一種提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法，包括以下步驟：(1)提取：取肉試料采用乙腈提取兩次，兩次提取的上清液分別用正己烷進(jìn)行分配，然后合并乙腈層，加入正丙醇5 mL，50℃減壓濃縮至體積為300~600μL，得到殘余液；(2)凈化：往殘余液中添加乙腈復(fù)溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得的復(fù)溶液全部過堿性氧化鋁SPE柱，而后用乙腈?水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，過濾得到試樣溶液，供高效液相色譜測定。該方法簡單易操作，而且可以提高高效液相色譜測定磺胺類藥物殘留中的準(zhǔn)確度。
【專利說明】
一種提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及肉中磺胺類藥物殘留測定方法，尤其涉及一種提高肉中磺胺類藥物殘 留測定準(zhǔn)確度的前處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 磺胺類藥物（sulfanilamides, SAs)結(jié)構(gòu)上類似對氨基苯甲酸(PABA)，可與PABA 競爭性作用于細(xì)菌體內(nèi)的二氫葉酸合成酶，從而阻止以PABA為原料合成細(xì)菌所需的四氫葉 酸，進(jìn)而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成達(dá)到抑菌效果。該類藥物抗菌譜廣、抗菌效果明顯、性質(zhì)穩(wěn) 定價格便宜，因而大量用于防治畜禽細(xì)菌性感染疾病。然而，磺胺類藥物在動物體內(nèi)無法代 謝完全，其殘留量可通過食物鏈進(jìn)入人體，進(jìn)而對人體健康構(gòu)成危脅。鑒于此，歐美、日本和 我國對磺胺類藥物的最大殘留限量均作了規(guī)定(殘留總量不得超過l〇〇yg/kg)。由此，畜禽 產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留的檢測也就成了農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全部門常設(shè)的監(jiān)測項目之一?！掇r(nóng)牧 發(fā)[2001]38號文中方法之五:動物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測方法一一高效液相色 譜法》是現(xiàn)行畜禽產(chǎn)品安全監(jiān)測常用的檢測方法，主要用于雞肉中7種磺胺藥物檢測和能力 驗證。不過，2013年和2015年廣東省農(nóng)業(yè)廳農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管處對省內(nèi)承擔(dān)監(jiān)測任務(wù)的 單位進(jìn)行的能力驗證結(jié)果表明，考試使用該方法的合格率均為60%~68%。和其它考核項目相 比，磺胺類的合格率總是偏低，省廳每年都有組織進(jìn)行該項目的培訓(xùn)，但是培訓(xùn)效果仍然不 明顯。上述方法的濃縮凈化具體為： 提取:稱取(5±0.05) g試料，置于50 mL聚丙稀離心管中，加無水硫酸鈉4 g和乙腈25 mL，禍動混合15 s，中速振蕩20 min，2500 r/min離心5min。上清液移至分液漏斗中，加入 30 mL正己烷，振搖2 min后，靜止5 min，分離乙腈層。用25 mL乙腈將沉淀物重復(fù)提取1 次，乙腈層經(jīng)同一份正己烷分配，合并乙腈層于100 mL雞心瓶中，加入正丙醇5 mL，50°C減 壓濃縮至近干。
[0003] 凈化：用3 mL乙腈-水(95 + 5)溶解殘留物過堿性氧化鋁SPE柱，不收集，用乙腈-水(95 + 5) 5 mL洗滌雞心瓶，并過SPE柱，吹去柱內(nèi)滯留的液體。用5 mL乙腈-水（75 + 25)洗脫待測物至10 mL容量瓶中，用0.017 mol/L磷酸定容至10 mL，用0.45 M微孔濾 膜過濾，收集濾液作為試樣溶液，供高效液相色譜測定。
