采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)周氏嚙小蜂Hsp60基因表達(dá)的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】采用焚光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)周氏嗤小蜂Hsp60基因表達(dá)的方 法
[0001] 本發(fā)明得到：國(guó)家自然科學(xué)基金（31201730);天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目 (20110602);天津師范大學(xué)博士基金（52XB1003)及天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金 的資助。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于檢測(cè)周氏嚙小蜂Hsp60基因表達(dá)的特異性引 物，更具體的說(shuō)是一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)周氏嚙小蜂Hsp60基因表達(dá)的方法。主要 用于周氏嚙小蜂Hsp60基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理及其生態(tài)防治的研究，研究結(jié)果可為科學(xué)利用天 敵昆蟲(chóng)周氏嚙小蜂進(jìn)行生物防治提供理論基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0003] 熱激蛋白Heat shock protein (Hsp)是一類(lèi)在生物體內(nèi)廣泛存在的，對(duì)體內(nèi)外 環(huán)境變化極為敏感的高保守性蛋白質(zhì)，廣泛參與了各種生理代謝途徑，近年來(lái)已成為生物 研究領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn)。根據(jù)其分子量的大小可將其分為不同的蛋白家族，其中Hsp60與 溫度脅迫應(yīng)激性密切相關(guān)。溫度是影響生物體生存至關(guān)重要的環(huán)境因子，只有在一定的溫 度范圍內(nèi)生物體才能進(jìn)行物質(zhì)能量代謝以維持正常生理活動(dòng)，超出溫度的耐受范圍都會(huì)使 生物的生長(zhǎng)發(fā)育停滯甚至死亡。一般來(lái)說(shuō)生物體受到高溫或低溫刺激后，蛋白合成量會(huì)有 顯著變化，用以增強(qiáng)抗逆境能力。由于熱激蛋白會(huì)在脅迫消除后一段時(shí)間內(nèi)保持一定的含 量使生物體更好生存，可以認(rèn)為其存在對(duì)于生物體適應(yīng)環(huán)境有著重要作用。
[0004] 周氏嗤小蜂CAoi/ioiaciMea Yang是我國(guó)重要入侵物種美國(guó)白蛾 (Drury)的重要寄生性天敵，體長(zhǎng)1. 1-1. 5mm，群集內(nèi)寄生于美國(guó)白蛾蛹 中，是抑制美國(guó)白蛾的主要天敵因子，對(duì)控制美國(guó)白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美國(guó) 白蛾外，還可寄生于鱗翅目的枯葉蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和雙翅目的蠅科、 寄蠅科及鞘翅目的葉甲科和瓢甲科等。
[0005] 通過(guò)野外釋放C??抑可以達(dá)到有效防治美國(guó)白蛾的目的。然而，在野外環(huán)境 下，C??似的活力會(huì)受到多重因素的影響，其中，溫度作為一個(gè)主要生態(tài)因素，會(huì)影響C craea的生命力。在合適的溫度范圍投放小蜂，才會(huì)起到更好的防治效果。
[0006] 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒 光PCR不僅實(shí)現(xiàn)了常規(guī)PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光PCR技 術(shù)由自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了肉眼判斷的主觀性，可進(jìn)一步提高靈敏度；實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)全封閉反應(yīng)，無(wú)須PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。目前，已 廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。隨著實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，近年 來(lái)，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在動(dòng)物生態(tài)防治中也得到了廣泛的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)周氏嚙小蜂Hsp60基因表達(dá) 的方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下： 設(shè)計(jì)一種采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)周氏嚙小蜂Hsp60基因表達(dá)的特異性引物，其特 征在于包括符合熒光PCR反應(yīng)特點(diǎn)的特異上下游引物：Hsp60-F :5' -TGCGATGAACAACGAATA -3，；Hsp60-R:5，-CGTCAATAGTGAAGCGACT-3，； 本發(fā)明所述特異性引物快速檢測(cè)周氏嚙小蜂Hsp60基因表達(dá)的方法，其特征在于按如 下步驟進(jìn)行： (1)使用下述引物進(jìn)行該基因的檢測(cè)： 符合熒光PCR反應(yīng)特點(diǎn)的該序列特異上下游引物： Hsp60-F :5'-TGCGATGAACAACGAATA-3' Hsp60-R :5,-CGTCAATAGTGAAGCGACT-3' (1)總RNA的提取：采用各種通用的RNA提取方法，從周氏嚙小蜂成體中提取總RNA; (3) cDNA合成：以周氏嚙小蜂總RNA為模板合成cDNA，反應(yīng)體系為20μL; (4) 實(shí)時(shí)熒光PCR:以上述合成的cDNA為模板，上述（1)中Hsp60-F和Hsp60-R、GADPH-F 和GADPH-R為特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行管，擴(kuò)增后所 得3個(gè)平行管的Ct值取平均數(shù)。
