一種直接測(cè)定甘油三酯Sn?2位棕櫚酸含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種直接測(cè)定甘油三酯Sn?2位棕櫚酸含量的方法，采用GC?MS法進(jìn)行檢測(cè)，樣品前處理包括利用鹽酸?甲醇溶液對(duì)脂肪酸及分離的Sn?2位單甘脂進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，利用C16:0甲酯峰面積相對(duì)含量比值計(jì)算出Sn?2位棕櫚酸的絕對(duì)含量。本發(fā)明方法前處理操作簡(jiǎn)單，對(duì)樣本含水量沒(méi)有要求，縮短了前處理時(shí)間，提高了樣品回收率?？芍苯訙y(cè)定Sn?2位棕櫚酸含量，計(jì)算方法簡(jiǎn)單?？梢詰?yīng)用到豆粉、奶粉、牛奶、母乳，奶油，酸奶及其他乳制品中。
【專利說(shuō)明】
_種直接測(cè)定甘油三酯Sn-2位蹤櫚酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種直接測(cè)定甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含 量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪在嬰兒成長(zhǎng)發(fā)育中起重要作用，母乳和嬰兒配方奶粉中脂肪的含量雖然只占 總重量的3-4%，但卻為正值成長(zhǎng)發(fā)育階段的嬰兒提供50-60%的能量，同時(shí)對(duì)于多種維他 命和礦物質(zhì)的吸收有著關(guān)鍵性的作用。
[0003] 棕櫚酸(飽和脂肪酸_C16:0)是母乳中大量存在的飽和脂肪酸的其中一種。食物當(dāng) 中的脂肪是由脂肪酸構(gòu)成，并以三種形式存在于自然界中：飽和脂肪酸，單不飽和脂肪酸和 多不飽和脂肪酸。母乳和嬰兒配方奶粉中的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸是連在三叉形的甘 油基上。每個(gè)甘油基都可連接三個(gè)脂肪酸，稱作Sn-1位，Sn-2位和Sn-3位，也叫做alpha， beta 和gamma 位。
[0004] 所有形式的脂肪必須經(jīng)由小腸消化吸收后方能釋放其能量，棕櫚酸在不同位置的 結(jié)構(gòu)會(huì)對(duì)脂肪的攝取、消化、吸收等新陳代謝方面起到至關(guān)重要的作用。在腸道中，Sn-1位 和Sn-3位的脂肪酸在消化酶的分解作用下從三酸甘油酯中釋放出來(lái)而形成游離脂肪酸，并 與仍然連結(jié)在甘油基Sn-2位上的脂肪酸一起被腸道吸收，再轉(zhuǎn)化成嬰兒所需要的能量與營(yíng) 養(yǎng)。
[0005] 為了達(dá)到理想的健康，嬰兒的食物當(dāng)中同時(shí)需要飽和脂肪酸及不飽和脂肪酸，而 母乳中這兩種脂肪酸的組合比例處于完美的狀態(tài)。而在牛乳中以及絕大多數(shù)在市場(chǎng)上銷(xiāo)售 的嬰兒配方奶粉中的棕櫚酸，都是處于Sn-1和Sn-3位上。像棕櫚酸這樣的飽和脂肪酸大量 流失。這會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)問(wèn)題。第一，對(duì)于正值生長(zhǎng)及發(fā)育階段的嬰兒來(lái)說(shuō)，大量流失飽和脂肪 酸即流失了大量寶貴的能量來(lái)源，會(huì)對(duì)嬰兒的生長(zhǎng)及發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響。第二，同樣 重要，游離飽和脂肪酸會(huì)和食物中的鈣質(zhì)結(jié)合而形成鈣皂，使鈣質(zhì)不能進(jìn)入血液中，無(wú)助于 骨骼的正常生長(zhǎng)及發(fā)育。同時(shí)，由于腸道中大量鈣質(zhì)的流失會(huì)提高糞便的硬度，從而導(dǎo)致嬰 兒便秘和腹痛。由此可見(jiàn)，脂肪酸的結(jié)構(gòu)位置對(duì)于能量和礦物質(zhì)的吸收起到了關(guān)鍵作用。
[0006] 母乳中高達(dá)70 %的棕櫚酸連在分子主鏈中間的Sn-2位上，而不飽和脂肪酸主要連 在Sn-1和Sn-3位上。經(jīng)過(guò)消化后，這些不飽和脂肪酸很容易被腸道吸收而進(jìn)入到血液中。同 樣地，對(duì)于仍然連甘油基Sn-2位上的棕櫚酸也很容易被腸道所吸收。
[0007] 多年來(lái)，人們一直致力研究嬰兒配方奶粉的成分，使其盡可能接近母乳，并在很多 方面取得了成功。然而發(fā)展是無(wú)止境的。對(duì)于嬰兒配方奶粉中脂肪組合的更深層研究，大大 推動(dòng)了新一代嬰兒配方奶粉的發(fā)展，而新的研究成果可使嬰兒配方奶粉中脂肪結(jié)構(gòu)更接近 天然母乳。