[0004] 經(jīng)過本發(fā)明人反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)，之所以磺胺類的合格率低，主要是樣品前處理的濃 縮凈化環(huán)節(jié)存在缺陷。在該方法中提取后期提取物需濃縮至干，在濃縮過程耗時且易爆沸。 濃縮殘留物與3 mL復(fù)溶液乙腈-水(95 + 5)重新復(fù)溶，由于復(fù)溶液中的水含量較大，所得的 復(fù)溶液中含水量大于5%以上，使藥物的回收率變低，從而影響最終檢測結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法， 該方法簡單易操作，而且可以提高高效液相色譜測定中的準(zhǔn)確率。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):一種提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確 度的前處理方法，包括以下步驟： (1) 提取:取肉試料，采用乙腈提取兩次，兩次提取的上清液分別用正己烷進(jìn)行分配， 然后合并乙腈層，加入正丙醇5 mL，50°C減壓濃縮至體積為300~600 yL，得到殘余液； (2) 凈化:往殘余液中添加乙腈復(fù)溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得的復(fù)溶液全部 過堿性氧化鋁SPE柱，而后用乙腈-水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，過濾得到試樣溶液，供高效液 相色譜測定。
[0007] 本發(fā)明所述步驟（1)具體操作為:稱取5±0.05 g肉試料置于聚丙烯離心管中，加 無水硫酸鈉4 g和乙腈25 mL，禍動混合15 s，中速振蕩20 min，2500 r/min離心5 min，上 清液移至分液漏斗中，加入30 mL正己燒，振搖2 min后，靜止5 min，分離乙腈層，用25 mL 乙腈將沉淀物重復(fù)提取1次，乙腈層經(jīng)同一份正己烷分配，合并乙腈層于100 mL雞心瓶 中，加入正丙醇5 mL，50°C減壓濃縮至體積為300~600 yL，得到殘余液。
[0008] 本發(fā)明所述步驟(2)具體操作為:往殘余液中添加乙腈復(fù)溶，并控制溶液含水量在 5%以下，所得的復(fù)溶液全部過堿性氧化鋁SPE柱，不收集，用乙腈-水洗滌雞心瓶，并過堿性 氧化鋁SPE柱，吹去柱內(nèi)滯留的液體，用5 mL乙腈-水洗脫待測物至10 mL容量瓶中，用 0.017 mol/L磷酸定容至10 mL，用0.45M1微孔濾膜過濾，收集濾液作為試樣溶液，供高效 液相色譜測定。
[0009] 所述步驟(2)中，往殘余液中添加乙腈復(fù)溶后，溶液中含水量在2.5%以下。
[0010] 所述步驟(2)中殘余液與乙腈的比例根據(jù)不同檢測項目有不同的體積比例，優(yōu)選 地，若檢測項目為除了 SDM和SQ的其余5種，即磺胺嘧啶(SD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二 甲嘧啶（SM2)、磺胺甲氧嗪（SMP)和磺胺甲噁唑（SMZ)，所述殘余液(V1):乙腈(V2 )=1: 20，此 時SD、SMP、SMM、SMZ四種的回收率均不低于90 %。若7種磺胺全檢且回收率均在89%以上，則 所述殘余液(VI):復(fù)溶液乙腈(V2)=l:40。上述的VI為殘余液體積，V2為乙腈體積。
[0011] 所述步驟(2)中，洗滌雞心瓶的乙腈-水的乙腈和水的體積比為95:5,用于洗脫的 乙腈-水溶液的乙腈和水的體積比為75: 25。
[0012]本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明在提取步驟的減壓濃縮中沒有濃縮至干，而是保留一定體積的水，在凈化步驟 中只添加乙腈進(jìn)行復(fù)溶，這樣有效地控制復(fù)溶液中水含量，從而提高7種磺胺的回收率，大 大地提高了后續(xù)高效液相色譜法檢測的準(zhǔn)確度。
【附圖說明】
[0013]圖1是不同含水量對7種磺胺SPE柱保留率的影響的條形圖。
【具體實施方式】
[0014] 以下實施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實施 例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0015] 試驗例1 試驗方法： 1)7種磺胺100 yg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液介質(zhì)不同含水量的配制一取5個潔凈離心管(規(guī)格 10 mL)，依次加入七種含磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(見上述提及的7種，濃度均為200 yg/L)、加入 超純水、加入乙腈，混勻，步驟詳見表1。所得的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用作為下一步的上樣液。
[0016] 2)堿性氧化鋁SPE柱對7種磺胺介質(zhì)不同含水量保留的試驗---取5只堿性氧化鋁 柱（規(guī)格:500 mg/6mL)，各處理水平上樣液分別過柱，不收集，吹去柱內(nèi)滯留的液體，用5 mL75%乙腈水洗脫，液體收集在容量瓶中，用流動相(0.017 mol/L磷酸-乙腈(80 + 20))定 容至10 mL，混勻，過膜，供HPLC測定用。
