一種灰霉病的苗期診斷方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種灰霉病的苗期診斷方法，該方法包括：根據(jù)病情指數(shù)調(diào)查和分析，通過檢測苗期葉片內(nèi)的ROS和鈣含量，確定了灰霉病感染的基準(zhǔn)指標(biāo)為：ROS染色比例為0.53，葉片內(nèi)鈣離子的含量為139.45μg/g；在實(shí)際診斷檢測中，當(dāng)ROS染色比例≥0.53和/或鈣含量≥140μg/g時(shí)，灰霉病不會(huì)發(fā)生，當(dāng)ROS染色比例＜0.53和/或鈣含量＜140μg/g時(shí)，可以通過施肥措施調(diào)控葉片內(nèi)鈣離子的含量，該方法具有操作簡單，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)。該方法實(shí)現(xiàn)了病害的苗期診斷方法，為提早采取有效預(yù)防措施提供了科學(xué)的依據(jù)和方法。
【專利說明】一種灰霉病的苗期診斷方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病害防治【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種對(duì)灰霉病的苗期診斷方法。

【背景技術(shù)】
[0002]灰霉病是由半知菌亞門灰葡萄孢屬（BotrytiscinereaPers.)侵染所致，該病原 菌寄主廣泛，可侵染茄科、葫蘆科、薔薇科、豆科等200余種植物。是一種毀滅性病害，設(shè)施 番茄尤為嚴(yán)重，由灰霉病所造成的產(chǎn)量損失一般在10%?20%，嚴(yán)重者可達(dá)60%以上，甚 至出現(xiàn)因灰霉病大發(fā)生、防治不及時(shí)而造成的番茄毀棚事件。
[0003]該病發(fā)生早期在作物葉片中會(huì)產(chǎn)生一系列的生理變動(dòng)，隨后可以侵染葉、莖、花等 器官；
[0004] 該病原菌繁殖速度快、變異頻率高、易產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)缺乏抗性寄主資源，導(dǎo)致 該病害的防治十分困難。
[0005] 在植物與病原物相互作用的過程中，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)，以抵抗 病原物的侵染，在此過程中也會(huì)產(chǎn)生許多抗性相關(guān)物質(zhì)。當(dāng)病原菌刺激植物細(xì)胞時(shí)，最早的 細(xì)胞反應(yīng)之一包括鈣離子通道的打開和隨后鈣離子涌入到細(xì)胞質(zhì)，因此植物葉片的鈣含量 會(huì)相應(yīng)變化且升高，從而引起細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng)，繼而引起局部和系統(tǒng)抗 性。同時(shí)植物體也會(huì)合成水楊酸（SA)，并被浸染點(diǎn)的細(xì)胞受體接受，引起浸染葉片的過敏反 應(yīng)（HR)，植物免疫反應(yīng)最明顯的表現(xiàn)是HR，即在病原體侵染部位生成壞死性病斑，且該反 應(yīng)通常與活性氧（R0S)的積累有密切關(guān)系。
[0006] 目前，國內(nèi)外對(duì)灰霉病的苗期診斷方法研究不多，近幾年來，利用植物生長和生理 生化指標(biāo)進(jìn)行間接鑒定的研究有很多報(bào)道，利用苗期生理指標(biāo)評(píng)價(jià)植物的病害發(fā)生情況顯 得尤為重要。但是，目前還沒有統(tǒng)一的鑒定方法和評(píng)價(jià)體系。因此，為了能有效防治灰霉病 在的爆發(fā)，發(fā)明人進(jìn)行了灰霉病的苗期診斷方法的研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提出一種對(duì)植物灰霉病的苗期診斷方法，由于當(dāng)前灰霉病常常在 果實(shí)期爆發(fā)并對(duì)茄果類的產(chǎn)量造成重大影響，而在苗期對(duì)其進(jìn)行苗期監(jiān)控并采取有機(jī)農(nóng)業(yè) 防治措施，能有效避免常規(guī)的化學(xué)藥劑造成的用藥不選擇、用量不規(guī)范、方法不合理、防病 效果差、環(huán)境污染重等不良影響。該方法快速簡便，成本低。而且容易操作，不需要昂貴的 設(shè)備。有利于推廣應(yīng)用。本發(fā)明所述的灰霉病的苗期診斷方法，其包括如下步驟：