[0008] Sn-2棕櫚酸(Sn-2Palmitate)是一種創(chuàng)新而且與母乳脂肪結(jié)構(gòu)最接近的母乳脂肪 代替品。多項(xiàng)研究表明，Sn-2棕櫚酸能為嬰兒提供多種獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)及健康好處。經(jīng)過(guò)嬰兒營(yíng) 養(yǎng)科學(xué)研究證明，Sn-2棕櫚酸是一種具有獨(dú)特脂肪結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)脂技術(shù)，且被公認(rèn)為嬰兒配 方奶粉脂肪類產(chǎn)品發(fā)展的一款具突破性的產(chǎn)品，亦是最接近母乳脂肪結(jié)構(gòu)的母乳脂肪代替 品。2008年中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部第13號(hào)公告批準(zhǔn)了0P0( 1，3_二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯） 作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑可用于嬰兒配方奶粉的生產(chǎn)，并于2010年中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部第1號(hào)公 告中明確了 OPO擴(kuò)大使用范圍及使用量。OPO被作為一種顯著有效的營(yíng)養(yǎng)功能成分正在被廣 泛的添加到嬰幼兒配方乳粉中，國(guó)際大型嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)爭(zhēng)相把"添加OPO"作為 宣傳亮點(diǎn)，大量已經(jīng)添加"OPO"的嬰幼兒配方乳粉正在市場(chǎng)上流通。而OPO中有效成分Sn-2 位棕櫚酸的檢測(cè)方法尚未明確。因此，亟待建立嬰幼兒配方乳粉中Sn-2位棕櫚酸的定量檢 測(cè)方法。
[0009] 目前Sn-2位棕櫚酸檢測(cè)方法：國(guó)標(biāo)《GB/T 24894-2010動(dòng)植物油脂甘三酯分子2-位 脂肪酸組分的測(cè)定》，由于前處理過(guò)程中涉及步驟復(fù)雜，操作繁瑣，回收率低；中國(guó)專利公開(kāi) 號(hào)CN104237475A公開(kāi)了一種間接測(cè)定1，3_二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯含量的方法，其從理 論計(jì)算過(guò)程復(fù)雜;文獻(xiàn)"氣相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中1，3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯 (馬小寧等，檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊)"公開(kāi)的方法需要比較特殊的儀器和復(fù)雜的前處理過(guò)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 為克服現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明提供一種直接測(cè)定甘油三酯sn-2位棕櫚酸含量的方 法，旨在為保障嬰幼兒乳品安全和質(zhì)量提供技術(shù)支持
[0011] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0012] 一種直接測(cè)定甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量的方法，采用GC-MS法進(jìn)行檢測(cè)，其樣品 前處理包括利用鹽酸-甲醇溶液對(duì)試樣進(jìn)行甲酯化反應(yīng)。
[0013] 上述直接測(cè)定甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量的方法，所述試樣包括待測(cè)樣品、待測(cè) 樣品水解后的脂肪溶液、待測(cè)樣品中分離的Sn-2位單甘油酯。
[0014] 優(yōu)選地，所述鹽酸-甲醇溶液中鹽酸濃度為0.5-3mol/L，進(jìn)一步優(yōu)選為0.5mol/L。 [0015]上述直接測(cè)定甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量的方法，包括采用GC-MS(氣相色譜-質(zhì) 譜)法進(jìn)行檢測(cè);優(yōu)選地，色譜條件如下：