[0017] 3)HPLC 測定： 色譜柱:反相&8柱，250\4.6臟，粒徑5111]1;流速：11]11/1]1；[11;檢測波長:27()111]1;進(jìn)樣量 50 yL。測定方法：以色譜峰面積積分值定量，外標(biāo)法計算濃度和保留率。檢測結(jié)果見圖1。
[0018] 從圖1可以看出：當(dāng)水分含量從2.5%上升到5%時，堿性氧化鋁柱對7種磺胺藥物的 保留情況為:SD、SMP、SMM、SMZ四種的保留率大于95%，SM 2保留率下降到70%、SDM和SQ分別下 降到41%和47%;當(dāng)含水量上升到10%時，7種磺胺藥物的保留率下降到0~31%;當(dāng)含水量為15% 時，除了SD和SMP仍有10%左右的保留外，其余5種全部流失；當(dāng)含水量為20%時，7種磺胺無一 保留。結(jié)論:選用堿性氧化鋁柱進(jìn)行凈化時，樣品溶液中的水含量不能超過5%。
[0019] 試驗例2 雞肉中含有70%左右的水，在用乙腈提取其中的磺胺類藥物殘留時，水分也進(jìn)入到了提 取液中。雞肉中含水量的測定方法為，稱取雞肉樣品5.00克于事先烘干并在干燥器中冷卻 至室溫的鋁盒中，置于103°C烘箱中干燥4小時，取出置干燥器中，冷卻至室溫稱重，結(jié)果如 表2。
[0020] 從表2可以看出：5克雞肉樣品含水3.46~3.66 g之間。若用50 mL乙腈提取雞肉中 磺胺類藥物，則提取液中水分含量均在5%以上，因而需要在提取后期將提取液濃縮至體積 為300~600 yL，以便在凈化步驟中可以將含水量在5%以下。
[0021] 實施例1 (1)提取:稱取5±0.05 g試料置于聚丙稀離心管中，加無水硫酸鈉4 g和乙腈25 mL， 禍動混合15 s，中速振蕩20 min，2500 r/min離心5 min，上清液移至分液漏斗中，加入30 mL正己烷，振搖2 min后，靜止5 min，分離乙腈層，用25 mL乙腈將沉淀物重復(fù)提取1次，乙 腈層經(jīng)同一份正己烷分配，合并乙腈層于100 mL雞心瓶中，加入正丙醇5 mL，50°C減壓濃 縮至體積為300~600 yL，得到殘余液； (2)凈化:往殘余液中添加乙腈復(fù)溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得的復(fù)溶液全部 過堿性氧化鋁SPE柱，不收集，用5 mL乙腈-水(95+5)洗滌雞心瓶，并過堿性氧化鋁SPE柱，吹 去柱內(nèi)滯留的液體，用5 mL乙腈-水（75+25)洗脫待測物至10 mL容量瓶中，用0.017 mol/L磷酸定容至10 mL，用0.45 ym微孔濾膜過濾，收集濾液作為試樣溶液，供高效液相色 譜測定。
[0022] 檢測項目為除了 SDM和SQ的其余5種，即磺胺嘧啶（SD)、磺胺間甲氧嘧啶（SMM)、磺 胺二甲嘧啶（SM2)、磺胺甲氧嗪（SMP)和磺胺甲噁唑（SMZ)，殘余液(VI):乙腈(V2)=l:20。上 述的VI為殘余液體積，V2為乙腈體積。
[0023] HPLC測定:采用《農(nóng)牧發(fā)[2001]38號文中方法之五:動物源食品中磺胺類藥物殘 留的檢測方法一一高效液相色譜法》中記載的方法進(jìn)行測定。具體地，色譜條件：色譜 柱C18柱，250X4.6 mm，粒徑5wn;流速一1 mL/min;檢測波長一270 nm;進(jìn)樣量50 yL。 測定方法：以色譜峰面積積分值定量，外標(biāo)法計算濃度和保留率。
[0024] 實施例2 (1) 提取:稱取5±0.05g試料置于聚丙稀離心管中，加無水硫酸鈉4g和乙腈25mL，禍 動混合15s，中速振蕩20min，2500r/min離心5min，上清液移至分液漏斗中，加入30mL正己 烷，振搖2min后，靜止5min，分離乙腈層，用25mL乙腈將沉淀物重復(fù)提取1次，乙腈層經(jīng)同 一份正己烷分配，合并乙腈層于100mL雞心瓶中，加入正丙醇5mL，50°C減壓濃縮至體積為 300~600此，得到殘余液； (2) 凈化:往殘余液中添加乙腈復(fù)溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得的復(fù)溶液全部 過堿性氧化鋁SPE柱，不收集，用5mL乙腈-水(95+5)洗滌雞心瓶，并過堿性氧化鋁SPE柱，吹 去柱內(nèi)滯留的液體，用5mL乙腈-水（75+25)洗脫待測物至10mL容量瓶中，用0.017mol/L 磷酸定容至10mL，用0.45 wii微孔濾膜過濾，收集濾液作為試樣溶液，供高效液相色譜測 定。
