本發(fā)明涉及醫(yī)藥檢測，具體涉及一種測定人血漿中羅沙司他的方法。

背景技術(shù)：

1、羅沙司他(roxadustat)膠囊是全球首個開發(fā)的小分子低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶抑制劑(hif-phi)類治療腎性貧血的藥物。低氧誘導(dǎo)因子(hif)的生理作用不僅使紅細胞生成素表達增加，也能使紅細胞生成素受體以及促進鐵吸收和循環(huán)的蛋白表達增加。羅沙司他體外可抑制脯氨酰羥化酶phd1、phd2、phd3，在hep3b細胞系衍生株1g6細胞中可導(dǎo)致低氧誘導(dǎo)因子-α(hif-α)的快速且可逆的活化，可誘導(dǎo)hep3b細胞促紅細胞生成素(epo)水平升高。羅沙司他通過模擬脯氨酰羥化酶(ph)的底物之一酮戊二酸來抑制ph酶，影響ph酶在維持hif生成和降解速率平衡方面的作用，從而達到糾正貧血的目的。羅沙司他膠囊的上市為因慢性腎臟病引起的貧血患者提供了新的治療手段。2018年12月，國家藥品監(jiān)督管理局通過優(yōu)先審評審批程序批準羅沙司他膠囊上市。

2、目前羅沙司他治療藥物檢測的常見方法有高效液相色譜法，這個方法存在前處理復(fù)雜、定性定量不夠準確、成本高、分析時間長、或?qū)嶒炄藛T技術(shù)要求高等問題。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)越來越廣泛應(yīng)用于藥物、食品、環(huán)境、法醫(yī)、臨床等各個領(lǐng)域。lc-ms/ms具有靈敏度高，選擇性強，準確性好等特點，在臨床檢測上適用范圍遠遠超過放射性免疫檢測和化學(xué)檢測范圍，是其他方法無可比擬的。選擇lc-ms/ms方法同時測定血漿中羅沙司他的濃度以及血藥濃度與時間的函數(shù)關(guān)系，合并計算藥代動力學(xué)及生物利用度，更有實際意義。文中建立的方法能同時測定血漿中的羅沙司他，可用于羅沙司他制劑的藥動學(xué)及生物等效性研究。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能定量檢測血漿中羅沙司他的方法。該檢測方法前處理簡單、質(zhì)譜采集時間短、成本低廉、方便實驗室進行大規(guī)模臨床樣本檢測。

2、本發(fā)明所述的一種采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)技術(shù)能分別定量檢測血漿中羅沙司他的方法，包括以下步驟：

3、(1)血漿樣品預(yù)處理

4、在黃光室溫條件下，將待測樣品50.0μl移取至2ml離心管中，再加10μl氘代混合內(nèi)標工作溶液，加入340μl的乙腈溶液，將樣品渦旋5分鐘后，在10000rpm、4℃條件下離心5分鐘，用移液槍移取上清液100μl至96孔板中；加入500μl的乙腈：水(1:1)，渦旋3分鐘，在4000rpm、4℃條件下離心5分鐘，得到待測樣品；

5、(2)標準曲線和質(zhì)控血漿樣品的配制

6、使用乙腈：水(1:1)溶液配制標曲和質(zhì)控工作溶液，所述工作溶液包括羅沙司他工作溶液，取上述工作溶液10μl與490μl空白血漿基質(zhì)混合配制成不同濃度的標準曲線樣品和質(zhì)控樣品，用羅沙司他和內(nèi)標的峰面積比和標準樣品的濃度來建立標準曲線，得到相應(yīng)的線性回歸方程。

7、(3)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測

8、①液相色譜條件：色譜柱：ace?excel?5c18(50*2.1mm)；

9、流動相：水相：0.1％甲酸水，有機相：0.1％甲酸乙腈，洗針液：甲醇:水(1:9)；

10、柱溫：35℃；自動進樣器溫度：4℃；

11、采用水相和有機相為混合流動相進行梯度洗脫，每個樣品采集時間為3min，進樣體積為2ml，流速為0.4ml/min，流動相梯度洗脫參數(shù)如下：0min，48％有機相；1.8min，95％有機相；2.3min，95％有機相；2.31min，48％有機相；3min，停止。

12、②質(zhì)譜條件：在電噴霧電離檢測模式下，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描模式，其中羅沙司他采用正離子模式，離子化電壓為3500v，鞘氣(sheath?gas)為60arb，輔助氣(auxgas)為15arb，尾吹氣(sweep?gas)為2arb，離子傳輸管溫度(ion?transfer?tube?temp)為380℃，蒸發(fā)器溫度(vaporizer?temp)為350℃，循環(huán)時間(cycle?time)為0.8sec，離子對分別為：m/z?353.2→278.17(羅沙司他)，m/z?358.18→283.13(羅沙司他-d5)。

13、(4)待測血漿中各物質(zhì)的濃度測定

14、將待測血漿按步驟(1)樣品制備的方法制備，取待測樣品按步驟(3)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測的方法檢測，將測得的羅沙司他和各自內(nèi)標的峰面積比值代入所建的標準曲線中，計算得到待測血漿中羅沙司他的濃度。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下述有益技術(shù)效果：