[0008] (1)取待檢植物苗期31天的第三、四葉位葉片，分別進(jìn)行R0S的原位檢測和鈣含量 檢測；
[0009] (2)灰霉病感染的評(píng)判指標(biāo)為R0S染色比例彡0? 53,和/或鈣含量彡140i!g/g。 即當(dāng)R0S染色比例彡0. 53和/或鈣含量彡140yg/g時(shí)，灰霉病不會(huì)發(fā)生，本發(fā)明提供的評(píng) 判指標(biāo)R0S染色比例或鈣含量，可以單一使用作為預(yù)測病害發(fā)生情況的依據(jù)，但是如果同 時(shí)滿足R0S染色比例和鈣含量的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，則預(yù)測結(jié)果更為準(zhǔn)確。
[0010] 由于鈣是作物生長的必需大量元素，是影響作物抗性和抑制病害發(fā)生的最關(guān)鍵的 營養(yǎng)因子，是其他礦質(zhì)元素不可比擬的；一定濃度的鈣離子可以直接抑制病菌的生長；此 夕卜，Ca2+能顯著提高H202含量，H202持續(xù)誘導(dǎo)病程相關(guān)基因的表達(dá)，使植物抗病性增強(qiáng)。因 此，本發(fā)明選擇葉片的鈣離子含量作為病害診斷指標(biāo)。
[0011]R0S是活性氧的統(tǒng)稱，其中最有效的成分就是過氧化氫（H202)，H202是動(dòng)植物細(xì)胞 應(yīng)答各種逆境產(chǎn)生的重要信號(hào)分子，H202含量增加可增強(qiáng)細(xì)胞壁，促進(jìn)植物抗毒素產(chǎn)生，也 可直接殺死病原菌產(chǎn)生過敏性壞死（HR)，誘導(dǎo)抗病相關(guān)酶及病程相關(guān)蛋白基因PR1的表 達(dá)，產(chǎn)生抗病反應(yīng)。因此，本發(fā)明選擇葉片的R0S作為病害診斷指標(biāo)。
[0012] 本發(fā)明上述技術(shù)方案中所述的方法，其中步驟（1)所述R0S的原位檢測方法為：將 葉片浸泡在lmg/mL的DAB溶液中，25°C環(huán)境中光照8h后，取出浸泡過的葉片置于95%乙醇 中煮沸30min脫色，然后將葉片在95%乙醇中泡4h，測定葉片中出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)的數(shù)量，計(jì)算 R0S染色比例。
[0013] 本發(fā)明上述技術(shù)方案中所述的方法，其中步驟（1)所述測定鈣含量方法為：先稱 取葉片樣品干重，再經(jīng)濃HN03和H202浸泡12h后用微波消解儀進(jìn)行消解，得到的消解液用 高純水定容至50mL容量瓶中，用原子吸收分光光度計(jì)測定鈣含量。所述的測定鈣含量方法 的更詳細(xì)操作如下述實(shí)施例。
[0014] 本發(fā)明上述技術(shù)方案中所述的方法，其中步驟（1)所述待檢植物為茄科、葫蘆科、 豆科等多種蔬菜，尤其適用于番茄。
[0015] 本發(fā)明還公開一種灰霉病的苗期預(yù)防方法，其包括如下步驟：按照上文所述灰 霉病的苗期診斷方法對(duì)待檢植物葉片進(jìn)行診斷，當(dāng)R0S染色比例> 0. 53和/或鈣含量 彡140yg/g時(shí)，灰霉病不會(huì)發(fā)生；當(dāng)R0S染色比例< 0. 53和/或鈣含量< 140yg/g時(shí)，可 以通過施肥措施調(diào)控葉片內(nèi)鈣離子的含量。
[0016] 本發(fā)明選用R0S評(píng)價(jià)法，其目的是檢測在病害侵染后引起植株細(xì)胞內(nèi)部的生理變 化，由于病害的侵染，造成過氧化物增加，過氧化物對(duì)植株細(xì)胞造成損害，損害的程度經(jīng)過 染色后可見，斑點(diǎn)數(shù)目是染色后細(xì)胞被危害的數(shù)目，數(shù)目多意味著危害重。
