一種尾巨桉流式檢測(cè)的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物倍性檢測(cè)領(lǐng)域，公開了一種尾巨桉流式檢測(cè)的方法。該方法包括以下步驟：(1)取尾巨桉DH32?29的嫩葉加入裂解液中，用刀片切嫩葉，裂解，得細(xì)胞裂解懸浮液；(2)將步驟(1)中所得的細(xì)胞裂解懸浮液過濾，將過濾后的液體離心，倒掉上清液，再次加入裂解液，使沉淀中的細(xì)胞核重新懸浮，然后再過濾，得濾液；(3)向步驟(2)中所得的濾液中加入RNase酶溶液進(jìn)行酶解，得酶解液；(4)向步驟(3)中所得的酶解液中加入PI染液進(jìn)行染色，得染色液；(5)將步驟(4)中所得的染色液在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。該方法可實(shí)現(xiàn)野外取材后即時(shí)制備樣品，獲得的細(xì)胞核染色液2天(48小時(shí))后做流式檢測(cè)分析條件下，可確保檢測(cè)效果的穩(wěn)定性，解除了流式檢測(cè)要采后即時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的局限。
【專利說明】
一種尾巨桉流式檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物倍性檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種尾巨桉流式檢測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)是在二十世紀(jì)50年代誕生的一項(xiàng)新技術(shù)，但直 到二十世紀(jì)80年代末期這項(xiàng)技術(shù)才在植物科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，其主要應(yīng)用于細(xì)胞核 DNA含量測(cè)定，DNA倍性鑒定以及細(xì)胞周期分析等研究。該技術(shù)在植物中能否成功運(yùn)用的關(guān) 鍵點(diǎn)在于能否制備出植物材料的單細(xì)胞(或單細(xì)胞核)懸浮液，科研人員針對(duì)這一難題一直 在不斷改進(jìn)細(xì)胞檢測(cè)前處理技術(shù)，例如Hell er(1973)利用水解酶消化植物的細(xì)胞壁來(lái)釋放 細(xì)胞核，但是這種方式很耗時(shí)，后人很少繼續(xù)延用這種方法;在此之后，Ulrich( 1986、1988) 和Bergounioux等（1988,1992)改進(jìn)了方法，利用完整原生質(zhì)體的低滲裂解作用來(lái)釋放細(xì)胞 核，這一改進(jìn)也很耗時(shí)，而且，從一些物種或某種組織類型獲得完整的原生質(zhì)體的難度也限 制了這一應(yīng)用。此外，Galbraith等（1983)開發(fā)了一種在裂解液中通過切碎植物組織的細(xì)胞 進(jìn)行核裂解的方法，這一方法快速，實(shí)用，并成為了一種在植物流式細(xì)胞術(shù)中裂解細(xì)胞核的 主要且最可靠的方法。但是，因?yàn)橹参锎嬖诮獬?xì)胞壁的固定和束縛時(shí)難度大等問題，因 此，雖然有部分植物流式裂解的前處理獲得了成功，但是，仍然有大量植物至今沒有獲得裂 解效果達(dá)到流式檢測(cè)要求的裂解液。特別是對(duì)于木本植物，其木質(zhì)化程度高，不僅有堅(jiān)固且 厚的細(xì)胞壁，還含有大量次生代謝產(chǎn)物(如單寧酸等物質(zhì))--使細(xì)胞質(zhì)對(duì)裂解液的染色抵 抗作用大，這些因素導(dǎo)致裂解和懸浮單細(xì)胞時(shí)更加困難。在實(shí)踐中，獲得效果優(yōu)良裂解液的 物種也較少。并且，即使裂解獲得了成功，也存在碎片多，細(xì)胞核不完整，細(xì)胞粘連聚集，染 色不均勻，產(chǎn)量低和CV值(反應(yīng)細(xì)胞核完整性的指標(biāo))達(dá)不到要求等問題。另外，葉片的新鮮 程度也對(duì)檢測(cè)結(jié)果有很大影響，已經(jīng)開發(fā)出的裂解液要求采后要及時(shí)裂解和檢測(cè)，否則，檢 測(cè)結(jié)果會(huì)受到很大影響，因?yàn)橹参锖芏鄷r(shí)候是野外取樣，但流式細(xì)胞儀是大型儀器，不能隨 意搬動(dòng)，很難達(dá)到處理后及時(shí)在野外或就近檢測(cè)的要求，因此，如果樣品在裂解后能夠在常 溫下保持較長(zhǎng)時(shí)間的達(dá)到檢測(cè)效果的穩(wěn)定，則可以解決這一難題。
