一種快速定量檢測kim-1的免疫熒光試紙條的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種快速定量檢測KIM-1的免疫熒光試紙條，它包括試紙條支撐片以及試紙條支撐片上順次搭接粘貼的樣品墊片、檢測膜和吸水墊片，樣品墊片和檢測膜之間設有偶合物墊片，偶合物墊片一端上方設有第一層玻璃纖維墊片，其一端下方設有第二層玻璃纖維墊片或者偶合物墊片一端上方僅設有第一層玻璃纖維墊片或者不設有任一墊片，檢測膜上設有檢測線，檢測線包被有腎損傷分子-1(KIM-1)抗體，檢測線另一邊設有控制線，控制線包被有抗鏈霉親和素（SAV）抗體，所述偶合物墊片上涂布有熒光標記的腎損傷分子-1單克隆抗體或多克隆抗體偶合物。該試紙具有方便快捷、操作簡單、結果準確等優(yōu)點，適于臨床快速診斷。
【專利說明】 —種快速定量檢測KIM-1的免疫熒光試紙條

【技術領域】
[0001]本實用新型屬于臨床醫(yī)學診斷領域，具體涉及一種用于定量檢測KIM-1的免疫熒光試紙條。

【背景技術】
[0002]腎損傷分子-1 (KM-1)是由334個氨基酸殘基組成的I型跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白基因超家族。在正常的腎組織中幾乎不表達，但是在缺血及腎損傷后的人近曲小管上皮細胞中卻呈高表達狀態(tài)。KM-1參與腎臟疾病的損傷及修復過程，在近端小管上皮細胞黏附、生長及分化中起重要作用。腎損傷發(fā)生后組織KM-1胞外功能區(qū)被金屬蛋白酶介導裂解并釋放入尿，并且尿IQM-1水平和組織KM-1水平呈正相關。在診斷藥源性腎小管壞死、退化和/或膨脹，及組織細微變化或腎功能嚴重紊亂引起的嗜酸性粒細胞增多方面，KIM-1的檢測是高度靈敏、特異和精確的。
[0003]KIM-1是一種伴有細胞外免疫球蛋白和高度O糖基化mucin子域的跨膜蛋白成份。KIM-1分子的細胞外ectodomain (金屬蛋白酶水解脫下來的，可以分泌到尿液中)是AKI(急性腎衰竭)的一個定量標志物。在腎小管間質損害區(qū)域內(伴有炎癥細胞浸潤與纖維化)高表達KM-1。在急性蛋白尿，小管上皮細胞表達KM-1增強。反過來，由于它可與其它蛋白質進行反應，它可能會主動性調節(jié)與損傷或修復相關的細胞事件或過程。尿中KIM-1的外功能域是人類AKI的特異性、敏感性、有前途的標志物，不受尿液理化物性的影響。腎小管受損后第I天MM-1升高至少5倍以上，而血清肌酐與尿素氮晚到受損后第3天才升高。心臟手術后幾個小時就會檢測到KM-1在尿液中大幅增長現象。尿KM-1排泄水平升高對于檢測腎臟缺血相當有特異性，而且?guī)缀酹毩⒂诼阅I病的類型或尿道感染。對于AKI患者而目，聞水平KIM-1預不患者的預后較差。
[0004]有研究數據顯示ICU危重病患者80%的ARF (急性腎臟衰竭)由急性腎小管損傷所致，而非腎小球或間質性病變。KIM-1是腎小管損傷最敏感的標志物。多個動物實驗和臨床實驗證明KM-1與多種因素所致腎小管損傷有關:
[0005]1.、缺血腎小管損傷；
[0006]2、中毒性腎小管損傷；3.蛋白負荷過重腎小管損傷。KM-1作為AKI診斷標志物具有以下的優(yōu)勢:1.敏感性高。其在正常組織不表達，AKI發(fā)生時，其在近端小管上皮細胞的表達才顯著上調，并一直持續(xù)到細胞完全康復；2.特異性很高，特別是對缺血性或腎毒性AKI特異性更高，在其他器官很少表達；3.其胞外部分脫落進入尿液后性質比較穩(wěn)定，容易檢測；4.極少受到慢性腎臟疾病和尿路感染的影響。