16、本發(fā)明選用甲酸乙腈作為有機相，0.1％甲酸水作為水相，而非采用添加緩沖鹽的水溶液作為流動相，可以避免緩沖鹽對于色譜柱的損害以及對于化合物響應(yīng)的影響。

17、使用緩沖鹽，容易造成緩沖鹽在色譜柱中析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙。緩沖鹽通常易溶于水，難溶于有機溶劑。用含緩沖鹽的(特別是做流動相的水為飽和的緩沖鹽溶液時)流動相進行分析時，如果分析前色譜柱中用于保存色譜柱的流動相中含水的比例相對較小，不先沖洗掉，接下來做樣品的時候所用的流動相中如果有機溶劑含量大，而其比例中所含的水又不足以溶解該緩沖鹽時，緩沖鹽將會在色譜柱柱體上析出，沉積下來。在使用緩沖鹽作流動相之前需要用不含緩沖鹽的流動相沖洗色譜柱，直至基線平穩(wěn)。如果流動相里有高濃度的緩沖鹽，由于鹽由陰陽離子構(gòu)成，在esi中得失電荷的能力往往強于待測物，所以會優(yōu)先得/失電荷，于是跟待測物形成了競爭，降低了待測物的離子化效率，造成離子抑制，降低待測物的響應(yīng)。由于羅沙司他對于酸敏感，考慮使用更簡單的流動相，故在乙腈中添加甲酸，相較于用純乙腈作為有機相，能夠改善化合物拖尾情況，同時其響應(yīng)更高。還可避免緩沖鹽對于色譜柱的損害以及對于化合物響應(yīng)的影響。

18、本發(fā)明羅沙司他血漿樣品的預(yù)處理方法采用沉淀蛋白法，操作簡便、靈敏度高，單個樣品分析時間短，大大降低了耗材成本，縮短了操作時間，降低了分析成本。采用穩(wěn)定的同位素內(nèi)標定量結(jié)果準確，質(zhì)譜采集時間短(3min)，所有驗證項均滿足法規(guī)要求，能準確定量羅沙司他，最大限度上簡化和方便實驗室操作，滿足臨床的需求。我們評價了甲醇和乙腈對基質(zhì)效應(yīng)和回收率的影響，結(jié)果顯示，乙腈作為沉淀劑，無論在提取回收率還是基質(zhì)效應(yīng)方面都比甲醇有優(yōu)勢，所以最終選擇了乙腈作為作為最終的沉淀劑。在本發(fā)明條件下羅沙司他均可準確定量，可用于臨床藥代動力學(xué)研究，為相應(yīng)的藥物濃度監(jiān)測提供了一種穩(wěn)定、可靠、簡便的檢測方法。

技術(shù)特征：

1.一種測定人血漿中羅沙司他的方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相串聯(lián)質(zhì)譜的液相色譜條件為：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相串聯(lián)質(zhì)譜的質(zhì)譜條件為：在電噴霧電離檢測模式下，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描模式，其中羅沙司他采用正離子模式，離子化電壓：3500v，鞘氣：60arb，輔助氣：15arb，尾吹氣：2arb，離子傳輸管溫度：380℃，蒸發(fā)器溫度：350℃，循環(huán)時間：0.8sec，離子對分別為：m/z?353.2→278.17(羅沙司他)，m/z358.18→283.13(羅沙司他-d5)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述血漿樣品預(yù)處理具體步驟為：移取50.0μl血漿樣品，加入10μl氘代混合內(nèi)標工作溶液，加入340μl的乙腈，將樣品渦旋5分鐘后，在10000rpm、4℃條件下離心5分鐘，用移液槍移取上清液100μl；加入500μl的乙腈：水(1:1)溶液復(fù)溶，渦旋3分鐘，在4000rpm、4℃條件下離心5分鐘，得到待測樣品。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述內(nèi)標工作液配置過程如下：使用二甲基亞砜(dmso)溶解羅沙司他-d5對照品，配制成濃度為2.00mg/ml的內(nèi)標儲備液is-a，取內(nèi)標儲備液is-a添加到乙腈：水(1:1)溶液中，混合均勻配制成20.0μg/ml的內(nèi)標儲備溶液is-b，取內(nèi)標儲備溶液is-b添加到乙腈：水(1:1)溶液中，混合均勻配制成500ng/ml的內(nèi)標工作溶液is-c。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述標準曲線的制備過程如下：使用二甲基亞砜(dmso)溶解羅沙司他，使用乙腈：水(1：1)溶液為溶劑，配制多個濃度的標準曲線工作液和質(zhì)控工作液，將多個濃度的標準曲線工作液和質(zhì)控工作液分別加入空白血漿基質(zhì)混合，制成多個濃度的標準曲線血漿樣品和質(zhì)控血漿樣品，用羅沙司他和內(nèi)標的峰面積比和標準樣品的濃度來建立標準曲線，得到相應(yīng)的線性回歸方程。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于LC?MS/MS技術(shù)檢測人血漿中羅沙司他濃度的方法，該發(fā)明操作簡便，前處理簡單，質(zhì)譜采集時間短(3min)，各項驗證指標均滿足法規(guī)要求，能準確定量羅沙司他，最大限度上簡化和方便實驗室操作，滿足臨床的需求。

技術(shù)研發(fā)人員：趙金蓮
受保護的技術(shù)使用者：南京西默思博檢測技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6