[0003] 桉樹(Eucalyptus)是世界三大速生樹種之一，在世界林業(yè)產(chǎn)業(yè)中具有非常重要的 地位，桉樹現(xiàn)在也是中國(guó)人工林木材產(chǎn)量最多的樹種。有如此重要地位和價(jià)值的樹種，開發(fā) 和推進(jìn)包含其遺傳育種在內(nèi)的各項(xiàng)生物技術(shù)，發(fā)掘其利用潛力，進(jìn)一步提高其生產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)和 社會(huì)效益，具有非常重要的意義。但因?yàn)槠浼?xì)胞核裂解技術(shù)一直未能開發(fā)成熟，其DNA倍性 鑒定(主要用于桉樹的倍性育種）、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和相關(guān)代謝等研究一直未能開展，嚴(yán) 重制約了其倍性育種等育種技術(shù)的開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為克服上述現(xiàn)有的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種尾巨桉流式檢測(cè) 的方法。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述尾巨桉流式檢測(cè)的方法在細(xì)胞核DNA含量測(cè)定， DNA倍性鑒定以及細(xì)胞周期分析等方面的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種尾巨桉流式檢測(cè)的方法，主要包括以下步驟：
[0008] (1)裂解:取尾巨桉DH32-29的嫩葉加入預(yù)冷的裂解液中，用刀片切嫩葉，使嫩葉的 大小為0.0025~0.0225mm 2，裂解，得細(xì)胞裂解懸浮液；
[0009] (2)過濾:將步驟(1)中所得的細(xì)胞裂解懸浮液過濾，將過濾后的液體離心，倒掉上 清液，加入預(yù)冷的裂解液，使沉淀中的細(xì)胞核重新懸浮，然后再過濾，得濾液；
[0010] (3)酶解:向步驟⑵中所得的濾液中加入RNase酶溶液進(jìn)行酶解，得酶解液；
[0011] (4)染色：向步驟(3)中所得的酶解液中加入PI染液進(jìn)行染色，得染色液；
[0012] (5)流式檢測(cè):將步驟(4)中所得的染色液在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。
[0013] 步驟（1)和步驟（2)中所述的裂解液的配方為0.2mol/L Tris，4mmol/L MgCl2 · 6H20,2mmol/L EDTA Na2,2H2〇,86mmol/L NaCl，10mmol/L焦亞硫酸鈉，100mmol/L檸檬酸， 1 % (v/v)PVP_10,1 % (v/v)Triton X_100,0·5% (v/v)Tween 20,裂解液的溶劑為雙蒸水， pH=7.5。常溫下配制，于4°C冰箱保存。
[0014] 步驟(1)和步驟(2)中所述的預(yù)冷的裂解液是指溫度保持在0~4°C的裂解液。
[0015] 步驟(1)中所述的裂解是指裂解5~20min。
[0016] 步驟(1)中所用的裂解液的用量為每40~50mg的嫩葉使用0.2~lmL的裂解液。 [0017]步驟(2)中所述的過濾是指用300目的尼龍濾膜過濾，再過濾是指用400目的尼龍 濾膜過濾。
[0018] 步驟(2)中所述的離心是指在4°C，lOOOrpm離心3~8min。
[0019] 步驟(2)中所述的重新懸浮的時(shí)間為5~20s。
[0020] 步驟(3)中所述的RNase酶溶液的濃度為lmg/mL，溶劑為雙蒸水，酶解在37 °C進(jìn)行， 酶解時(shí)間為30~45min。
[0021] 步驟(4)中所述的PI染液的濃度為lmg/mL，溶劑為雙蒸水。
[0022] 步驟(4)中所述的染色在0~4°C下進(jìn)行，染色時(shí)間至少為20min。
[0023]步驟（1)中所用的裂解液、步驟(2)中所用的裂解液、步驟(3)中所用的RNase酶溶 液以及步驟（4)中所用的PI染液的體積比為（0.2~1):(0.2~0.5) :(0.002~0.006): (0.005~0.05)〇