[0025] 檢測項目為7種磺胺，即磺胺嘧啶(SD)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺地索辛(SDM)、 磺胺二甲嘧啶（SM2)、磺胺甲氧嗪（SMP)、磺胺甲噁唑（SMZ)、磺胺喹噁啉（SQ)，若7種磺胺全 檢，則所述殘余液(VI):復(fù)溶液乙腈(V2)=l: 40。上述的VI為殘余液體積，V2為乙腈體積。上 述的VI為殘余液體積，V2為乙腈體積。
[0026] HPLC測定:采用《農(nóng)牧發(fā)[2001]38號文中方法之五:動物源食品中磺胺類藥物殘 留的檢測方法一一高效液相色譜法》中記載的方法進(jìn)行測定。具體地，色譜條件:色譜柱一 C18柱，250 X4.6mm，粒徑5wii;流速 lmL/min;檢測波長 270nm;進(jìn)樣量50yL。測定方法： 以色譜峰面積積分值定量，外標(biāo)法計算濃度和保留率。
【主權(quán)項】
1. 一種提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法，其特征是，包括以下步驟： (1) 提取:取肉試料采用乙腈提取兩次，兩次提取的上清液分別用正己烷進(jìn)行分配，然 后合并乙腈層，加入正丙醇5mL，50°C減壓濃縮至體積為300~600yL，得到殘余液； (2) 凈化:往殘余液中添加乙腈復(fù)溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得的復(fù)溶液全部 過堿性氧化鋁SPE柱，而后用乙腈-水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，過濾得到試樣溶液，供高效液 相色譜測定。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法，其特征是， 所述步驟（1)具體操作為:稱取5 ± 0.05g肉試料置于聚丙烯離心管中，加無水硫酸鈉 4g和 乙腈25mL，禍動混合15s，中速振蕩20min，2500r/min離心5min，上清液移至分液漏斗中，加 入30mL正己烷，振搖2min后，靜止5min，分離乙腈層，用25mL乙腈將沉淀物重復(fù)提取1次， 乙腈層經(jīng)同一份正己烷分配，合并乙腈層于IOOmL雞心瓶中，加入正丙醇5mL，50°C減壓濃 縮至體積為300~600yL，得到殘余液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法，其特征 是，所述步驟(2)具體操作為:往殘余液中添加乙腈復(fù)溶，并控制溶液含水量在5%以下，所得 的復(fù)溶液全部過堿性氧化鋁SPE柱，不收集，用乙腈-水洗滌雞心瓶，并過堿性氧化鋁SPE柱， 吹去柱內(nèi)滯留的液體，用5mL乙腈-水洗脫待測物至IOmL容量瓶中，用0.017mol/L磷酸 定容至IOmL，用0.45μηι微孔濾膜過濾，收集濾液作為試樣溶液，供高效液相色譜測定。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法，其特征是， 所述步驟(2)中，往殘余液中添加乙腈復(fù)溶后，溶液中含水量在2.5%以下。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法，其特征是， 所述步驟(2)中，檢測磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嗪和磺胺甲噁唑 時，所述殘余液Vl:乙腈V2)=l: 20，上述的Vl為殘余液體積，V2為乙腈體積。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法，其特征是， 所述步驟(2)中，洗滌雞心瓶的乙腈-水的乙腈和水的體積比為95:5,用于洗脫的乙腈-水 溶液的乙腈和水的體積比為75: 25。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法，其特征是， 所述步驟(2)中，檢測磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嗪、 磺胺甲噁唑和磺胺喹噁啉時，所述殘余液Vl:復(fù)溶液乙腈V2=l: 40，上述的Vl為殘余液體積， V2為乙腈體積。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述提高肉中磺胺類藥物殘留測定準(zhǔn)確度的前處理方法，其特征是， 所述步驟(2)中，洗滌雞心瓶的乙腈-水的乙腈和水的體積比為95:5,用于洗脫的乙腈-水 溶液的乙腈和水的體積比為75: 25。
【文檔編號】G01N30/02GK105891389SQ201610215220
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】殷秋妙, 吳維煇, 王威利, 林雪賢, 張展, 續(xù)倩, 李亞菲
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測中心