一種設(shè)置選擇壓模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境生物安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種設(shè)置選擇壓模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測方法。本發(fā)明通過人工設(shè)置選擇壓，檢測、計(jì)算和分析在不同靶標(biāo)害蟲危害水平的環(huán)境下，栽培稻群體與野生近緣種群體平均復(fù)合適合度變化的差值比，計(jì)算出環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)，以此來模擬檢測栽培稻抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及風(fēng)險(xiǎn)程度。本發(fā)明在整個(gè)受控田間實(shí)驗(yàn)過程中，不向環(huán)境釋放任何抗蟲轉(zhuǎn)基因栽培稻，不會(huì)出現(xiàn)導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的情況。通過罩籠受控實(shí)驗(yàn)，獲得栽培稻和野生近緣種群體在不同靶標(biāo)害蟲選擇壓環(huán)境條件下的適合度數(shù)據(jù)，分析和模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移后帶來的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及其程度。本發(fā)明為抗蟲栽培稻轉(zhuǎn)基因漂移導(dǎo)致的環(huán)境安全評(píng)價(jià)提供了重要科學(xué)依據(jù)和更為安全的評(píng)價(jià)方法。
【專利說明】
一種設(shè)置選擇壓模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境生物安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種栽培稻抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到 其野生近緣種后帶來環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的模擬檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)的迅速發(fā)展，極大推動(dòng)了抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的培育和商品化種植。 抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的商品化應(yīng)用和種植，為農(nóng)作物的產(chǎn)量提高、農(nóng)藥施用量的減少、改善農(nóng)業(yè) 生態(tài)環(huán)境以及我國糧食安全均帶來了新的機(jī)遇。轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)已被確定為我國未來育種 發(fā)展的重大目標(biāo)之一，隨之將會(huì)有更多的轉(zhuǎn)基因植物品種培育出并釋放到環(huán)境中。然而，在 轉(zhuǎn)基因植物商品化種植之前，必須對(duì)其進(jìn)行包括環(huán)境生物安全在內(nèi)的生物安全檢測和評(píng) 價(jià)，特別是對(duì)轉(zhuǎn)基因漂移及其可能的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，即轉(zhuǎn)基因漂移到野生近緣物種之后，可能引 起的嚴(yán)重雜草問題和野生近緣種瀕危以及局部滅絕等一系列后果進(jìn)行檢測和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，以 確保轉(zhuǎn)基因植物的安全和持續(xù)利用。
[0003] 大量抗蟲轉(zhuǎn)基因栽培稻已經(jīng)被培育出來，有些品系已經(jīng)被釋放到環(huán)境中進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn) 評(píng)價(jià)。其中一項(xiàng)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)內(nèi)容為:抗蟲轉(zhuǎn)基因通過基因漂移到栽培稻野生近緣種(雜草 稻和野生稻)可能造成其適合度的改變，從而導(dǎo)致嚴(yán)重雜草問題和野生近緣種滅絕的風(fēng)險(xiǎn)。 因此，對(duì)于適合度的增加或降低的檢測和評(píng)價(jià)是對(duì)該項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。但是，如果直接將 抗蟲轉(zhuǎn)基因栽培稻釋放到環(huán)境中進(jìn)行環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，可能由于基因漂移而將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn) 移到其野生近緣種自然群體中，在這種情況下，如果監(jiān)管不力就會(huì)導(dǎo)致不可預(yù)測的環(huán)境風(fēng) 險(xiǎn)。將包含轉(zhuǎn)基因的植物直接釋放到環(huán)境中進(jìn)行田間實(shí)驗(yàn)也存在一定的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。因此，本 領(lǐng)域迫切需要一種新的檢測方法，即：不向環(huán)境中釋放包含轉(zhuǎn)基因栽培稻，就可以模擬評(píng)價(jià) 栽培稻抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移是否帶來環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)以及風(fēng)險(xiǎn)程度的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種涉及栽培稻抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到野生近緣種后帶來環(huán)境 風(fēng)險(xiǎn)的模擬檢測方法。
