本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，涉及一種呼吸道感染性病原體檢測試劑盒及使用方法和應用。

背景技術：

1、呼吸道感染性疾病具有高度傳染性且傳播迅速，對發(fā)病率和死亡率有顯著影響。呼吸道感染病原學復雜，包括細菌、病毒、支原體、衣原體、真菌等；病毒可通過飛沫、霧滴，或經污染的用具進行傳播，可導致不分四季、任何年齡條件下的發(fā)病。其臨床表現(xiàn)多樣，主要為鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃體炎等癥狀，嚴重程度從自限性上呼吸道感染到嚴重甚至危及生命的下呼吸道感染，如氣管炎、支氣管炎及肺炎等。臨床上常見的可導致呼吸道感染的病毒包括：甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠狀病毒、流感嗜血桿菌、人副流感病毒通用型、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、腸道病毒、肺炎支原體、a組鏈球菌、百日咳鮑特菌、普通冠狀病毒、鼻病毒、博卡病毒、腺病毒、肺炎鏈球菌等。因上述病毒傳染性極強，傳播速度快，潛伏期短，且臨床癥狀相似，臨床醫(yī)師無法進行準確的區(qū)分，給臨床診斷和治療造成極大困難。所以，明確感染病原體種類對于控制傳播途徑、對人群采取預防措施、對臨床選用針對性藥物、避免濫用抗生素都極為重要。

2、目前，臨床上常見的呼吸道病原體檢測方法存在以下問題：(1)病毒分離培養(yǎng)方法操作繁瑣，檢測時間長，且陽性率較低；(2)標本直接涂片、革蘭氏染色、鏡檢等方法的敏感性和特異性較低；(3)病原體培養(yǎng)法檢測時間較長，易產生假陽性；(4)血清學鑒定法易產生假陽性和假陰性；(5)分子生物學方法所使用的聚合酶鏈式反應(pcr)檢測費用昂貴。因此，本領域技術人員渴望研發(fā)一種檢測時間短、靈敏度較高、特異性較高，以及檢測成本較低的呼吸道感染性病原體檢測方法，用于臨床上對呼吸道感染性病原體的檢測。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術中呼吸道感染性病原體檢測方法存在檢測時間長、靈敏度和特異性較低、檢測成本較高的技術問題，提供了一種基于熒光成像的呼吸道感染性病原體檢測試劑盒及使用方法和應用。

2、本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于熒光成像的呼吸道感染性病原體檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括：生理鹽水、1×pbs緩沖液、成像緩沖液體、凝集素和熒光探針標記的呼吸道感染性病原體的單克隆抗體。

3、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述成像緩沖液體的組成為：5mg/ml葡萄糖氧化酶、40μg/ml過氧化氫酶和140mmβ-巰基乙醇。

4、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述凝集素為rhodamine-wga。

5、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述熒光探針為alexa?fluor熒光探針，所述alexa?fluor熒光探針的激發(fā)波長為alexa?fluor?405、488、561或647中的一種或幾種。

6、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述呼吸道感染性病原體的單克隆抗體為抗肺炎鏈球菌表面抗原抗體、抗金黃色葡萄球菌抗原spa抗體、抗肺炎支原體抗原p30抗體、腺病毒adv抗體或呼吸道合胞病毒rsv抗體中的一種或幾種。

7、本發(fā)明的目的之二在于提供上述檢測試劑盒非診斷目的的使用方法，所述使用方法包括以下步驟：

8、s1：采集待測呼吸道痰液樣本，使用無菌生理鹽水對痰液樣本進行洗滌，將洗滌后黃色顆?；虿煌该髦唿c狀的痰液樣本涂至載玻片上，并在電吹風冷風下風干，獲得原始痰液涂片；

9、s2：向s1中獲得的原始痰液涂片上滴加試劑盒檢測體系中使用1×pbs緩沖液稀釋后的凝集素和熒光探針標記的呼吸道感染性病原體的單克隆抗體進行孵育，使用1×pbs緩沖液洗去未結合的抗體，再滴加成像緩沖液體，蓋上蓋玻片，使用指甲油進行封閉，獲得待測痰液涂片；

10、s3：將s2中獲得的待測痰液涂片放置在熒光顯微鏡下進行成像觀察。

11、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，s1中所述的痰液樣本洗滌步驟為：在痰液樣本中加入5倍體積的無菌生理鹽水，劇烈震蕩10s后，將沉淀于管底的膿痰取出，至于新試管中，再次進行洗滌，共洗滌3次；所述載玻片是使用aptes試劑預先進行硅烷化試劑修飾處理的。

12、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，s2中所述凝集素與1×pbs緩沖液按照1：500進行稀釋，所述呼吸道感染性病原體的單克隆抗體與1×pbs緩沖液按照1：100進行稀釋；所述成像緩沖液體的添加量為50μl。

