhǎng)激素基因表達(dá)而成,是在原料作物的根、莖、葉和種子中形成的立體結(jié)構(gòu)的總和,通過(guò)將PGH修飾基因插入質(zhì)粒載體、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入植物中表達(dá),將不同轉(zhuǎn)基因種子種入土壤獲得作為飼料添加劑的作物,再將含重組活性蛋白的飼料添加劑飼喂家畜,有效地解決了常規(guī)促生長(zhǎng)添加劑的耐藥性和藥物殘留等問(wèn)題,具有生產(chǎn)簡(jiǎn)單、操作方便和增強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、改善腸道消化功能、促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、減少胰島素的分泌、促進(jìn)蛋白和糖的生成、減少脂肪沉積、促進(jìn)脂肪溶解和提高乳奶的產(chǎn)生、提高畜禽的瘦肉比例及飼料的轉(zhuǎn)化率等優(yōu)點(diǎn),廣泛適用于各類動(dòng)物的促生長(zhǎng)之用。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1349743SQ0112983
公開(kāi)日2002年5月22日 申請(qǐng)日期2001年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月27日
發(fā)明者鐘安清, 秦智鋒 申請(qǐng)人:深圳市三方圓信息技術(shù)有限公司