[0024]上述的尾巨桉流式檢測(cè)的方法在細(xì)胞核DNA含量測(cè)定，DNA倍性鑒定以及細(xì)胞周期 分析等方面的應(yīng)用。本發(fā)明的機(jī)理為：
[0025]裂解液既要破壞植物細(xì)胞的既有結(jié)構(gòu)，解除細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞的束縛和固定作用，使 細(xì)胞核能夠裂解出來(lái)，同時(shí)，還要保證整個(gè)檢測(cè)過程中細(xì)胞核的穩(wěn)定性，保護(hù)細(xì)胞核不被降 解并且能夠被染色；另外，還要保證細(xì)胞核不發(fā)生粘連。本發(fā)明的裂解液中各組分作用如 下:Tris在裂解液中作為緩沖液，維持裂解液的穩(wěn)定性;MgCl 2 · 6H20用來(lái)保持細(xì)胞核的完整 性和穩(wěn)定性，起到防止細(xì)胞核破裂的作用;EDTA(乙二胺四乙酸)和檸檬酸作為螯合劑，用來(lái) 結(jié)合二價(jià)陽(yáng)離子，充當(dāng)核酸酶的輔酶，增強(qiáng)DNA的染色能力和效果;NaCl用于維持合適的離 子強(qiáng)度;Triton X-100和Tween 20是非離子型洗滌劑，用來(lái)解除黏稠的細(xì)胞質(zhì)對(duì)細(xì)胞核的 包裹和隔離，釋放細(xì)胞核，減少細(xì)胞核和碎片的聚合親和力；焦亞硫酸鈉和PVP_10(聚乙烯 吡咯烷酮)起到防止木本植物所含酚類物質(zhì)被氧化的作用，且可抵消細(xì)胞質(zhì)對(duì)核DNA熒光染 色的負(fù)面作用一一木本植物酚類物質(zhì)被氧化后，其細(xì)胞核會(huì)難以被染色。
[0026] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0027] 本流式裂解液，針對(duì)木本植物的特性，進(jìn)行了改進(jìn)：（1)木本植物含有更多的單寧 等物質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)粘稠度大，導(dǎo)致裂解和染色難度變大，因此，增加了抗氧化的成分焦亞硫酸 鈉和PVP-10; (2)針對(duì)木本植物木質(zhì)化程度高，細(xì)胞壁堅(jiān)固且厚、固著作用強(qiáng)，細(xì)胞難以分離 出的特點(diǎn)，采用了Triton X-100和TWeen20,減弱了細(xì)胞質(zhì)對(duì)裂解液的染色抵抗作用，顯著 提高了細(xì)胞裂解率，獲得了可達(dá)到檢測(cè)要求(主要是碎片率，CV值等指標(biāo)達(dá)到檢測(cè)要求）的 裂解效果。
[0028]另外，采用本發(fā)明所述的裂解液進(jìn)行裂解處理后，在常溫25°C下保存48h后進(jìn)行檢 測(cè)，發(fā)現(xiàn)其分析結(jié)果無(wú)明顯變化，說明該裂解液具有良好的穩(wěn)定性，可以實(shí)現(xiàn)野外取材后間 隔2天(48小時(shí))做流式檢測(cè)分析的可行性，解除了流式檢測(cè)要采后即時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的局限，顯 著拓寬了流式檢測(cè)的應(yīng)用場(chǎng)合和應(yīng)用范圍。
【附圖說明】
[0029]圖1為尾巨桉DH32-29葉片在用裂解液裂解后染色20min后檢測(cè)的細(xì)胞核DNA直方 圖。
[0030] 圖2為尾巨桉DH32-29葉片在染色20min并放置48h后再次檢測(cè)的細(xì)胞核DNA直方 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0032] 實(shí)施例中所用試劑如果沒有特殊說明，均可從市場(chǎng)常規(guī)購(gòu)得。
[0033] 流式細(xì)胞儀采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司（Beckman Coulter，Inc .)的 CytoFLEX流式細(xì)胞儀，配置為空氣冷卻的氬離子激光器，檢測(cè)結(jié)果從其自帶軟件CyoExpert software(version 1 · 1 · 10.0.)上獲得。檢測(cè)中樣品流速限定為低速10yL/min，且在整個(gè)實(shí) 驗(yàn)過程中保持不變。每個(gè)材料設(shè)置兩次重復(fù)，兩次重復(fù)之間間隔24h以上，即取材時(shí)間間隔 一天以上，取平均值，每一個(gè)重復(fù)檢測(cè)時(shí)的細(xì)胞核數(shù)量均在8000個(gè)以上。