[0017] 雖然不同蔬菜對(duì)鈣離子需求不同，但大多蔬菜在苗期對(duì)營養(yǎng)的需求沒有大的差 異；本發(fā)明選擇檢測葉片內(nèi)的鈣離子濃度，其并不受土壤和施肥等外界因素影響，同時(shí)，本 申請(qǐng)選擇番茄為例（番茄是最敏感的蔬菜），使得方法的建立更具代表性。測定葉片中的鈣 含量，可以根據(jù)測定值的范圍判定番茄灰霉病發(fā)生的病情指數(shù)，并采取補(bǔ)充鈣的措施提高 植株的抗病性，起到苗期防治的效果。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 本發(fā)明率先提出灰霉病的苗期診斷方法，通過苗期診斷預(yù)測灰霉病的發(fā)生，并可 以通過調(diào)節(jié)鈣離子濃度進(jìn)行有效的預(yù)防。診斷材料容易獲得，操作簡單，具有重復(fù)性好，結(jié) 果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，有利于推廣應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1不同鈣濃度處理下番茄葉片R0S爆發(fā)的情況，其中：橫坐標(biāo)的六個(gè)時(shí)間點(diǎn)表 示所有番茄葉片接菌之后的時(shí)間；縱坐標(biāo)的五個(gè)處理表示五個(gè)不同鈣濃度的營養(yǎng)液，其中 0XCa2+ (Ca2+ 濃度為OmM)、1/5XCa2+ (Ca2+ 濃度為 0? 75mM)、1XCa2+ (Ca2+ 濃度為 3. 75mM)、 2XCa2+(Ca2+濃度為7. 5mM)和4XCa2+(Ca2+濃度為15mM)，從圖中信息可知葉片上的棕色斑 點(diǎn)表示染色后細(xì)胞被危害的數(shù)目也就是病害侵染的嚴(yán)重程度。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明：
[0022] 本發(fā)明中所使用的試驗(yàn)材料、試劑及試驗(yàn)方法如無特殊說明，均以常規(guī)途徑獲得 或以常規(guī)試驗(yàn)方法制備，其中：
[0023] 本發(fā)明實(shí)施例選擇灰霉菌孢子懸浮液（濃度為106個(gè)/mL)為代表菌，其屬于半知 菌亞門灰葡萄孢屬，拉丁文名為BotrytiscinereaPers.，此菌種源于本實(shí)驗(yàn)室自行分離 的品種，分離時(shí)所用的染病番茄葉片采于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗(yàn)站，對(duì)菌種進(jìn)行分離和鑒 定，通過觀察菌落顏色和分生孢子梗、分生孢子、菌核的形態(tài)特征確定菌的種類為灰霉菌。
[0024] 番茄種子：品種為中雜105,購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所。中雜105為植株無 限生長型，生長勢中等，中早熟。幼果無綠色果肩，成熟果實(shí)粉紅色。果實(shí)圓形，果面光滑， 大小均勻一致，單果重180?220g。果實(shí)硬度高，耐貯運(yùn)。商品果率高，品質(zhì)優(yōu)，口味酸甜適 中。抗番茄花葉病毒?。═0MV)、葉霉病和枯萎病。豐產(chǎn)性好，特別適合日光溫室和大棚栽 培，是設(shè)施番茄的常見品種。
[0025]荷蘭番茄專用配方營養(yǎng)液（單位：mg/L) :Ca(N03)2886，KN03303，KH2P04204，MgS0 4247,（NH4)2S0433,K2S04218,Fe-EDTA20,H3B032. 86,MnS042. 13,ZnS040. 22,CuS040 . 08，和 NH4M〇040. 02。1/2荷蘭溫室番茄專用配方營養(yǎng)液為上述物質(zhì)含量的一半，0XCa2+(Ca2+濃度 為OmM，其中CO(NH2) 2 為 886mg/L，Ca(N03) 2 為Omg/L，其余都不變）、1/5XCa2+ (Ca2+ 濃度為 0? 75mM，其中CO(NH2) 2 為 443mg/L，Ca(N03) 2 為 443mg/L，其余都不變）、1XCa2+ (Ca2+ 濃度為 3. 75mM，為荷蘭溫室番茄專用配方營養(yǎng)液）、2XCa2+ (Ca2+濃度為7. 5mM，在荷蘭溫室番茄專 用配方營養(yǎng)液的基礎(chǔ)上增施CaCl2為443mg/L)和4XCa2+(Ca2+濃度為15mM，在荷蘭溫室番 茄專用配方營養(yǎng)液的基礎(chǔ)上增施CaCl2為886mg/L)。