[0005] 本發(fā)明通過檢測和計(jì)算分析栽培稻群體與野生近緣種群體在靶標(biāo)害蟲的危害環(huán) 境下，根據(jù)其平均復(fù)合適合度變化的差值比，計(jì)算出環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)U )，以此模擬和計(jì)算抗 蟲轉(zhuǎn)基因漂移帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及風(fēng)險(xiǎn)水平。
[0006] 靶標(biāo)害蟲是指轉(zhuǎn)基因?qū)⒁獪绯暮οx，不同類型的轉(zhuǎn)基因針對(duì)不同靶標(biāo)害蟲，如： 轉(zhuǎn)基因的靶標(biāo)害蟲為鱗翅目害蟲，轉(zhuǎn)基因栽培稻主要防治稻螟蟲?？瓜x轉(zhuǎn)基因漂移到 野生近緣種以后是否會(huì)帶來環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，以及帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)有多大，這在很大程度上取決 于該轉(zhuǎn)基因是否引起野生近緣物種群體適合度的改變及其改變程度的大小。
[0007] 適合度是指在一定環(huán)境條件下，生物體能夠生存并將其基因型傳遞到后代的能 力。大量研究顯示，當(dāng)適合度有較大程度的增加(利益)或降低(成本)時(shí)，均可能導(dǎo)致不同程 度的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。
[0008] 本發(fā)明通過人工設(shè)置無蟲壓環(huán)境以及有靶標(biāo)害蟲的高蟲壓環(huán)境，在這兩種蟲壓環(huán) 境條件下種植栽培稻及其野生近緣種群體，進(jìn)行受控實(shí)驗(yàn)。測量不同蟲壓環(huán)境條件下栽培 稻及其野生近緣種群體被靶標(biāo)害蟲危害的程度，并計(jì)算和評(píng)估栽培稻及野生近緣種(雜草 稻和野生稻)群體的適合度變化，根據(jù)檢測到栽培稻和野生近緣種的危害狀況差異值，模擬 檢測抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及其程度。
[0009] 本發(fā)明在整個(gè)受控田間實(shí)驗(yàn)的過程中，不向環(huán)境釋放任何抗蟲轉(zhuǎn)基因栽培稻，因 此不會(huì)出現(xiàn)由于田間實(shí)驗(yàn)而導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的情況。通過受控實(shí)驗(yàn)，獲得栽培稻和野生近緣 種群體在不同靶標(biāo)害蟲選擇壓(蟲口密度)環(huán)境條件下的適合度數(shù)據(jù)，分析和模擬抗蟲轉(zhuǎn)基 因漂移后帶來的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及其程度。本發(fā)明為抗蟲栽培稻轉(zhuǎn)基因漂移導(dǎo)致的環(huán)境安全評(píng)價(jià) 提供了重要科學(xué)依據(jù)和一種更為安全的評(píng)價(jià)方法。
[0010] 具體而言，本發(fā)明提供的栽培稻抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到野生近緣種后帶來環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的 模擬檢測方法，通過檢測和計(jì)算分析在有靶標(biāo)害蟲環(huán)境條件下栽培稻群體與野生近緣種群 體被危害的水平，根據(jù)其平均復(fù)合適合度變化的差值比而計(jì)算出的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值(扔，來 模擬檢測抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及其程度，具體步驟為： (1) 構(gòu)建不包括任何抗蟲轉(zhuǎn)基因的栽培稻、雜草稻和(或)野生稻的實(shí)驗(yàn)群體； (2) 利用40-60目尼龍網(wǎng)制作的罩籠，設(shè)計(jì)用于模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的田 間種植受控實(shí)驗(yàn)； (3) 在罩籠中釋放不同密度的轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)害蟲(如:栽二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟）， 建立不同蟲壓的環(huán)境，根據(jù)栽培稻、雜草稻和(或)野生稻群體在不同蟲壓環(huán)境中被靶標(biāo)害 蟲的危害程度，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)群體的平均復(fù)合適合度； (4) 根據(jù)在上述實(shí)驗(yàn)獲得栽培稻、雜草稻和(或)野生稻群體在不同蟲壓環(huán)境下的平均 復(fù)合適合度變化的差值比，計(jì)算出環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值U )，以此建立模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到 雜草稻或野生稻導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)的檢測方法。