[0034]評(píng)價(jià)每一個(gè)材料檢測(cè)效果的參數(shù)為:FS，用于評(píng)價(jià)顆粒的相對(duì)大??；SS，用于評(píng)價(jià) 顆粒的相對(duì)光學(xué)復(fù)雜性;FL，指染上PI的細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度;CV值，評(píng)價(jià)細(xì)胞核的完整性和 DNA染色的效果;BF，評(píng)價(jià)樣本質(zhì)量;YF，比較懸浮液中細(xì)胞核數(shù)量和所用葉片組織中的細(xì)胞 核總數(shù)量。裂解效果較好的標(biāo)準(zhǔn)是高的FL值、YF值和低的CV值、DF值，其中：
[0037] YF(個(gè)*秒-1毫克-4的計(jì)算公式為：
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 裂解液的制備：首先用分析天平稱取24.23g Tris、0.81g MgCh · 6H2〇、0.82g EDTA Na2,2H2〇、5.03g NaCl、1.90g焦亞硫酸鈉、19.21g檸檬酸、lO.OOg PVP-10,放入洗干 凈的經(jīng)雙蒸水潤(rùn)洗過的燒杯，加入雙蒸水，玻璃棒攪拌至全部溶解;然后用移液槍移取lOmL Triton X-100和5mL Tween 20,待全部溶解后用1L的容量瓶定容;最后用pH計(jì)測(cè)量pH值后， 用lmo 1 /L的HC1溶液和10mo 1 /L NaOH溶液調(diào)整pH到指定值7.5，于4 °C冰箱保存。
[0041 ]摘取尾巨桉DH32-29栽培苗頂端2~3片嫩葉40mg，材料置于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿放置在 冰上，用移液槍吸取lmL 0~4°C的裂解液浸沒材料，用刀片切材料，切至材料呈0.01mm2左 右大小，裂解l〇min;細(xì)胞裂解懸浮液經(jīng)300目尼龍濾膜過濾以除去細(xì)胞碎片和大的殘?jiān)?濾 液在4°C，lOOOrpm離心5min;倒掉上清液，再加入400yL 0~4°C的裂解液使沉淀中的細(xì)胞核 重新懸浮l〇s(此操作仍在冰上進(jìn)行）；用400目尼龍濾膜再次過濾，得濾液;濾液中加入4yL lmg/mL RNase酶溶液(購(gòu)自上海生工）37°C酶解30min;最后加入20yL lmg/mL PI染液染色 20min;然后進(jìn)行流式檢測(cè)，其細(xì)胞核DNA直方圖如圖1所示，其裂解評(píng)估參數(shù)如表1所示。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] 將實(shí)施例1中進(jìn)行流式檢測(cè)后的裂解液置于25°C閉光條件下的泡沫盒內(nèi)48h，再次 進(jìn)行流式檢測(cè)，其細(xì)胞核DNA直方圖如圖2所示，其裂解評(píng)估參數(shù)如表1所示。
[0044]結(jié)果表明，兩個(gè)實(shí)施例檢測(cè)得到的峰型不變，說明樣品在染色后常溫25°C閉光保 存48h對(duì)裂解液的穩(wěn)定性沒有影響，因此，可以野外取樣，染色后常溫放置48h后檢測(cè)。
[0045] 表1尾巨桉DH32-29在不同檢測(cè)時(shí)間條件下的裂解評(píng)估參數(shù)比較
[0046]
[0047]從流式細(xì)胞儀檢測(cè)的裂解參數(shù)結(jié)果來(lái)看，熒光均值FL有所升高，且BF值有所下降， 說明時(shí)間越長(zhǎng)染色可能更充分，可檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，也說明了裂解液的穩(wěn)定性好;YF 略有下降，推測(cè)可能是部分細(xì)胞核發(fā)生分解;CV值從3.87%升高到4.51 %，但是仍然沒有超 過5%。從尾巨桉DH32-29葉片的細(xì)胞核DNA直方圖來(lái)看，常溫放置48h后得到的峰型與當(dāng)天 檢測(cè)所得基本一致。綜上所述，樣品染色后常溫放置48h對(duì)裂解液的穩(wěn)定性影響不大，檢測(cè) 效果無(wú)明顯變化。