[0026]DAB溶液：3, 3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB)購于SIGMA公司，產(chǎn)品編號(hào)：D8001，CAS號(hào) 91-95-2,lmg/mLDAB溶液是將0. 01g的DAB溶于10mL蒸餾水中，一定要現(xiàn)配現(xiàn)用，此時(shí)溶 液的pH約為3. 8。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 1育苗培養(yǎng)
[0029] 將層積好的番爺種子播入營養(yǎng)缽（高12cmX直徑12cm)中，砂基培養(yǎng)，每缽20株， 共5缽，培養(yǎng)條件為：26°C黑暗恒溫環(huán)境；待幼苗長2片真葉時(shí)，噴施1/2荷蘭溫室番茄營養(yǎng) 液，每4d噴施一次，其間用清水補(bǔ)充。
[0030] 2不同生長條件處理
[0031] 幼苗長至8片真葉時(shí)，選均勻一致的幼苗移至1/2荷蘭溫室番茄營養(yǎng)液的水培盆 (長15cmX寬lOcmX高12cm)中，每盆植10株，共5盆，隨機(jī)排列。氣泵正常通氣（20min/ h)，每7d更換一次營養(yǎng)液（即1/2荷蘭溫室番爺營養(yǎng)液，更換時(shí)原營養(yǎng)液全部倒掉再更換 新的營養(yǎng)液）。培養(yǎng)條件為：14h光照/d，光照強(qiáng)度150001X，晝溫23°C/夜溫18°C，晝夜 濕度65 % /80 %。培養(yǎng)28d后，根據(jù)研究需要，設(shè)定五個(gè)不同鈣濃度的營養(yǎng)液，配方如上述 所示，分別是 〇XCa2+ (Ca2+ 濃度為OmM)、1/5XCa2+ (Ca2+ 濃度為 0. 75mM)、1XCa2+ (Ca2+ 濃度為 3. 75mM)、2XCa2+(Ca2+濃度為7. 5mM)和4XCa2+(Ca2+濃度為15mM)，培養(yǎng)條件和前期完全一 致。
[0032] 3病害處理
[0033] 利用上述五組不同鈣濃度的營養(yǎng)液處理3d后，將五組番茄植株分別噴施灰霉菌 孢子懸浮液（濃度為1〇6個(gè)/mL)，暗處理18°C-天。剩下六天的培養(yǎng)條件為14h光照/d， 光照強(qiáng)度150001x，晝溫20°C/夜溫18°C，晝夜?jié)穸染鶠?00%。
[0034] 4病害調(diào)查與分級(jí)
[0035] 五組番茄植株在接菌7d后，根據(jù)以下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況，以后每隔2d(測定 包括6個(gè)時(shí)間點(diǎn)為接菌后0h、6h、12h、24h、48h、96h測定）調(diào)查一次病害情況，記錄病情指 數(shù)。確立病害等級(jí)，依照分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行分級(jí)。
[0036] 番茄苗期灰霉病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無??；1級(jí)：1/4以下葉片發(fā)病；2級(jí)：1/4? 1/2葉片發(fā)??；3級(jí)：1/2?3/4葉片發(fā)?。?級(jí)：3/4以上葉片發(fā)病或全株枯萎、倒苗。
[0037] 結(jié)果計(jì)算：病情指數(shù)=100XE(各級(jí)病葉數(shù)X各級(jí)代表值V(調(diào)查總?cè)~ 數(shù)X9)。
[0038] 5建立評(píng)價(jià)體系
[0039] 采用兩種評(píng)價(jià)方法，建立一套適合灰霉病的苗期診斷和鑒定方法。通過病情指數(shù) 與R0S、葉片鈣含量的定量關(guān)系確定苗期病害的診斷指標(biāo)。
[0040] 1)R0S評(píng)價(jià)法
[0041] 培養(yǎng)至28天的植株經(jīng)過五組不同鈣濃度的營養(yǎng)液處理3d后，進(jìn)行接菌處理，在接 菌之后的0,6,12, 24,48,96h取每個(gè)處理的葉片進(jìn)行R0S的原位檢測，觀察并計(jì)算番茄葉片 中棕色（非黃色）斑點(diǎn)面積的大小，反映植物體對(duì)病害抵抗能力的強(qiáng)弱，根據(jù)染色比例判定 番茄灰霉病發(fā)生的病情指數(shù)，其中，R0S染色比例=(斑點(diǎn)面積/葉片總面積）X100%。