[0016] GC:進(jìn)樣器：Thermo Scientific TriPlus RSH自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱:HP_88氣相色 譜柱（100m X 0 ? 250mm，0 ? 20WH);進(jìn)樣口溫度:200°C ;恒流速模式：lmL/min;進(jìn)樣量：lyL;分 流比：10:1;載氣:N2;柱溫箱升溫程序如下表：
[0017] 表柱溫箱升溫程序
[0018]
[0019] MS:電子轟擊離子源:El; scan模式；離子源溫度:280 °C ;傳輸線溫度：240 °C ;四級(jí) 桿質(zhì)量掃描范圍：35-400amu;溶劑延遲lOmin;
[0020]本發(fā)明方法計(jì)算Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸百分含量采用面積歸一法進(jìn)行定量。 [0021]優(yōu)選地，本發(fā)明采用氨基固相萃取柱分離Sn-2位單甘油酯;不僅操作簡(jiǎn)便，而且準(zhǔn) 確度更高。
[0022]具體地，上述直接測(cè)定甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量的方法，包括以下步驟：
[0023] 1)從待測(cè)樣品中提取脂肪，用豬胰酯酶水解，將水解后的脂肪溶液過(guò)氨基固相萃 取柱分離得Sn-2位單甘油酯；
[0024] 2)用上述鹽酸-甲醇溶液分別對(duì)上述水解后的脂肪溶液和Sn-2位單甘油酯進(jìn)行甲 酯化反應(yīng)，然后進(jìn)行GC-MS檢測(cè);根據(jù)峰面積獲得Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸百分含量；
[0025] 3)將待測(cè)樣品用鹽酸-甲醇溶液進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，按照與步驟2)相同的條件進(jìn)行 GC-MS檢測(cè)，按照外標(biāo)法(C16:0甲酯)獲得待測(cè)樣品中總棕櫚酸含量;計(jì)算獲得待測(cè)樣品中 Sn-2位棕櫚酸含量。
[0026] 若待測(cè)樣品為液態(tài)，例如牛奶、母乳、奶油、酸奶等，可以直接進(jìn)行甲酯化反應(yīng);若 待測(cè)樣品為固態(tài)，例如豆粉、配方奶粉等，可用適量水溶解后再進(jìn)行甲酯化反應(yīng)。
[0027] 所述從待測(cè)樣品中提取脂肪的方法可按現(xiàn)有技術(shù)方法進(jìn)行，例如食品中脂肪的測(cè) 定方法(GB/T 5009.6-2003)、食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測(cè)定（GB 5413.27-2010)、IS014156(IDF172)等。
[0028] 優(yōu)選地，所述從待測(cè)樣品中提取脂肪的方法包括:取待測(cè)樣品（或待測(cè)樣品溶液）， 加入適量氨水調(diào)節(jié)呈堿性，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加乙醇搖勻；分2次加入乙醚，搖勻；加入石 油醚，振蕩;靜置直至上層溶液澄清;重復(fù)以上步驟提取數(shù)次，將醚溶液合并，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下 45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得待測(cè)脂肪。
[0029] 所述用豬胰酯酶水解脂肪的方法可按現(xiàn)有技術(shù)方法進(jìn)行。
[0030] 優(yōu)選地，所述用氨基固相萃取柱分離Sn-2位單甘油酯的方法包括將水解后的脂肪 溶液加入到用正己烷活化的氨基固相萃取柱中，棄去流出液；用正己烷-乙酸乙酯淋洗液 (v/v = 85:15)淋洗，棄去流出液;用二氯甲燒-甲醇洗脫液(v/v = 2:1)洗脫，收集洗脫液，氮 氣吹干，即得。
[0031] 優(yōu)選地，所述甲酯化反應(yīng)的方法包括：向試樣(包括待測(cè)樣品或待測(cè)樣品溶液、上 述水解后的脂肪溶液、Sn-2位單甘油脂）中加入鹽酸-甲醇溶液，加入正己烷和甲醇，振蕩混 勻，在80°C下恒溫水浴振蕩，取出試管用流動(dòng)水冷卻至室溫后，加入去離子水，冷凍離心。 [0032] 本發(fā)明方法前處理操作簡(jiǎn)單，改進(jìn)了《GB 541327-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒 食品和乳品中脂肪酸的測(cè)定》的甲酯化方法，國(guó)標(biāo)方法液體樣本需求量大，要求凍干后取 〇.5g，這對(duì)很多珍貴的樣本是比較難達(dá)到的，本發(fā)明方法只需要250uL，另外國(guó)標(biāo)方法液體 樣本需要凍干，使水分含量低于5%，前處理過(guò)程漫長(zhǎng)，耗時(shí)長(zhǎng)，易損失，并且凍干操作會(huì)導(dǎo) 致樣本脂肪分布不均勻，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本發(fā)明改進(jìn)方法使用鹽酸-甲醇溶液進(jìn)行甲酯化反 應(yīng)，對(duì)樣本含水量沒(méi)有要求，縮短了前處理時(shí)間，提高了樣品回收率。本發(fā)明用氨基固相萃 取柱法取代傳統(tǒng)薄層層析法分離單甘油酯不僅操作簡(jiǎn)單，分離效果好，而且回收率高，測(cè)定 結(jié)果準(zhǔn)確。添加回收率范圍為91.7~98.5%，RSD為1.56%，重現(xiàn)性良好，完全適用于甘油三 酯Sn-2位棕櫚酸含量的檢測(cè)。另外，本發(fā)明方法可直接測(cè)定Sn-2位棕櫚酸含量，計(jì)算方法簡(jiǎn) 單。本發(fā)明方法應(yīng)用種類多，可以應(yīng)用到豆粉、奶粉、牛奶、母乳，奶油，酸奶及其他乳制品中
【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為實(shí)驗(yàn)例1中37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。
[0034]圖2為實(shí)驗(yàn)例1中Sn-2位棕櫚酸和總棕櫚酸的色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用 試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過(guò)正規(guī)渠道商購(gòu)買(mǎi)得到的常規(guī)產(chǎn)品。
[0036]材料與儀器：
[0037]某品牌嬰兒配方奶粉，購(gòu)于大型超市;豬胰酯酶(3〇-9〇Units/mg)，Sigma公司；氨 基固相萃取柱（50011^/61111^)48613公司；薄層層析硅膠板（1001]1111\2001]1111，厚度0.20~ 0.25mm)青島海洋化工有限公司；37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（多99 %，1 Omg/mL) Sigma公司、棕 櫚酸甘油三酯（多98%，lg)Aladdin公司；去離子水;三羥甲基氨基甲烷，Sigma試劑公司；膽 酸鈉，Sigma公司;氯化|丐，Sigma公司，氫氧化鉀，Sigma公司；其他試劑為色譜純。
[0038] GC-MS系統(tǒng)TRACE1300-ISQ-LT系統(tǒng);超聲清洗儀昆山市超聲儀器有限公司；恒溫水 浴鍋余姚市東方電工儀器廠;渦旋振蕩器SCILOGEX公司；高速冷凍離心機(jī):Sigma公司；氮吹 儀天津奧特賽恩斯儀器有限公司。
[0039] 0.5mol/L的鹽酸-甲醇溶液購(gòu)自Sigma公司
[0040] Tris-HCl緩沖溶液（0.5mol/L):三羥甲基氨基甲烷（tris base)，分子量為 121.14。取60.578的廿18&&86溶解于適量的水中，用6111〇1/111(：1溶液調(diào)至?11值為8.0，后定 容至500mL。
[0041 ] 膽酸鈉溶液(0.5g/L):取膽酸鈉0.5g，用水定容至lOOOmL。
[0042] 氯化鈣溶液(220g/L):取22g氯化鈣用水定容至100mL。
[0043] 正己烷:乙酸乙酯淋洗液:體積比為85:15,分析純。
[0044] 二氯甲烷-甲醇洗脫液:體積比為2:1，分析純。
[0045] 實(shí)施例1
[0046]直接測(cè)定甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量的方法，包括以下步驟：
[0047] 1)提取脂肪:取配方奶粉樣品2g于50mL試管中，加入8mL水，溶解后加2mL氨水，充 分搖勻；加入2滴酚酞指示劑，用氨水調(diào)溶液呈堿性，轉(zhuǎn)移至150mL分液漏斗中，加10mL乙醇 搖勻;分兩次加入25mL乙醚，分別搖勻；加入25mL的石油醚，振蕩lmin;靜置直至上層溶液澄 清。重復(fù)以上步驟提取2次，將醚溶液合并至棕色圓底燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 至干，得待測(cè)脂肪。
[0048] 2)脂肪水解
[0049] 取50mg步驟1)制得的脂肪，加入20mg豬胰酯酶，2? OmL Tris-HCl緩沖溶液，0? 5mL 膽酸鈉溶液和〇.2mL氯化鈣溶液，振蕩混勻后，立即放入40°C的水浴鍋中，水浴2min，取出離 心管后劇烈振蕩2min，待冷卻后加入4mL正己燒，充分振蕩，5000r/min冷凍離心5min，得水 解后的脂肪溶液。
