專(zhuān)利名稱(chēng)：煙草發(fā)狀根培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙草發(fā)狀根培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿。
在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，為了占據(jù)一定的生態(tài)位，植物獲得了通過(guò)次生代謝而產(chǎn)生各種次生代謝物質(zhì)的能力。人類(lèi)對(duì)植物次生代謝物質(zhì)的利用有著悠久的歷史，當(dāng)今對(duì)植物次生物質(zhì)利用的研究更是方興未艾。但植物次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量受植物產(chǎn)量和次生物含量的限制，有些次生物質(zhì)在自然界的含量甚微，從而局限了植物次生物質(zhì)的廣泛應(yīng)用。隨著在生物技術(shù)方面取得的長(zhǎng)足進(jìn)步，人們把目光聚集在了如何利用生物技術(shù)以獲得植物次生物質(zhì)的研究上。
利用生物技術(shù)獲得植物次生物質(zhì)有兩種方法，一是植物細(xì)胞培養(yǎng)方法，二是發(fā)狀根培養(yǎng)法。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次物代謝物真正實(shí)現(xiàn)商品化性業(yè)生產(chǎn)的還為數(shù)甚少，其主要原因在于培養(yǎng)的植物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，次生代謝物含量太低，以及生產(chǎn)能力不穩(wěn)定，工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)工藝復(fù)雜，操作繁鎖，成本太高。由于發(fā)根具有培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)迅速且不需添加外源激素，擁有親本植株的特征次級(jí)代謝途徑，遺傳的穩(wěn)定性，起源于單個(gè)細(xì)胞，處于分化狀態(tài)等特點(diǎn)，尤其是發(fā)狀根的穩(wěn)定性和生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)是工業(yè)化生產(chǎn)夢(mèng)寐以求的，也是細(xì)胞培養(yǎng)和一般器官培養(yǎng)所不能兼?zhèn)涞?，因此，人們?duì)其進(jìn)行了廣泛的研究，并逐步將其應(yīng)用到了生產(chǎn)植物次生代謝物質(zhì)。至今已有不少植物被誘導(dǎo)并產(chǎn)生了發(fā)根，且次生代謝物的含量也大大提高。Youshikawa和Furuya通過(guò)人參愈傷組織誘導(dǎo)出發(fā)根，在無(wú)外源激素的條件下，其生長(zhǎng)速度為用激素誘導(dǎo)根的2倍，人參皂甙(Rb和Rg)含量最高可達(dá)干重的0.95％，高于天然栽培根(0.4％)的含量。Shimomura等誘導(dǎo)紫草再生植株產(chǎn)生的發(fā)根在2L氣升式反應(yīng)器中生長(zhǎng)迅速，通過(guò)與反應(yīng)器連接的AmberliteXAD-2大孔樹(shù)脂柱將分泌到培養(yǎng)基中的紫草色素回收，每天吸附5mg紫草色素，且可連續(xù)生產(chǎn)220天。Parr等通過(guò)誘導(dǎo)長(zhǎng)春花形成發(fā)根，從發(fā)根中得到了懸浮細(xì)胞不能合成的長(zhǎng)春堿。這些試驗(yàn)證明，親本植株能合成的次生代謝物都可用發(fā)根培養(yǎng)物來(lái)生產(chǎn)，因而被認(rèn)為是一條利用生物技術(shù)生產(chǎn)次生代謝物(如藥物、天然色素、香料、天然調(diào)味品等)的新的有效途徑。
本發(fā)明的目的旨在利用發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)，通過(guò)煙草的發(fā)狀根培養(yǎng)法以生產(chǎn)煙堿。
本發(fā)明制備了高含量煙堿的基因工程煙草發(fā)狀根。首先獲得無(wú)菌煙草實(shí)生苗；用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染該煙草無(wú)菌苗的外植體，誘導(dǎo)其長(zhǎng)出發(fā)根；用Southern雜交的方法檢測(cè)這些根中是否含有T-DNA，含有T-DNA的根即為發(fā)狀根；將發(fā)狀根進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)狀根中合成的煙堿分泌到培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)基中即可提取煙堿，提出的煙堿可用于生產(chǎn)農(nóng)藥、醫(yī)藥等多種用途。
實(shí)施例1高含量煙堿的轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)狀根的制備1.無(wú)菌實(shí)生苗的獲取將煙草種子作消毒滅菌處理，點(diǎn)播于盛有固體MSO培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，待發(fā)芽后轉(zhuǎn)接于盛有固體MSO培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，待苗長(zhǎng)至3～5周即可作侵染用；2.侵染用A4農(nóng)桿菌侵染上述煙草無(wú)菌苗的葉柄。侵染時(shí)用移液器向葉柄切口處點(diǎn)少量菌液，將侵染有菌液的外植體放在含有MSO固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)2天左右，即可長(zhǎng)出發(fā)根。
3.除菌在發(fā)根長(zhǎng)至1cm左右時(shí)，加入500μg/1的頭孢毒素或羧芐霉素以除菌。除菌后待根長(zhǎng)長(zhǎng)至2～3cm時(shí)將其從外植體上切離，轉(zhuǎn)至含MSO固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在40℃下培養(yǎng)2天左右，以完成進(jìn)一步除菌。
4.繼代將除菌后的單根在固體MSO培養(yǎng)基中培養(yǎng)，2～3周繼代一次，使發(fā)根量不斷擴(kuò)增，直至發(fā)根的量達(dá)到鮮重100-200毫克以上時(shí)可用于鑒定。
5.鑒定用Southern雜交的方法檢測(cè)步驟4中得到的多個(gè)根系，確定出含有T-DNA的根系，即為發(fā)狀根。