[0009] (5)周氏嚙小蜂在不同溫度下Hsp60基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算： 實(shí)時(shí)熒光PCR后，當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近時(shí)，采用ΛΛCT法計(jì)算不同 溫度下Hsp60基因相對(duì)于內(nèi)參GADPH基因的mRΝΑ相對(duì)表達(dá)量。
[0010] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中每條引物分別配制成濃度為25μ mol/L的貯存液， 工作濃度為〇. 5μmol/L。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了采用熒光RT-PCR技術(shù)檢測(cè)周氏嚙小蜂Hsp60基因表達(dá)的特 異性引在制備檢測(cè)周氏嚙小蜂適應(yīng)外界環(huán)境變化方面的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：圖1為不同 溫度下周氏嚙小蜂Hsp60基因的相對(duì)表達(dá)量。從圖中看出無(wú)論是高溫還是低溫都可以影響 周氏嚙小蜂體內(nèi)的Hsp60的表達(dá)。在低溫脅迫的情況下，隨著溫度的不斷降低，周氏嚙小蜂 體內(nèi)的Hsp60的相對(duì)表達(dá)量呈上升的趨勢(shì)，并且在-7°C時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量；在高溫脅迫的 情況下，隨著溫度的不斷升高，周氏嚙小峰體內(nèi)的Hsp60的相對(duì)表達(dá)量也呈上升的趨勢(shì)，但 在40°C時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量。這對(duì)于以后在何種室外溫度下放飛白蛾周氏嚙小蜂防治美國(guó)白 蛾具有重要意義。
[0012] 本發(fā)明提供的特異性引物快速檢測(cè)周氏嚙小蜂Hsp60基因表達(dá)的方法與現(xiàn)有技 術(shù)相比的有益效果是： (1)本發(fā)明采用的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)由自動(dòng) 化儀器收集熒光信號(hào)，避免了肉眼判斷的主觀性，可進(jìn)一步提高靈敏度；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù) 全封閉反應(yīng)，無(wú)須PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 技術(shù)也免除了常規(guī)PCR中的電泳、定量掃描等后續(xù)繁瑣步驟，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
[0013] (2)在通過(guò)RT-qPCR的方法研究不同溫度下Hsp60基因表達(dá)的變化，結(jié)果顯示在 不同溫度條件下周氏嚙小蜂體內(nèi)的Hsp60基因的表達(dá)水平處于一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程中，高溫和低 溫脅迫都使周氏嚙小蜂體內(nèi)Hsp60有一個(gè)高的表達(dá)量，在40°C和_7°C體內(nèi)表達(dá)量最大。
[0014] (3)因此本發(fā)明提出研究了周氏嚙小蜂適應(yīng)外界環(huán)境的變化，避免受到脅迫因子 對(duì)自身的傷害的保護(hù)機(jī)制，對(duì)于防治美國(guó)白蛾有重大意義，為綠色防治林業(yè)害蟲(chóng)提供了一 個(gè)新的思路和技術(shù)。
[0015] 周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp60基因，其cDNA序列和編碼氨基酸的序列如表1、表2所 7Jn〇
[0016] 表 1


【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專(zhuān) 業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本 發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來(lái)限定；其中所用試劑均有市售。本發(fā)明中 所述的提取白蛾周氏嚙小蜂總RNA的提取，cDNA的合成，實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR等方法都 是本領(lǐng)域成熟的技術(shù)，試劑盒TransScript?RT、TransStart?TopGreenqPCRSuperMix等 都可以從生產(chǎn)商家購(gòu)買(mǎi)。
[0019] 實(shí)施例1: 獲得白蛾周氏嚙小蜂Hsp60基因序列 實(shí)驗(yàn)材料取自室內(nèi)傳代培養(yǎng)的白蛾周氏嚙小蜂(培養(yǎng)條件：于人工氣候箱（PQX-350H) 中，溫度25°C，相對(duì)濕度60%~80%，無(wú)光黑暗)。取羽化后24h內(nèi)的雌性周氏嚙小蜂，于解剖 鏡下切取觸角，立即浸于RNAlater(Ambion公司，AM7020)中；每200頭雌性白蛾周氏嚙小 蜂的觸角貯存于一個(gè)1. 5mL離心管中，共搜集8管