[0011] 本發(fā)明中，步驟（1)所述的構(gòu)建不包括任何抗蟲轉(zhuǎn)基因的栽培稻、雜草稻和(或)野 生稻實(shí)驗(yàn)群體的流程為： (A) 混合2-5個(gè)不同栽培稻品種等量種子構(gòu)建栽培稻的實(shí)驗(yàn)群體，涉及的品種越多，實(shí) 驗(yàn)群體的遺傳背景越豐富，檢測的結(jié)果將越準(zhǔn)確； (B) 混合2-5個(gè)不同雜草稻群體的等量種子構(gòu)建雜草稻的實(shí)驗(yàn)群體； (C) 混合2-5個(gè)不同野生稻群體的等量種子構(gòu)建野生稻的實(shí)驗(yàn)群體，混合的雜草稻及 野生稻自然群體越多，實(shí)驗(yàn)群體的遺傳背景就越豐富，檢測的結(jié)果將越準(zhǔn)確。
[0012] 本發(fā)明中，步驟(2)所述的利用尼龍網(wǎng)制作罩籠，設(shè)計(jì)用于模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移導(dǎo) 致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的田間種植受控實(shí)驗(yàn)的流程為：用尼龍網(wǎng)（40-60目，紗網(wǎng)孔眼大小以能夠?qū)⑼?界靶標(biāo)害蟲完全隔離為準(zhǔn))的罩籠，建立不同靶標(biāo)害蟲水平的罩籠實(shí)驗(yàn)環(huán)境。在不同的罩籠 實(shí)驗(yàn)條件下，栽培稻、雜草稻和(或)野生稻的實(shí)驗(yàn)群體分小區(qū)種植，每個(gè)小區(qū)至少包含6 X 6 = 36個(gè)植株，栽培稻和雜草稻實(shí)驗(yàn)群體的株距和行距設(shè)置為15cm X 15cm~20cm X 20cm之間；野生稻實(shí)驗(yàn)群體的株距和行距設(shè)置為40cm X 40cm~50cm X 50cm之間。在 相同蟲壓環(huán)境條件下（無蟲壓或高蟲壓），栽培稻、雜草稻和(或）野生稻的實(shí)驗(yàn)群體均按照 完全隨機(jī)分布種植于5 - 6個(gè)小區(qū)（重復(fù)），并于實(shí)驗(yàn)群體植株生活史的各生長階段，分別進(jìn) 行適合度相關(guān)性狀(包括:萌發(fā)種子成苗率、單株分蘗數(shù)、單株穗數(shù)和單株種子數(shù))的測量。
[0013]本發(fā)明中，步驟(3)所述的在罩籠中釋放不同密度轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)害蟲，建立不同的蟲 壓環(huán)境，根據(jù)栽培稻、雜草稻和(或)野生稻在不同蟲壓環(huán)境中被靶標(biāo)害蟲的危害程度，計(jì)算 適合度變化值的流程為:利用制作的罩籠，分別設(shè)置具有靶標(biāo)害蟲高蟲壓和無蟲壓的環(huán)境。 其中，高蟲壓環(huán)境是通過在栽培稻、雜草稻和(或)野生稻實(shí)驗(yàn)群體接種靶標(biāo)害蟲(如:栽二 化螟、三化螟和稻縱卷葉螟)實(shí)現(xiàn)，蟲口密度為180~250頭/m 2,接種的時(shí)間為30-40天的苗 期。以罩籠環(huán)境中靶標(biāo)害蟲的有無來模擬實(shí)驗(yàn)群體是否含有抗蟲轉(zhuǎn)基因，即：將接種靶標(biāo)害 蟲(高蟲壓)環(huán)境中的栽培稻、雜草稻和(或)野生稻實(shí)驗(yàn)群體視為"非轉(zhuǎn)基因群體"；將未接 種靶標(biāo)害蟲(無蟲壓)環(huán)境中的栽培稻、雜草稻和(或)野生稻實(shí)驗(yàn)群體視為"含抗蟲轉(zhuǎn)基因 群體"。將設(shè)計(jì)一致的栽培稻、雜草稻和(或)野生稻的實(shí)驗(yàn)群體，分別種植于無蟲壓和高蟲 壓的環(huán)境中。
[0014]其中，各表型適合度和平均復(fù)合適合度值(Fa)是基于各實(shí)驗(yàn)小區(qū)的適 合度相關(guān)性狀:萌發(fā)種子成苗率(/7 i)、單株分蘗數(shù)(/7 ?)、單株穗數(shù)(/7 ?)和單株種子數(shù)(/7 4) 的平均值來計(jì)算，計(jì)算方法如下： F = {Mo - MhV Mo ........................ 1 Fa= ( F i + F F F 4) / 4 ........................ 2 其中，#0為無蟲壓環(huán)境植株的測量值，#6為高蟲壓環(huán)境植株的測量值。
[0015] 本發(fā)明中，步驟(4)中，以（1)-(3)實(shí)驗(yàn)獲得的不同蟲壓環(huán)境下栽培稻、雜草稻和 (或)野生稻群體平均復(fù)合適合度變化的差值比數(shù)據(jù)計(jì)算出環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值(7?)，并以此建 立模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到雜草稻或野生稻檢測方法的流程為:利用平均復(fù)合適合度(F a)的 值，計(jì)算環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值(7?)，并以ΛΜ直來模擬評(píng)價(jià)目標(biāo)"抗蟲轉(zhuǎn)基因"漂移到雜草稻或野 生稻群體所帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)程度。環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)U )值的計(jì)算方法為： R ={F acv - F aw)/ F acv ................................. 3 其中，栽培稻的平均復(fù)合適合度值，/為野生近緣種的平均復(fù)合適合度值。