[0042] 上文所述的R0S的原位檢測方法：將待檢植株的第三、四葉位葉片浸泡在lmg/mL 的DAB溶液中，25°C環(huán)境中光照8h后，取出浸泡過的葉片置于95%乙醇中煮沸30min脫色， 然后將葉片在新鮮的95%乙醇中泡4h，測定葉片中出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)的面積；
[0043] 2)鈣含量評(píng)價(jià)法
[0044] 培養(yǎng)至28天的植株經(jīng)過五組不同鈣濃度的營養(yǎng)液處理3d后，進(jìn)行接菌處理，在接 菌之后的0,6，12,24,48,961!取每個(gè)處理的葉片進(jìn)行葉片中鈣含量的測定，根據(jù)測定值的 范圍判定番茄灰霉病發(fā)生的病情指數(shù)。
[0045] 上文所述的測定鈣含量的方法：將待檢植株的第三、四葉位葉片樣品置于烘箱中， 在105°C下殺青30min，然后將溫度調(diào)為80°C，連續(xù)烘48h。隨后樣品進(jìn)行粉粹研磨，稱取 干重后，樣品轉(zhuǎn)移至干凈且干燥的消煮管底部。用移液管向消煮管內(nèi)加入6mL優(yōu)級(jí)純的濃 HN03，搖勻后蓋上蓋子過夜。第二天消煮前，每個(gè)消煮管中加4mL優(yōu)級(jí)純的H202，搖勻后擰緊 管蓋。隨后用微波消解儀進(jìn)行消解，得到的消解液用高純水定容至50mL容量瓶中，用原子 吸收分光光度計(jì)測定葉片中的鈣含量；
[0046] 6?鑒定結(jié)果
[0047]圖1為不同鈣濃度處理下番茄葉片R0S爆發(fā)的情況，其中：橫坐標(biāo)的六個(gè)時(shí)間點(diǎn) 表示所有番茄葉片接菌之后的時(shí)間；縱坐標(biāo)的五個(gè)處理表示五個(gè)不同鈣濃度的營養(yǎng)液，其 中 0XCa2+ (Ca2+ 濃度為OmM)、1/5XCa2+ (Ca2+ 濃度為 0? 75mM)、1XCa2+ (Ca2+ 濃度為 3. 75mM)、 2XCa2+(Ca2+濃度為7. 5mM)和4XCa2+(Ca2+濃度為15mM)，從圖中信息可知葉片上的棕色斑 點(diǎn)表示染色后細(xì)胞被危害的數(shù)目也就是病害侵染的嚴(yán)重程度。
[0048] 表1不同鈣濃度處理下番茄植株的病情指數(shù)

【權(quán)利要求】
1. 一種灰霉病的苗期診斷方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 取待檢植物苗期31天的第三、四葉位葉片，分別進(jìn)行ROS的原位檢測和鈣含量檢 測； (2) 灰霉病感染的評(píng)判指標(biāo)為ROS染色比例彡0. 53和/或鈣含量彡140 y g/g。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述ROS的原位檢測方法為：將 葉片樣品浸泡在lmg/mL的DAB溶液中，25°C光照8h后，取出浸泡過的葉片樣品置于95%乙 醇中煮沸30min脫色，然后將葉片樣品在95%乙醇中泡4h，測定葉片樣品中出現(xiàn)棕色斑點(diǎn) 的數(shù)量，計(jì)算R0S染色比例。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述測定鈣含量方法為：先稱取 葉片樣品干重，再經(jīng)濃HN03和H202浸泡12h后用微波消解儀進(jìn)行消解，得到的消解液用高 純水定容至50mL容量瓶中，用原子吸收分光光度計(jì)測定鈣含量。
4. 一種灰霉病的苗期預(yù)防方法，其特征在于，包括如下步驟：按照權(quán)利要求1所述灰 霉病的苗期診斷方法對(duì)待檢植物葉片進(jìn)行診斷，當(dāng)R0S染色比例> 0. 53和/或鈣含量 彡140iig/g時(shí)，灰霉病不會(huì)發(fā)生；當(dāng)R0S染色比例<0. 53和/或鈣含量< 140iig/g時(shí)，通 過施肥措施調(diào)控葉片內(nèi)鈣離子的含量。
【文檔編號(hào)】G01N33/48GK104330548SQ201410587556
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】余慧蕓 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)