[0050] 3)分離Sn-2位單甘油酯
[0051 ]取氨基固相萃取柱，加入2mL正己烷，重復(fù)操作1次，活化氨基固相萃取柱。
[0052]取lmL步驟2)制得的水解后的脂肪溶液，加入到上述活化后的氨基固相萃取柱中， 棄去流出液;分4次共加入8mL正己烷-乙酸乙酯淋洗液(v/v = 85:15)，每次體積為2mL，棄去 流出液;分4次共加入8mL二氯甲烷-甲醇洗脫液(v/v = 2:l)，每次體積為2mL，收集洗脫液， 氮?dú)獯蹈?，編?hào)為試樣I。
[0053]另取lmL步驟2)制得的水解后的脂肪溶液，氮?dú)獯蹈?，編?hào)為試樣II。
[0054] 4)甲酯化反應(yīng)
[0055] 分別將上述試樣I和試樣II加入5mL 0.5mol/L的鹽酸-甲醇溶液，加入2mL正己烷， 2mL甲醇，振蕩混勻，在80°C下恒溫水浴振蕩2h，取出試管用流動(dòng)水冷卻至室溫后，加入2mL 去離子水，在5000r/min下冷凍離心5min，吸取1. OmL上層清液于進(jìn)樣瓶，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，檢 測(cè)前于_20°C下保存。
[0056] GC-MS檢測(cè)條件如下：
[0057] GC:進(jìn)樣器：Thermo Scientific TriPlus RSH自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱:HP_88氣相色 譜柱（100m X 0 ? 250mm，0 ? 20WH);進(jìn)樣口溫度:200°C ;恒流速模式：lmL/min;進(jìn)樣量：lyL;分 流比：10:1;載氣:N2;柱溫箱升溫程序如下表：
[0059] MS:電子轟擊離子源:El; scan模式；離子源溫度:280°C ;傳輸線溫度：240°C ;四級(jí) 桿質(zhì)量掃描范圍：35-400amu;溶劑延遲lOmin;
[0060] 5)總棕櫚酸測(cè)定
[0061] 稱取lg配方奶粉加4mL水溶解，取250uL溶液按照與步驟4)相同方法和條件進(jìn)行甲 酯化反應(yīng)及GC-MS檢測(cè)?？傋貦八岷堪凑胀鈽?biāo)法定量(C16:0甲酯）。
[0062] 6)計(jì)算
[0063] Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸百分含量=試樣I中C16:0峰面積+試樣II中C16:0峰面 積 X100%
[0064]根據(jù)Babcock法（即巴勃考克法)測(cè)得每100g上述配方奶粉的脂肪含量為19.6g。 [0065]根據(jù)上述方法，得到Sn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的百分含量為40.1 %。
[0066]根據(jù)上述方法步驟5)得到每100g上述配方奶粉中總棕櫚酸的含量為3.91g。
[0067] 可知，每100g上述配方奶粉中Sn-2位棕櫚酸的含量為:3.91g X 40.1 % = 1.57g; [0068]上述配方奶粉每100g脂肪中Sn-2位棕櫚酸的含量為：
[0069] 3.91X40.1% X 100^ 19.6 = 8.00(g) 〇
[0070] 實(shí)施例2
[0071]采用與實(shí)施例1相同的方法測(cè)定母乳中甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果如下：
[0072]根據(jù)Babcock法得到每100g母乳的脂肪含量為4.21g。
[0073]根據(jù)實(shí)施例1方法，得到SnSn-2棕櫚酸占總棕櫚酸的百分含量為60.3%。
[0074]根據(jù)實(shí)施例1步驟5)得到每100g母乳中總棕櫚酸的含量為0.61g。
[0075] 可知，每100g上述配方奶粉中Sn-2位棕櫚酸的含量為:0.61g X 60.3% =0.37g;
[0076]上述配方奶粉每100g脂肪中Sn-2位棕櫚酸的含量為：
[0077] 0.61X60.3% X 100^4.21 =8.74(g) 〇
[0078] 實(shí)驗(yàn)例1 [0079] 1實(shí)驗(yàn)方法
[0080] 1.1.1脂肪提取方法采用IS014156(IDF172)規(guī)定的方法提取嬰兒配方奶粉脂肪。 [00811 1.1.2豬胰酯酶水解脂肪向提取的脂肪中加入2mL 0.5mol/L Tris-HCl緩沖液 (pH7 ? 8)、0 ? 5mL 0 ? 05% (m/v)膽酸鈉溶液、0 ? 2mL 2 ? 2% (m/v)CaCl2溶液，充分混勻后加入 20mg豬胰脂酶，渦旋振蕩lmin后，在40°C的振蕩水浴鍋中反應(yīng)2min，恒溫環(huán)境下劇烈振蕩 2min，分兩次加入10mL無(wú)水乙醚，4000r/min離心5min，合并醚層，氮吹至恒重，正己燒復(fù)溶， 得水解后的脂肪溶液。