[0016] 利用環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)(7?)值，評(píng)價(jià)抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到栽培稻野生近緣種中而導(dǎo)致的 環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及其程度。理論上，ΛΜ直的變化在1~之間，當(dāng)ΛΜ直為1時(shí)，表明不存在任何環(huán) 境風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)ΛΜ直越接近1時(shí)，表明環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)越小，而當(dāng)ΛΜ直越遠(yuǎn)離1時(shí)，表明環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)越大。
[0017] 本發(fā)明中，各表型適合度相關(guān)性狀的檢測計(jì)算方法為： (1) 萌發(fā)種子成苗率=存活幼苗數(shù)/萌發(fā)實(shí)驗(yàn)種子總數(shù)，存活幼苗數(shù)的定義標(biāo)準(zhǔn)為： 當(dāng)種植的植株高度達(dá)到1 〇cm及以上，仍存活的幼苗； (2) 單株分蘗數(shù)(個(gè))=每個(gè)植株的分蘗總數(shù)，單株分蘗數(shù)在植株成熟期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)； (3) 單株穗數(shù)(個(gè)）=每個(gè)植株的總穗(花序)數(shù)，單株穗數(shù)在植株成熟期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)； (4) 單株種子數(shù)(個(gè)）=每個(gè)植株的飽粒種子總數(shù)，單株種子數(shù)在植株收獲后進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)。
[0018] 本發(fā)明提供了一種栽培稻中的抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到其野生近緣種群體帶來環(huán)境風(fēng) 險(xiǎn)的模擬檢測方法。本發(fā)明以栽培稻、雜草稻和(或)野生稻群體為實(shí)驗(yàn)材料，在罩籠(與外 界昆蟲隔離)控制的無靶標(biāo)害蟲蟲壓和靶標(biāo)害蟲高蟲壓的環(huán)境中進(jìn)行種植，將接種靶標(biāo)害 蟲(高蟲壓)環(huán)境中的栽培稻、雜草稻和(或)野生稻實(shí)驗(yàn)群體視為"非轉(zhuǎn)基因群體"；將未接 種靶標(biāo)害蟲(無蟲壓)環(huán)境中的栽培稻、雜草稻和(或)野生稻實(shí)驗(yàn)群體視為"含抗蟲轉(zhuǎn)基因 群體"；通過測量各實(shí)驗(yàn)群體的各表型性狀(包括:萌發(fā)種子成苗率，單株分蘗數(shù)，單株穗數(shù) 和單株種子數(shù))適合度(們，計(jì)算分析栽培稻群體與野生近緣種群體在靶標(biāo)害蟲不同的危害 水平環(huán)境下，根據(jù)其平均復(fù)合適合度變化的差值比，計(jì)算出環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值(扔，以此來模 擬和計(jì)算抗蟲轉(zhuǎn)基因從栽培稻漂移到雜草稻和野生稻以后帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及風(fēng)險(xiǎn)程度。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是： (1) 在受控實(shí)驗(yàn)條件下，不在環(huán)境中使用任何抗蟲轉(zhuǎn)基因（植株），仍能夠檢測和模擬分 析由抗蟲轉(zhuǎn)基因帶來的適合度差異，并分析抗蟲轉(zhuǎn)基因釋放的潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，不僅實(shí)驗(yàn)安 全，而且檢測結(jié)果可靠； (2) 不涉及任何抗蟲轉(zhuǎn)基因栽培稻的環(huán)境釋放，因此不需要申請(qǐng)相關(guān)轉(zhuǎn)基因田間實(shí)驗(yàn) 的許可便可以進(jìn)行安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，也不存在任何由于對(duì)轉(zhuǎn)基因栽培稻釋放監(jiān)管不善而導(dǎo)致 的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)； (3) 可以鎖定不同類型的轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)害蟲，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)性強(qiáng)，有利于對(duì)不同類型的 抗蟲轉(zhuǎn)基因栽培稻進(jìn)行環(huán)境安全評(píng)價(jià)，不存在盲目評(píng)價(jià)的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)用前景良好。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1: 利用本發(fā)明的方法，模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因栽培稻中的Β?轉(zhuǎn)基因漂移到雜草稻群體的環(huán) 境風(fēng)險(xiǎn)的檢測和評(píng)價(jià)。用于實(shí)驗(yàn)的栽培稻和雜草稻材料如表1所示。