[0048]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的任何改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種尾巨桉流式檢測(cè)的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 裂解:取尾巨桉DH32-29的嫩葉加入預(yù)冷的裂解液中，用刀片切嫩葉，使嫩葉的大小 為0.0025~0.0225mm2，裂解，得細(xì)胞裂解懸浮液； (2) 過濾：將步驟（1)中所得的細(xì)胞裂解懸浮液過濾，將過濾后的液體離心，倒掉上清 液，加入預(yù)冷的裂解液，使沉淀中的細(xì)胞核重新懸浮，然后再過濾，得濾液； (3) 酶解:向步驟(2)中所得的濾液中加入RNase酶溶液進(jìn)行酶解，得酶解液； (4) 染色：向步驟(3)中所得的酶解液中加入PI染液進(jìn)行染色，得染色液； (5) 流式檢測(cè):將步驟(4)中所得的染色液在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尾巨桉流式檢測(cè)的方法，其特征在于： 步驟（1)和步驟（2)中所述的裂解液的配方為0.2mol/L Tris · HCl，4mmol/LMgCl2 · 6H20,2mmol/L EDTA Na2,2H2〇,86mmol/L NaCl，10mmol/L焦亞硫酸鈉，100mmol/L檸檬酸， 體積分?jǐn)?shù)為1 %的PVP-10,體積分?jǐn)?shù)為1 %的Triton X-100，體積分?jǐn)?shù)為0.5%的Tween 20， 裂解液的溶劑為雙蒸水，pH=7.5，常溫下配制，4°C冰箱保存； 步驟(1)和步驟(2)中所述的預(yù)冷的裂解液是指溫度保持在0~4°C的裂解液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尾巨桉流式檢測(cè)的方法，其特征在于： 步驟（1)中所述的裂解是指裂解5~20min; 步驟(1)中所用的裂解液的用量為每40~50mg的嫩葉使用0.2~lmL的裂解液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尾巨桉流式檢測(cè)的方法，其特征在于： 步驟(2)中所述的過濾是指用300目的尼龍濾膜過濾，再過濾是指用400目的尼龍濾膜 過濾； 步驟(2)中所述的離心是指在4°C，lOOOrpm條件下離心3~8min; 步驟(2)中所述的重新懸浮的時(shí)間為5~20 s。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尾巨桉流式檢測(cè)的方法，其特征在于： 步驟(3)中所述的RNase酶溶液的濃度為lmg/mL，溶劑為雙蒸水，酶解溫度為37 °C，酶解 時(shí)間為30~45min。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尾巨桉流式檢測(cè)的方法，其特征在于： 步驟(4)中所述的PI染液的濃度為lmg/mL，溶劑為雙蒸水； 步驟(4)中所述的染色在0~4°C下進(jìn)行，染色時(shí)間至少為20min。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尾巨桉流式檢測(cè)的方法，其特征在于： 步驟（1)中所用的裂解液、步驟(2)中所用的裂解液、步驟(3)中所用的RNase酶溶液以 及步驟(4)中所用的PI染液的體積比為(0.2~1):(0.2~0.5) :(0.002~0.006) :(0.005~ 0.05)〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的尾巨桉流式檢測(cè)的方法在細(xì)胞核DNA含量測(cè)定，DNA 倍性鑒定以及細(xì)胞周期分析方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N15/14GK106092864SQ201610402098
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】韓超, 徐建民
【申請(qǐng)人】中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所