[0082] 1.1.3 Sn-2位單甘油酯的制取
[0083]氨基固相萃取柱分離法(SPE法）：取氨基固相萃取柱(500mg，6mL)，分兩次加入4mL 正己烷，活化萃取柱。加入上述水解后的脂肪溶液，棄去流出液;分4次加入共8mL正己烷-乙 酸乙酯淋洗液(v/v = 85:15)，每次2mL棄去淋洗液;分4次共加入8mL二氯甲烷-甲醇洗脫液 (v/v = 2:1)，每次2mL收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，編?hào)為試樣III。
[0084]薄層層析分離法(TLC法）：玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管將上述水解后的脂肪溶液點(diǎn)在距離薄 層板底邊151111]1處，點(diǎn)樣后干燥5111；[11，展開(kāi)劑為正己燒：乙醚：甲酸=70:30:1(>:￥:￥)，層析結(jié) 束后將層析板放入到碘蒸氣中顯色，用微型刮鏟刮下單甘油酯譜帶（R f值約0.038)，加入 10mL乙醚分兩次提取脂肪，離心后取出有機(jī)層，氮?dú)獯蹈桑幪?hào)為試樣IV。
[0085] 1.1.4脂肪酸甲酯化
[0086]將上述試樣III和試樣IV分別按以下方法進(jìn)行甲酯化反應(yīng)：
[0087] 方法一（乙酰氯法）：加入5mL甲苯，6mL乙酰氯-甲醇溶液，80°C水浴振蕩2.5h。冷卻 至室溫，將反應(yīng)液移至50mL離心管中，用6. OmL碳酸鈉溶液分2次清洗頂空瓶，合并清洗于離 心管中，4000r/min離心5min，吸取lmL上次清液于進(jìn)樣瓶，檢測(cè)前于-20°C下保存。
[0088] 方法二（鹽酸-甲醇法）：加入5. OmL 0.5mo 1/L的鹽酸-甲醇溶液，2mL正己烷，2mL甲 醇，在80°C下水浴2h，冷卻后加入2mL去離子水，4000r/min離心5min，取1. OmL上層清液于進(jìn) 樣瓶，檢測(cè)前于_20°C下保存。
[0089] 1.1.5采用GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜)法進(jìn)行檢測(cè);條件如下：
[0090] GC:進(jìn)樣器：Thermo Scientific TriPlus RSH色譜柱：HP-88氣相色譜柱（100mX 0.250mm，0.20wn);進(jìn)樣口溫度：200°C ;恒流速模式：lmL/min;進(jìn)樣量：lyL;分流比：10:1;載 氣:N2 ;柱溫箱升溫程序如下表1:
[0091] 表1柱溫箱升溫程序
[0093] MS:電子轟擊離子源:El; scan模式；離子源溫度:280 °C ;傳輸線溫度：240 °C ;四級(jí) 桿質(zhì)量掃描范圍：35-400amu;溶劑延遲lOmin;
[0094]采用外標(biāo)法(C16:0甲酯)對(duì)脂肪酸定量。
[0095] 1.1.6數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)取平行實(shí)驗(yàn)的平均值，采用SPSS，EXCEL軟件進(jìn)行方差分 析。
[0096] 2 ?結(jié)果討論
[0097] 2.1 Sn-2位單甘油脂分離方法確定
[0098] 以同一次提取的奶粉脂肪為實(shí)驗(yàn)原料，加入棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，對(duì)比研究了氨基 固相萃取柱分離法(SPE法)和薄層層析法(TLC法)對(duì)單甘油酯的分離效果。結(jié)果如表2,經(jīng)過(guò) 氨基固相萃取柱法分離的單甘油酯甲酯化后進(jìn)行GC-MS分析算得回收率為93.7%~ 98.9%，RSD值為1.34%，經(jīng)過(guò)薄層層析法分離的單甘油酯甲酯化后進(jìn)行GC-MS分析得回收 率為82.7 %~89.4 %，RSD值為3.57 %。Sn結(jié)果表明氨基固相萃取柱法不僅操作簡(jiǎn)便，而且 準(zhǔn)確度更高。
[0099] 表2 SPE法和TLC法數(shù)據(jù)對(duì)比
[0100]
[0101] 2.2甲酯化方法確定
[0102]分別采用乙酰氯法、鹽酸-甲醇法對(duì)Sn-2位單甘脂進(jìn)行甲酯化，結(jié)果（見(jiàn)表3)發(fā)現(xiàn) 鹽酸-甲醇法甲酯化率高，反應(yīng)快速，時(shí)間短(一般1到2小時(shí)），對(duì)待檢試樣含水量沒(méi)有要求， 可以直接進(jìn)行甲酯化處理。三次實(shí)驗(yàn)偏差小于乙酰氯法，而且乙酰氯_甲醇溶液配制時(shí)具有 危險(xiǎn)性，反應(yīng)過(guò)程更因?yàn)楹康木壒蕰?huì)發(fā)生試管炸裂，一旦炸裂，既有危險(xiǎn)，又耽誤試驗(yàn) 進(jìn)度。而鹽酸-甲醇溶液相對(duì)安全。