[0021] 表1.實(shí)驗(yàn)材料
(1) 通過如下步驟構(gòu)建不包括任何抗蟲轉(zhuǎn)基因的栽培稻和雜草稻實(shí)驗(yàn)群體： 混合3個(gè)不同品種栽培稻(表1)的等量種子，構(gòu)成栽培稻實(shí)驗(yàn)群體，混合3個(gè)不同雜草稻 群體(表1)的等量種子，構(gòu)成雜草稻實(shí)驗(yàn)群體； (2) 利用50目尼龍網(wǎng)制作的罩籠，設(shè)計(jì)用于模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的田間 種植受控實(shí)驗(yàn)的步驟如下： 在罩籠條件下，設(shè)立除"高蟲壓"或"無蟲壓"以外，其它環(huán)境條件均一致的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū) (兩個(gè)罩籠），分別將上述栽培稻和雜草稻實(shí)驗(yàn)群體在兩個(gè)罩籠中按不同實(shí)驗(yàn)小區(qū)種植，每 一個(gè)處理(栽培稻和雜草稻)設(shè)置5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)（重復(fù)）內(nèi)分別種植栽培 稻或雜草稻，種植的植株數(shù)為:6 X 6 = 36,植株間的株距和行距均為20cm X 20cm。栽 培稻和雜草稻的實(shí)驗(yàn)小區(qū)均按照完全隨機(jī)分布種植； (3) 在"高蟲壓"罩籠中，接種一定密度(見后面描述)的靶標(biāo)害蟲，形成"高蟲壓"實(shí)驗(yàn)環(huán) 境;在"無蟲壓"罩籠中，不接種任何昆蟲，形成"無蟲壓"實(shí)驗(yàn)環(huán)境。根據(jù)栽培稻和雜草稻在 不同蟲壓實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，被靶標(biāo)害蟲危害的程度及其差異，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)群體的平均復(fù)合適合 度，步驟如下： 轉(zhuǎn)基因抗蟲栽培稻的主要靶標(biāo)害蟲為二化螟和三化螟。在高蟲壓(釋放二化螟和三 化螟)罩籠中，于栽培稻和雜草稻種子萌發(fā)后30天的幼苗期，分別對(duì)每一個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)接種二 化螟和三化螟蟲卵，在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)分別隨機(jī)擺放3個(gè)含有二化螟卵塊的U型玻璃管和3 個(gè)含有三化螟卵塊的U型玻璃管(每一個(gè)U型管包含約50個(gè)蟲卵），形成高蟲壓的環(huán)境，對(duì)栽 培稻和雜草稻的檢測、分析和比較均在高蟲壓和無蟲壓的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行。在栽培稻生長 盛期和成熟期，分別分析不同環(huán)境中的蟲壓。結(jié)果為:在高蟲壓環(huán)境條件下，每株枯心數(shù)為 0.05，而在無蟲壓環(huán)境條件下，每株枯心數(shù)為0，有顯著的差異，表明蟲壓環(huán)境設(shè)置成功； 在各實(shí)驗(yàn)群體植株生活史的各生長階段，分別進(jìn)行適合度相關(guān)性狀(包括:萌發(fā)種子成 苗率(/ 71)、單株分蘗數(shù)(/7 ?)、單株穗數(shù)(/7 ?)和單株種子數(shù)(/7 4))的測量，獲得各形態(tài)性狀的 適合度(F1-4)和平均復(fù)合適合度值(F a)(表2)。適合度及復(fù)合適合度的計(jì)算方法為： F = {Mo - MhV Mo 其中，# 〇為無蟲壓環(huán)境植株的測量值，#6為高蟲壓環(huán)境植株的測量值。
[0022] 凡=(尸1 +尸汁尸計(jì)尸4)/ 4。
[0023] 表2.栽培稻和雜草稻群體的各形態(tài)性狀的適合度值(F )
表示無蟲壓環(huán)境下植株的測量值;表示高蟲壓環(huán)境下植株的測量值； F 表示栽培稻的平均復(fù)合適合度值;F Μ:表示雜草稻的平均復(fù)合適合度值； (4) 利用上述實(shí)驗(yàn)和檢測獲得的數(shù)據(jù)，分別計(jì)算在不同蟲壓環(huán)境下栽培稻、雜草稻群體 平均復(fù)合適合度，并根據(jù)其平均復(fù)合適合度變化的差值比計(jì)算出的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)(7?)，以 此建立模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到雜草稻群體導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)的檢測方法，步驟如下： 利用平均復(fù)合適合度(Fa)的值，來計(jì)算環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)U )，并以ΛΜ直來評(píng)價(jià)目標(biāo)"抗 蟲轉(zhuǎn)基因"漂移到雜草稻群體所帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)程度，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)(7?)值的計(jì)算方法為： R ={F acv - F awl)/ F acv F ^^為栽培稻平均復(fù)合適合度值，F(xiàn) 為雜草稻平均復(fù)合適合度值。