6.擴(kuò)大培養(yǎng)對(duì)步驟5得到的煙草發(fā)根株系在固體的MSO培養(yǎng)基中，28℃進(jìn)行培養(yǎng)，反復(fù)繼代，一般繼代3-4次，每2周繼代一次，得到穩(wěn)定的該株系發(fā)根。
實(shí)施例2發(fā)狀根培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿將實(shí)施例1所得的發(fā)根接種到氣升式反應(yīng)器的改良的MSO液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，使發(fā)根量不斷增大，在28℃，無(wú)光照，培養(yǎng)1個(gè)月，發(fā)根增至接種量的8.5倍，發(fā)根所合成的煙堿分泌到液體培養(yǎng)基中，取出舊培養(yǎng)基，同時(shí)加入新培養(yǎng)基，采用常規(guī)方法從舊培養(yǎng)基中提取出煙堿。培養(yǎng)基中煙堿含量為0.33％，發(fā)根中煙堿含量為0.42％(濕基)，此過(guò)程可重復(fù)進(jìn)行三次。本實(shí)施例使用的改良的MSO培養(yǎng)基配方(mg/L)MgSO4·7H2O 370，CaCl2·2H2O 440，KNO33984，KH2PO4170，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8，MnSO4·4H2O 22.3，KI 0.83，CoCl2·6H2O0.025，ZnSO4·7H2O 8.6，CuSO4·5H2O 0.025，H3BO36.2，Na2MoO4·2H2O 0.25。
權(quán)利要求
1.高含量煙堿的轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)狀根的制備方法，其特征在于用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞和愈傷組織，得到轉(zhuǎn)化了T-DNA的煙草發(fā)狀根株系，再將該株系進(jìn)行固定化連續(xù)培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于采用的發(fā)根農(nóng)桿菌是A4農(nóng)桿菌。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，該方法包括A.獲取煙草無(wú)菌實(shí)生苗將煙草種子作消毒處理，點(diǎn)播于盛有固體MSO培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，待發(fā)芽后轉(zhuǎn)接于盛有固體MSO培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，待苗長(zhǎng)至3～5周即可作侵染用；B.侵染取下煙草無(wú)菌實(shí)生苗的葉柄，用移液器向葉柄切口處點(diǎn)上少量菌液，將侵染有菌液的煙草葉柄放在盛有MSO固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出1cm左右長(zhǎng)的發(fā)根；C.除菌待被侵染的葉柄長(zhǎng)出1cm左右的根后，用頭孢毒素或羧芐霉素除去農(nóng)桿菌。繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)根長(zhǎng)至2～3cm時(shí)將其從葉柄上切離，轉(zhuǎn)至固體MSO的培養(yǎng)基上，在40℃下培養(yǎng)2天，至完全除菌；D.繼代將除菌的單根在固體MSO培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2～3周繼代一次，使其量不斷擴(kuò)增，得到一定量的系列根系；E.鑒定用Southern雜交的方法檢測(cè)步驟D中得到的系列根系，確定出含有T-DNA的根系，此根系即為轉(zhuǎn)基因的發(fā)狀根。
4.煙草發(fā)狀根培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿的方法，其特征在于將權(quán)利要求1制備的發(fā)狀根進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，接種到液體培養(yǎng)基，從培養(yǎng)液和發(fā)狀根中提取煙堿。
5.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)煙堿的方法，其特征在于所述的擴(kuò)大培養(yǎng)是將發(fā)狀根在MSO培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)、繼代2-3次。
6.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)煙堿的方法，其特征在于所述的液體在氣升式反應(yīng)器中進(jìn)行，采用改良的液體MSO培養(yǎng)基，28℃，無(wú)光照，培養(yǎng)1個(gè)月。
7.如權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)煙堿的方法，其特征在于所述的改良的MSO培養(yǎng)基配方為(mg/L)MgSO4·7H2O 370，CaCl2·2H2O 440，KNO33984，KH2PO4170，F(xiàn)eSO4·7H2O 27.8，MnSO4·4H2O 22.3，KI 0.83， CoCl2·6H2O0.025，ZnSO4·7H2O 8.6，CuSO4·5H2O 0.025，H3BO36.2，Na2MoO4·2H2O 0.25。
全文摘要
本發(fā)明涉及煙草發(fā)狀根培養(yǎng)法生產(chǎn)煙堿。用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染煙草無(wú)菌苗的外植體,誘導(dǎo)該外植體長(zhǎng)出發(fā)根;用Southern雜交檢測(cè)根系中的T－DNA,以確定發(fā)狀根株系;培養(yǎng)具有T－DNA的根系,用固定化連續(xù)培養(yǎng)法,在改良的MSO培養(yǎng)基中培養(yǎng)該最優(yōu)發(fā)狀根系,最后從培養(yǎng)基和發(fā)狀根中提取煙堿。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1276422SQ00107949
公開(kāi)日2000年12月13日 申請(qǐng)日期2000年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月1日
發(fā)明者曹陽(yáng), 鞏普遍, 董建新, 樊紅梅, 張興 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)無(wú)公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心