[0103] 表3兩甲酯化方法比較(n = 3)
[0106] Mean表示平均值;RSD表示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0107] 2.3色譜條件選擇
[0108]在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行色譜分析，樣品全部脂肪酸甲酯化(本發(fā)明鹽酸-甲醇 法)后的色譜圖見(jiàn)圖1和圖2(橫坐標(biāo)表示保留時(shí)間(Rt)，縱坐標(biāo)表示離子強(qiáng)度）：圖1為37種 脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖；圖2為Sn-2位棕櫚酸(圖2-a)和總棕櫚酸(圖2-b)的色譜圖。 [0109]可見(jiàn)釆用HP-88氣相色譜柱分析甘油三酯中脂肪酸組分，可以將所有脂肪酸色譜 峰完全分離開(kāi)，分流比為10:1時(shí)，C16:0峰型良好，無(wú)拖尾峰，基線平穩(wěn)，響應(yīng)值高。采用外標(biāo) 法，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)峰面積作圖，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。確定棕櫚酸的保留時(shí)間為29.75min，回歸 方程為y = 3 ? 39 X 106+6 ? 52 X 106X，R2 = 0 ? 9994，線性關(guān)系良好。
[0110] 2.4 GC-MS法回收率與精密度試驗(yàn)
[0111] 以同一次提取的奶粉脂肪為實(shí)驗(yàn)原料，加入3個(gè)不同濃度水平的棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品溶 液，水解后經(jīng)過(guò)氨基固相萃取柱分離Sn-2位單甘油酯，甲酯化后用GC-MS分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做5 個(gè)平行，結(jié)果添加標(biāo)準(zhǔn)品的回收率范圍為91.7%~98.5%，準(zhǔn)確性高。
[0112] 2.5對(duì)比試驗(yàn)
[0113] 將3個(gè)不同品牌嬰兒配方乳粉送到中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心（簡(jiǎn)稱 中國(guó)檢科院)檢測(cè)Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸百分含量，對(duì)比本實(shí)驗(yàn)利用氨基固相萃取柱法 制備單甘油酯，GC-MS法檢測(cè)Sn-2位棕櫚酸相對(duì)含量，結(jié)果如表4，中國(guó)檢科院與氨基固相萃 取柱法分離單甘油酯三種方法檢測(cè)結(jié)果基本一致，方法的重現(xiàn)性良好，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn) 確、可靠。
[0m]表4 Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的百分含量（％ )
[0115]
[0116] 3 結(jié)論
[0117] 本發(fā)明建立了一種直接測(cè)定甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量的方法，通過(guò)改變甲酯化 試劑，用鹽酸-甲醇溶液代替乙酰氯甲醇方法，既縮短了前處理時(shí)間，又?jǐn)U大了被測(cè)樣品的 品種，減少了配制乙酰氯甲醇的危險(xiǎn)性，提高了樣品的甲酯化率，使前處理方法得到了優(yōu) 化。利用GC-MS色譜分析脂肪酸，方法較液相快捷，準(zhǔn)確，前處理簡(jiǎn)單。用氨基固相萃取柱法 取代薄層層析法制備純化單甘油酯，大大縮短樣品的前處理時(shí)間，操作簡(jiǎn)單、回收率高、準(zhǔn) 確度高《GB 541327-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測(cè)定》的甲酯化 方法，液體樣本需求量大，要求凍干后取〇.5g，這對(duì)很多珍貴的樣本是比較難達(dá)到的，本發(fā) 明方法只需要250uL，另外國(guó)標(biāo)方法液體樣本需要凍干，使水分含量低于5%，前處理過(guò)程漫 