[0024] 因此，本實(shí)驗(yàn)中：7? =(0.46-0.05)/ 0.46 = 0.89。
[0025] 由于轉(zhuǎn)基因"從轉(zhuǎn)基因抗蟲栽培稻漂移到雜草稻群體之后帶來的環(huán)境風(fēng) 險(xiǎn)指數(shù)U )值為0.89,接近于1。因此，根據(jù)上述模擬分析結(jié)果可以推測轉(zhuǎn)基因"漂移到 雜草稻群體中可能導(dǎo)致較低的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。
[0026] 實(shí)施例2 利用本發(fā)明的方法，模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因栽培稻中的Β?轉(zhuǎn)基因漂移到野生稻群體的環(huán) 境風(fēng)險(xiǎn)的檢測和評(píng)價(jià)。用于實(shí)驗(yàn)的栽培稻和野生稻材料如表3所示。
[0027] 表3.實(shí)驗(yàn)材料
(1) 通過如下步驟構(gòu)建不包括任何抗蟲轉(zhuǎn)基因的栽培稻和野生稻實(shí)驗(yàn)群體： 混合3個(gè)不同品種栽培稻(表3)的等量種子，構(gòu)成栽培稻實(shí)驗(yàn)群體，混合3個(gè)不同野生稻 群體(表3)的等量種子，構(gòu)成野生稻實(shí)驗(yàn)群體； (2) 利用50目尼龍網(wǎng)制作的罩籠，設(shè)計(jì)用于模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的田間 種植受控實(shí)驗(yàn)的步驟如下： 在罩籠條件下，設(shè)立除"高蟲壓"或"無蟲壓"以外，其它環(huán)境條件均一致的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū) (兩個(gè)罩籠），分別將上述栽培稻和野生稻實(shí)驗(yàn)群體在兩個(gè)罩籠中按不同實(shí)驗(yàn)小區(qū)種植，每 一個(gè)處理(栽培稻和野生稻)設(shè)置5個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)（重復(fù)）內(nèi)分別種植栽培 稻或野生稻，種植的植株數(shù)為:6 X 6 = 36,栽培稻種植的株距和行距為20cm X 20cm， 野生稻種植的株距和行距為35cm X 35cm。栽培稻和野生稻的實(shí)驗(yàn)小區(qū)均按照完全隨機(jī)分 布種植； (3) 在"高蟲壓"罩籠中，接種一定密度(見后面描述)的靶標(biāo)害蟲，形成"高蟲壓"實(shí)驗(yàn)環(huán) 境;在"無蟲壓"罩籠中，不接種任何昆蟲，形成"無蟲壓"實(shí)驗(yàn)環(huán)境。根據(jù)栽培稻和野生稻在 不同蟲壓實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，被靶標(biāo)害蟲危害的程度及其差異，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)群體的平均復(fù)合適合 度，步驟如下： 轉(zhuǎn)基因抗蟲栽培稻的主要靶標(biāo)害蟲為二化螟和三化螟。在高蟲壓(釋放二化螟和三 化螟)罩籠中，于栽培稻和野生稻種子萌發(fā)后30天的幼苗期，分別對(duì)每一個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)接種二 化螟和三化螟蟲卵，在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)分別隨機(jī)擺放3個(gè)含有二化螟卵塊的U型玻璃管和3 個(gè)含有三化螟卵塊的U型玻璃管(每一個(gè)U型管包含約50個(gè)蟲卵），形成高蟲壓的環(huán)境，對(duì)栽 培稻和野生稻的檢測、分析和比較均在高蟲壓和無蟲壓的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行。在栽培稻和野 生稻生長盛期和成熟期，分別分析不同環(huán)境中的蟲壓。結(jié)果為:在高蟲壓環(huán)境條件下，每株 枯心數(shù)為0.03，而在無蟲壓環(huán)境條件下，每株枯心數(shù)為0，有顯著的差異，表明蟲壓環(huán)境設(shè)置 成功。
[0028] 在各實(shí)驗(yàn)群體植株生活史的各生長階段，分別進(jìn)行適合度相關(guān)性狀(包括:萌發(fā)種 子成苗率(/7 i)、單株分蘗數(shù)(/7 ?)、單株穗數(shù)(/7 ?)和單株種子數(shù)(/7 4))的測量，獲得各形態(tài)性 狀的適合度(Fi-4)和平均復(fù)合適合度值(Fa)(表4)。適合度及復(fù)合適合度的計(jì)算方法為： F = {Mo - MhV Mo 其中，# 〇為無蟲壓環(huán)境植株的測量值，胤為高蟲壓環(huán)境植株的測量值。
[0029] Fa=(.Fi + F^F^F 4)/ A 表4.栽培稻和野生稻群體的各形態(tài)性狀的適合度值(F )。