[0007]目前，檢測腎損傷分子-1(KIM-1)的方法目前主要是酶聯免疫技術(ELISA)，ELISA技術存在以下缺點:檢測設備要求高，成本高；干擾因素較多，重復性不好；檢測時間長。因此酶聯免疫技術檢測腎損傷分子-1 (KIM-1)不適合臨床快速診斷。因此如何能夠制作出快速的定量檢測試紙成為需要迫切解決的問題。


【發(fā)明內容】

[0008]本實用新型要解決的技術問題是提供一種能快速定量檢測KIM-1的免疫熒光試紙條。
[0009]為了解決上述技術問題，本實用新型提供了一種快速定量檢測KM-1的免疫熒光試紙條，它包括試紙條支撐片以及試紙條支撐片上從左到右順次搭接粘貼的樣品墊片、檢測膜和吸水墊片，所述樣品墊片和檢測膜之間設有偶合物墊片，偶合物墊片一端上方設有第一層玻璃纖維墊片，其另一端下方設有第二層玻璃纖維墊片或者偶合物墊片一端上方僅設有第一層玻璃纖維墊片或者不設有任一墊片，所述檢測膜上設有檢測線，所述檢測線包被有腎損傷分子-1 (KIM-1)抗體，所述檢測線另一邊設有控制線，控制線包被有抗鏈霉親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片上涂布有熒光標記的腎損傷分子-1單克隆抗體或多克隆抗體偶合物。
[0010]所述控制線與檢測線平行設置于檢測膜上，并與偶合物墊片部分重疊或不重疊。[0011 ] 采用如上技術方案后，其有益效果為:
[0012]本實用新型所述的快速定量檢測腎損傷分子-1 (KIM-1)的免疫熒光試紙的工作原理是:采用免疫側流反應原理，通過雙抗體夾心法制備而成。檢驗時樣本中的KM-1抗原首先與偶合墊上的KM-1抗體偶合物發(fā)生免疫反應，形成免疫復合物。其后免疫復合物隨著樣本在檢測膜上層析流動，當免疫復合物層析至檢測膜上的檢測區(qū)(KM-1檢測線)時，與預先包被在檢測膜上的抗KM-1抗體發(fā)生反應從而被固定在檢測膜的檢測線上。樣本中的KIM-1越多，檢測線上的復合物越多，條帶上的光密度值就越高。同時，在檢測過程中，未與KIM-1抗原結合的熒光標記的KM-1抗體偶合物，當層析至檢測膜的控制線時，免疫熒光偶合物會與預先包被在檢測膜上的抗SAV抗體發(fā)生反應從而被固定在對照區(qū)(控制線)上。
[0013]當反應結束后，利用免疫熒光檢測儀將控制線和檢測線的光密度進行分析，并將所分析得到的結果進行運算，從而得到相對光密度值(RI)。然后檢測儀根據已預先設置在檢測儀內的標準曲線對KIM-1的濃度進行計算并顯示結果，以ng/mL為單位表示。
[0014]綜上所述，本實用新型所述快速定量檢測KM-1的免疫熒光試紙條，該試紙具有方便快捷、操作簡單、結果準確等優(yōu)點，適于臨床快速診斷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本實用新型所述快速定量檢測KM-1的免疫熒光試紙條的結構示意圖。
[0016]其中:1_樣品墊片、2-檢測膜、3-吸水墊片、4-支撐片、5偶合物墊片、6-1第一層玻璃纖維墊片、6-2第二層玻璃纖維墊片、7-檢測線、8-控制線。

【具體實施方式】
[0017]下面結合附圖和【具體實施方式】對本實用新型進行詳細說明，不能理解為是對本實用新型的限制；
[0018]實施例1:
[0019]制備快速定量檢測KIM-1的免疫熒光試紙條
[0020]如圖1所示的免疫熒光試紙條結構，一種快速定量檢測IQM-1的免疫熒光試紙條，它包括試紙條支撐片4以及試紙條支撐片上從左到右順次搭接粘貼的樣品墊片1、檢測膜2和吸水墊片3，所述樣品墊片I和檢測膜2之間設有偶合物墊片5，偶合物墊片5 —端上方設有第一層玻璃纖維墊片6-1，其另一端下方設有第二層玻璃纖維墊片6-2，所述檢測膜2上設有檢測線7，所述檢測線7包被有腎損傷分子-1 (KIM-1)抗體，所述檢測線7另一邊設有控制線8，控制線8包被有抗鏈霉親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片5上涂布有熒光標記的腎損傷分子-1單克隆抗體或多克隆抗體偶合物。