長(zhǎng)，耗時(shí)長(zhǎng)，易損失，并且凍干操作會(huì)導(dǎo)致樣本脂肪分布不均勻，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0118]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種直接測(cè)定甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量的方法，其特征在于，采用GC-MS法進(jìn)行檢 測(cè)，其中樣品前處理包括利用鹽酸-甲醇溶液對(duì)試樣進(jìn)行甲酯化反應(yīng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述試樣包括待測(cè)樣品、待測(cè)樣品水解后 的脂肪溶液、待測(cè)樣品中分離的Sn-2位單甘油酯。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述鹽酸-甲醇溶液中鹽酸濃度為0.5-3mol/L，優(yōu)選為 0 ? 5mol/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，GC-MS法檢測(cè)條件如下： GC:進(jìn)樣器:Thermo Scientific TriPlus RSH自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱:HP_88氣相色譜柱 (100mX0 ? 250mm，0.20mi);進(jìn)樣口溫度:200°C ;恒流速模式：lmL/min;進(jìn)樣量：lyL;分流比： 10:1;載氣:N2;柱溫箱升溫程序如下：MS:電子轟擊離子源:El; scan模式；離子源溫度：280°C ;傳輸線溫度:240°C ;四級(jí)桿質(zhì) 量掃描范圍：35-400amu;溶劑延遲lOmin。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品包括豆粉、奶粉、牛奶、母乳， 奶油，酸奶。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 從待測(cè)樣品中提取脂肪，用豬胰酯酶水解，將水解后的脂肪溶液過(guò)氨基固相萃取柱 分離得Sn-2位單甘油酯； 2) 用鹽酸_甲醇溶液分別對(duì)所述水解后的脂肪溶液和Sn-2位單甘油酯進(jìn)行甲酯化反 應(yīng)，然后進(jìn)行GC-MS檢測(cè);根據(jù)峰面積獲得Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸百分含量； 3) 將待測(cè)樣品用鹽酸-甲醇溶液進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，按照與步驟2)相同的條件進(jìn)行GC-MS 檢測(cè)，按照外標(biāo)法獲得待測(cè)樣品中總棕櫚酸含量;計(jì)算獲得待測(cè)樣品中Sn-2位棕櫚酸含量。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述從待測(cè)樣品中提取脂肪的方法包括： 取待測(cè)樣品，加入適量氨水調(diào)節(jié)呈堿性，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加乙醇搖勻；分2次加入乙醚， 搖勻；加入石油醚，振蕩；靜置直至上層溶液澄清；重復(fù)以上步驟提取數(shù)次，將醚溶液合并， 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得待測(cè)脂肪。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述用氨基固相萃取柱分離Sn-2位單甘油 酯的方法包括將所述水解后的脂肪溶液加入到用正己烷活化的氨基固相萃取柱中，棄去流 出液;用正己烷-乙酸乙酯淋洗液(v/v = 85:15)淋洗，棄去流出液；用二氯甲烷-甲醇洗脫液 (v/v = 2:1)洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，即得?. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述甲酯化反應(yīng)的方法包括：向待測(cè)試樣 中加入鹽酸-甲醇溶液，加入正己烷和甲醇，振蕩混勻，在80°C下恒溫水浴振蕩，取出試管用 流動(dòng)水冷卻至室溫后，加入去離子水，冷凍離心。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK106053650SQ201610412833
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日
【發(fā)明人】陳歷俊, 張明輝, 喬為倉(cāng), 姜鐵民, 周偉明
【申請(qǐng)人】北京三元食品股份有限公司