[0030] # 表示無蟲壓環(huán)境植株的測量值;表示高蟲壓環(huán)境植株的測量值； F 表示栽培稻的平均復(fù)合適合度值;F 表示野生稻的平均復(fù)合適合度值； (4)利用上述實(shí)驗(yàn)和檢測獲得的數(shù)據(jù)，分別計(jì)算在不同蟲壓環(huán)境下栽培稻和野生稻群 體平均復(fù)合適合度，并根據(jù)其平均復(fù)合適合度變化的差值比計(jì)算出的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值U )，以此建立模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到野生稻群體導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)的檢測方法，步驟如下： 利用平均復(fù)合適合度(Fa)的值，來計(jì)算環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)U )，并以ΛΜ直來評(píng)價(jià)目標(biāo)"抗 蟲轉(zhuǎn)基因"漂移到野生稻群體所帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)程度，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)(7?)值的計(jì)算方法為： R =iF CV - F aw2)/ F CV 栽培稻平均復(fù)合適合度值，為雜草稻平均復(fù)合適合度值。
[0031] 因此，本實(shí)驗(yàn)中：7? =(0.46 - 0.03)/ 0.46=0.93。
[0032] 由于轉(zhuǎn)基因"從轉(zhuǎn)基因抗蟲栽培稻漂移到野生稻群體之后帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn) 指數(shù)(7?)值為0.93,接近1，因此可以推測轉(zhuǎn)基因"漂移到野生稻群體中，將產(chǎn)生極小的 環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種設(shè)置選擇壓模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的檢測方法，其特征在于:通過檢測 和計(jì)算分析在有靶標(biāo)害蟲環(huán)境條件下栽培稻群體與野生近緣種群體被危害的水平，根據(jù)其 平均復(fù)合適合度變化的差值比而計(jì)算出的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值，來模擬檢測抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移帶 來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)及其程度，具體步驟為： (1) 構(gòu)建不包括任何轉(zhuǎn)基因的栽培稻、雜草稻和/或野生稻的實(shí)驗(yàn)群體； (2) 利用40-60目尼龍網(wǎng)制作的罩籠，設(shè)計(jì)用于模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的田 間種植受控實(shí)驗(yàn)； (3) 在罩籠中釋放不同密度的轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)害蟲，建立不同蟲壓的環(huán)境，根據(jù)栽培稻、雜 草稻和/或野生稻群體在不同蟲壓環(huán)境中被靶標(biāo)害蟲的危害程度，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)群體的平均 復(fù)合適合度； (4) 根據(jù)在上述實(shí)驗(yàn)獲得栽培稻、雜草稻和/或野生稻群體在不同蟲壓環(huán)境下的平均復(fù) 合適合度變化的差值比，計(jì)算出環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值(扔，以此建立模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到雜草 稻或野生稻導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)的檢測方法。2. 按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟（1)所述的構(gòu)建不包括任何抗蟲轉(zhuǎn) 基因的栽培稻、雜草稻和/或野生稻實(shí)驗(yàn)群體的流程為： (A) 混合2-5個(gè)不同栽培稻品種等量種子構(gòu)建栽培稻的實(shí)驗(yàn)群體，涉及的品種越多，實(shí) 驗(yàn)群體的遺傳背景越豐富，檢測的結(jié)果將越準(zhǔn)確； (B) 混合2-5個(gè)不同雜草稻群體的等量種子構(gòu)建雜草稻的實(shí)驗(yàn)群體； (C) 混合2-5個(gè)不同野生稻群體的等量種子構(gòu)建野生稻的實(shí)驗(yàn)群體，混合的雜草稻及 野生稻野外自然群體越多，實(shí)驗(yàn)群體的遺傳背景就越豐富，檢測的結(jié)果將越準(zhǔn)確。3. 按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述的利用40-60目尼龍網(wǎng)制作 的罩籠，設(shè)計(jì)用于模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移導(dǎo)致環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的田間種植受控實(shí)驗(yàn)的流程為：用尼 龍網(wǎng)罩籠，建立不同靶標(biāo)害蟲水平的罩籠實(shí)驗(yàn)環(huán)境，在不同的罩籠實(shí)驗(yàn)條件下，栽培稻、雜 草稻和/或野生稻的實(shí)驗(yàn)群體分小區(qū)種植，每個(gè)小區(qū)至少包含6 X 6 = 36個(gè)植株，栽培稻 和雜草稻實(shí)驗(yàn)群體的株距和行距設(shè)置為15cm X 15cm~20cm X 20cm之間；野生稻實(shí)驗(yàn) 群體的株距和行距設(shè)置為40cm X 40cm~50cm X 50cm之間；在相同蟲壓環(huán)境條件下， 栽培稻、雜草稻和/或野生稻的實(shí)驗(yàn)群體均按照完全隨機(jī)分布種植于5 - 6個(gè)小區(qū)，并于實(shí) 驗(yàn)群體植株生活史的各生長階段，分別進(jìn)行適合度相關(guān)性狀測量，性狀包括:萌發(fā)種子成苗 率、單株分蘗數(shù)、單株穗數(shù)和單株種子數(shù)。