[0021]所述控制線8與檢測線7平行設置于檢測膜2上，與偶合物墊片5不重疊。
[0022]其中，檢測膜2在熒光試紙中用于固定包被抗體，同時也是免疫反應的發(fā)生處；檢測線7是將腎損傷分子-1 (KIM-1)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋后，劃線于所述檢測膜2上，干燥及烘烤后，即得；控制線8是將抗鏈霉親和素(SAV)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋，劃線于所述檢測膜2上，干燥及烘烤后，即得。
[0023]其中，所述偶合物墊片5的原材料為玻璃纖維濾膜，將用于制備偶合物墊片的玻璃纖維濾膜放入預封閉緩沖液中浸泡后取出，干燥后，用包膜儀器將熒光標記的腎損傷分子-1單克隆抗體或多克隆抗體偶合物涂布在偶合物墊片5上，干燥即得。
[0024]另外，所述樣品墊片I可對液態(tài)樣品起到初步過濾作用。將樣本墊片I用封閉液浸泡后，干燥即得。
[0025]將上述各組成部件按圖1所示結構粘貼在支撐墊片4上，獲得快速定量檢測KM-1的免疫熒光試紙條。
[0026]按以下步驟進行檢測:1)收集的病人尿液樣品，如低溫保存樣品需恢復至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片I上，反應。3)判讀，將所述免疫熒光試紙置于免疫熒光檢測儀中判定結果。
[0027]實施例2:
[0028]一種快速定量檢測KM-1的免疫熒光試紙條，它包括試紙條支撐片4以及試紙條支撐片上從左到右順次搭接粘貼的樣品墊片1、檢測膜2和吸水墊片3，所述樣品墊片I和檢測膜2之間設有偶合物墊片5，偶合物墊片5 —端上方僅設有第一層玻璃纖維墊片6-1，所述檢測膜2上設有檢測線7，所述檢測線7包被有腎損傷分子-1 (KIM-1)抗體，所述檢測線7另一邊設有控制線8，控制線8包被有抗鏈霉親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片5上涂布有熒光標記的腎損傷分子-1單克隆抗體或多克隆抗體偶合物。
[0029]所述控制線8與檢測線7平行設置于檢測膜2上，與偶合物墊片5部分重疊。
[0030]其中，檢測膜2在熒光試紙中用于固定包被抗體，同時也是免疫反應的發(fā)生處；檢測線7是將腎損傷分子-1 (KIM-1)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋后，劃線于所述檢測膜2上，干燥及烘烤后，即得；控制線8是將抗鏈霉親和素(SAV)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋，劃線于所述檢測膜2上，干燥及烘烤后，即得。
[0031]其中，所述偶合物墊片5的原材料為玻璃纖維濾膜，將用于制備偶合物墊片的玻璃纖維濾膜放入預封閉緩沖液中浸泡后取出，干燥后，用包膜儀器將熒光標記的腎損傷分子-1單克隆抗體或多克隆抗體偶合物涂布在偶合物墊片5上，干燥即得。
[0032]另外，所述樣品墊片I可對液態(tài)樣品起到初步過濾作用。將樣本墊片I用封閉液浸泡后，干燥即得。
[0033]將上述各組成部件按圖1所示結構粘貼在支撐墊片4上，獲得快速定量檢測KM-1的免疫熒光試紙條。