13、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，s3中所述熒光顯微鏡為轉盤式共聚焦顯微鏡、高分辨熒光顯微鏡或超分辨熒光顯微鏡中的一種或幾種。

14、本發(fā)明的目的之三在于提供上述檢測試劑盒在呼吸道感染性病原體檢測中的應用。

15、本發(fā)明的有益效果：

16、本發(fā)明提供了一種基于熒光成像的呼吸道感染性病原體檢測試劑盒及使用方法和應用，所述檢測試劑盒包括：生理鹽水、1×pbs緩沖液、成像緩沖液體、凝集素和熒光探針標記的呼吸道感染性病原體的單克隆抗體。本發(fā)明通過用于識別革蘭氏陽性菌的羅丹明標記的凝集素rhodamine-wga與熒光探針標記的呼吸道感染性病原體的單克隆抗體，明確呼吸道感染性病原體與革蘭氏陽性菌數量的占比，從而判斷呼吸道感染性病原體的感染程度。

17、本發(fā)明提供的呼吸道感染性病原體檢測方法，與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)勢：

18、(1)檢測時間較短：整個檢測過程可在30min內完成；

19、(2)靈敏度高、成本低：可檢測到微量的病原體，通過將不同呼吸道感染性病原體單克隆抗體偶聯(lián)不同激發(fā)波長的熒光染料，可同時在單樣本中實現(xiàn)多種病原體的檢測，節(jié)省了資源和時間成本；

20、(3)特異性高：通過特異性抗體對特定病原體進行特異性識別，可對病原體種類進行精準鑒定；

21、(4)成像分辨率高：所使用的轉盤式式共聚焦顯微鏡能夠分辨100nm大小的病原體，同時結合超分辨/高分辨顯微鏡可分辨100nm以下的病原體，從而最大程度提高熒光成像的分辨率。

技術特征：

1.一種基于熒光成像的呼吸道感染性病原體檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括：生理鹽水、1×pbs緩沖液、成像緩沖液體、凝集素和熒光探針標記的呼吸道感染性病原體的單克隆抗體。

2.根據權利要求1所述檢測試劑盒，其特征在于，所述成像緩沖液體的組成為：5mg/ml葡萄糖氧化酶、40μg/ml過氧化氫酶和140mmβ-巰基乙醇。

3.根據權利要求1所述檢測試劑盒，其特征在于，所述凝集素為rhodamine-wga。

4.根據權利要求1所述檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光探針為alexa?fluor熒光探針，所述alexa?fluor熒光探針的激發(fā)波長為alexa?fluor?405、488、561或647中的一種或幾種。

5.根據權利要求1所述檢測試劑盒，其特征在于，所述呼吸道感染性病原體的單克隆抗體為抗肺炎鏈球菌表面抗原抗體、抗金黃色葡萄球菌抗原spa抗體、抗肺炎支原體抗原p30抗體、腺病毒adv抗體或呼吸道合胞病毒rsv抗體中的一種或幾種。

6.權利要求1至5任一項所述檢測試劑盒非診斷目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步驟：

7.根據權利要求6所述的使用方法，其特征在于，s1中所述的痰液樣本洗滌步驟為：在痰液樣本中加入5倍體積的無菌生理鹽水，劇烈震蕩10s后，將沉淀于管底的膿痰取出，至于新試管中，再次進行洗滌，共洗滌3次；所述載玻片是使用aptes試劑預先進行硅烷化試劑修飾處理的。

8.根據權利要求6所述的使用方法，其特征在于，s2中所述凝集素與1×pbs緩沖液按照1：500進行稀釋，所述呼吸道感染性病原體的單克隆抗體與1×pbs緩沖液按照1：100進行稀釋；所述成像緩沖液體的添加量為50μl。

9.根據權利要求6所述的使用方法，其特征在于，s3中所述熒光顯微鏡為轉盤式共聚焦顯微鏡、高分辨熒光顯微鏡或超分辨熒光顯微鏡中的一種或幾種。

10.權利要求1至5任一項所述檢測試劑盒在呼吸道感染性病原體檢測中的應用。

技術總結
一種基于熒光成像的呼吸道感染性病原體檢測試劑盒及使用方法和應用，屬于生物醫(yī)藥技術領域。本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術中呼吸道感染性病原體檢測方法存在檢測時間長、靈敏度和特異性較低、檢測成本較高的技術問題，提供了一種基于熒光成像的呼吸道感染性病原體檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括：生理鹽水、1×PBS緩沖液、成像緩沖液體、凝集素和熒光探針標記的呼吸道感染性病原體的單克隆抗體。本發(fā)明所提供的檢測試劑盒靈敏度和特異性較高，成像分辨率較高，檢測時間較短，檢測成本較低。本發(fā)明所提供的檢測試劑盒可應用于熒光成像檢測呼吸道感染性病原體。

技術研發(fā)人員：王宏達,徐海嬌,張金瑞,車廣華
受保護的技術使用者：中國科學院長春應用化學研究所
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2