4. 按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(3)所述的在罩籠中釋放不同密度 的轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)害蟲，建立不同蟲壓的環(huán)境，根據(jù)栽培稻、雜草稻/或野生稻群體在不同蟲壓 環(huán)境中被靶標(biāo)害蟲的危害程度，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)群體的平均復(fù)合適合度的流程為:利用制作的 罩籠，分別設(shè)置具有靶標(biāo)害蟲高蟲壓和無蟲壓的環(huán)境;其中，高蟲壓環(huán)境是通過在栽培稻、 雜草稻和/或野生稻實(shí)驗(yàn)群體接種靶標(biāo)害蟲實(shí)現(xiàn)，接種靶標(biāo)害蟲的幼蟲，密度為180~250 頭/m 2,接種的時(shí)間為30-40天的苗期；以罩籠環(huán)境中靶標(biāo)害蟲的有無來模擬實(shí)驗(yàn)群體是否 含有抗蟲轉(zhuǎn)基因，即：將接種靶標(biāo)害蟲即高蟲壓環(huán)境中的栽培稻、雜草稻和/或野生稻實(shí)驗(yàn) 群體視為"非轉(zhuǎn)基因群體"；將未接種靶標(biāo)害蟲即無蟲壓環(huán)境中的栽培稻、雜草稻和/或野生 稻實(shí)驗(yàn)群體視為"含抗蟲轉(zhuǎn)基因群體"；將設(shè)計(jì)一致的栽培稻、雜草稻和/或野生稻的實(shí)驗(yàn)群 體，分別種植于無蟲壓和高蟲壓的環(huán)境中； 其中，各表型適合度Λ-巧和平均復(fù)合適合度值是基于各實(shí)驗(yàn)小區(qū)的適合度相關(guān)性 狀:萌發(fā)種子成苗率Z7/、單株分蘗數(shù)/?、單株穗數(shù)/?和單株種子數(shù)的平均值來計(jì)算，計(jì)算方 法如下： F = iM o-M hV Mo ................................................1 Fa= ( F i + F 2^ F 3^ F 4) / 4 ....................................2 其中，# 0為無蟲壓環(huán)境植株的測量值，# 6為高蟲壓環(huán)境植株的測量值。5.按權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟(4)所述的根據(jù)在上述實(shí)驗(yàn)獲得栽 培稻、雜草稻和/或野生稻群體在不同蟲壓環(huán)境下的平均復(fù)合適合度變化的差值比，計(jì)算出 環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值7?，以此建立模擬抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到雜草稻或野生稻導(dǎo)致風(fēng)險(xiǎn)的檢測方法 的流程為:利用平均復(fù)合適合度的值，計(jì)算環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)值7?，并以ΛΜ直來模擬評(píng)價(jià)目標(biāo) "抗蟲轉(zhuǎn)基因"漂移到雜草稻或野生稻群體所帶來的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)程度;環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)ΛΜ直的計(jì) 算方法為： R ={F acv - F aw)/ F acv .............................................3 其中，/^~為栽培稻的平均復(fù)合適合度值，/為野生近緣種的平均復(fù)合適合度值； 利用環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)ΛΜ直，評(píng)價(jià)抗蟲轉(zhuǎn)基因漂移到栽培稻野生近緣種中而導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng) 險(xiǎn)及其程度;ΛΜ直的變化在1~之間，當(dāng)ΛΜ直為1時(shí)，表明不存在任何環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)ΛΜ直 越接近1時(shí)，表明環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)越小，而當(dāng)ΛΜ直越遠(yuǎn)離1時(shí)，表明環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)越大。
【文檔編號(hào)】A01C1/02GK106093367SQ201610425285
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日
【發(fā)明人】盧寶榮, 蔡星星, 楊超
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)