[0034]按以下步驟進行檢測:1)收集的病人尿液樣品，如低溫保存樣品需恢復至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片上，反應。3)判讀，將所述免疫熒光試紙置于免疫熒光檢測儀中判定結果。
[0035]實施例3:
[0036]一種快速定量檢測KIM-1的免疫熒光試紙條，它包括試紙條支撐片4以及試紙條支撐片上從左到右順次搭接粘貼的樣品墊片1、檢測膜2和吸水墊片3，所述樣品墊片I和檢測膜2之間設有偶合物墊片5，所述檢測線7包被有腎損傷分子-1 (KIM-1)抗體，所述檢測線7另一邊設有控制線8，控制線8包被有抗鏈霉親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片5上涂布有熒光標記的腎損傷分子-1單克隆抗體或多克隆抗體偶合物。
[0037]所述控制線8與檢測線7平行設置于檢測膜2上，與偶合物墊片5部分重疊。
[0038]其中，檢測膜2在熒光試紙中用于固定包被抗體，同時也是免疫反應的發(fā)生處；檢測線7是將腎損傷分子-1 (KIM-1)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋后，劃線于所述檢測膜2上，干燥及烘烤后，即得；控制線8是將抗鏈霉親和素(SAV)抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋，劃線于所述檢測膜2上，干燥及烘烤后，即得。
[0039]其中，所述偶合物墊片5的原材料為玻璃纖維濾膜，將用于制備偶合物墊片的玻璃纖維濾膜放入預封閉緩沖液中浸泡后取出，干燥后，用包膜儀器將熒光標記的腎損傷分子-1單克隆抗體或多克隆抗體偶合物涂布在偶合物墊片5上，干燥即得。
[0040]另外，所述樣品墊片I可對液態(tài)樣品起到初步過濾作用。將樣本墊片I用封閉液浸泡后，干燥即得。
[0041 ] 將上述各組成部件按圖1所示結構粘貼在支撐墊片4上，獲得快速定量檢測KM-1的免疫熒光試紙條。
[0042] 按以下步驟進行檢測:1)收集的病人尿液樣品，如低溫保存樣品需恢復至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片上，反應。3)判讀，將所述免疫熒光試紙置于免疫熒光檢測儀中判定結果。
【權利要求】
1.一種快速定量檢測KIM-1的免疫熒光試紙條，它包括試紙條支撐片(4)以及試紙條支撐片上從左到右順次搭接粘貼的樣品墊片(I)、檢測膜(2)和吸水墊片(3)，其特征在于:所述樣品墊片(I)和檢測膜(2)之間設有偶合物墊片(5)，偶合物墊片(5) —端上方設有第一層玻璃纖維墊片(6-1)，其另一端下方設有第二層玻璃纖維墊片(6-2)或者偶合物墊片(5 ) 一端上方僅設有第一層玻璃纖維墊片(6-1)或者不設有任一墊片，所述檢測膜(2 )上設有檢測線(7)，所述檢測線(7)包被有腎損傷分子-1 (KIM-1)抗體，所述檢測線(7)另一邊設有控制線(8 )，控制線(8 )包被有抗鏈霉親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片(5 )上涂布有熒光標記的腎損傷分子-1單克隆抗體或多克隆抗體偶合物，所述控制線(8)與檢測線(7)平行設置于檢測膜(2)上，并與偶合物墊片(5)部分重疊或不重疊。
【文檔編號】G01N33/533GK204044162SQ201420197173
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權日:2014年4月22日
【發(fā)明者】劉紅劍, 威廉姆.努特, 何小紅, 劉麗萍, 張丹 申請人:瑞萊生物科技（江蘇）有限公司