同時(shí)測(cè)定大花羅布麻葉中6種黃酮類成分含量的hplc方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種同時(shí)測(cè)定大花羅布麻葉中6種黃酮類成分含量的HPLC方法，該方法以微乳液作為流動(dòng)相的高效液相色譜法，微乳流動(dòng)相中水相的比例一般都在90%以上，與目前常規(guī)高效液相色譜法中流動(dòng)相相比大大減少了有機(jī)溶劑的使用，大大降低了對(duì)身體的危害、環(huán)境的污染和分析的時(shí)間和成本。通過對(duì)微乳色譜條件的優(yōu)化，在等度洗脫條件下，大花羅布麻葉中6種黃酮類成分同時(shí)得到了有效的分離，建立了一種綠色環(huán)保、準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定的快速檢測(cè)方法?？朔爽F(xiàn)有大花羅布麻葉黃酮類成分測(cè)定中的缺陷。
【專利說明】同時(shí)測(cè)定大花羅布麻葉中6種黃鋼類成分含量的HPLC方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用HPLC同時(shí)測(cè)定大花羅布麻葉中6種 黃麗類成分的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 大花羅布麻任oacynum hedersonni (Hook. F. ) Woodson)是夾竹桃科白麻屬植物， 學(xué)名大葉白麻，藥用部位是葉，主要分布在我國新疆地區(qū)，是生長在鹽堿、沙荒地區(qū)及戈壁 灘上的多年生宿根植物資源，其獨(dú)特的生長環(huán)境使其具有十分特異的藥用保健功效。新疆 大花羅布麻入藥已有千年歷史，其部分藥理作用很早就被人們發(fā)現(xiàn)并用于臨床，據(jù)《本草綱 目》、《救荒本草》記載，其羅布麻葉有清熱利尿、平肝、安神等功效，臨床用于治療高血壓、冠 也病、頸椎病、腎炎浮腫、神經(jīng)衰弱、更年期綜合征等疾病，1977年正式錄入《中華人民共和 國藥典》?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明黃麗類物質(zhì)為大花羅布麻葉最主要的有效成分，大花羅布麻 葉中黃麗類物質(zhì)主要是搬皮素-3-0-槐糖巧、羅布麻甲素、搬皮素、金絲桃巧、紫云英巧和 H葉豆巧等6種黃麗類成分。隨著大花羅布麻葉在臨床上廣泛應(yīng)用，非常有必要對(duì)其中黃 麗類成分進(jìn)行含量測(cè)定及分析，該有助于大花羅布麻葉的質(zhì)量控制，亦為今后對(duì)大花羅布 麻的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外對(duì)大花羅布麻葉黃麗類成分的檢測(cè)方法主要是分光 光度法和高效液相色譜法（HPLC)。
[0003] 分光光度法測(cè)定的是大花羅布麻葉總黃麗的含量，但該只能粗略反映大花羅布麻 葉中含黃麗類成分的總量，不能反映大花羅布麻葉各黃麗類成分的情況，無法用來評(píng)價(jià)大 花羅布麻葉質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。近年來，隨著中藥物質(zhì)基礎(chǔ)、藥理活性研究的 深入和現(xiàn)代分離技術(shù)的提高，中藥質(zhì)量水平有了明顯的提高。在認(rèn)識(shí)到中藥藥效是多祀點(diǎn)、 多成分的協(xié)同作用特點(diǎn)后，多指標(biāo)成分定量成為中藥含量測(cè)定的發(fā)展趨勢(shì)。而目前有關(guān)高 效液相色譜法測(cè)定大花羅布麻葉黃麗成分的文獻(xiàn)中，只有對(duì)大花羅布麻葉黃麗類物質(zhì)中的 個(gè)別成分進(jìn)行了測(cè)定，而沒有同時(shí)對(duì)搬皮素-3-0-槐糖巧、羅布麻甲素、搬皮素、金絲桃巧、 紫云英巧和H葉豆巧等多種黃麗類成分進(jìn)行測(cè)定，因而無法全面的反映大花羅布麻葉黃麗 類成分，進(jìn)而也就無法反映大花羅布麻葉的質(zhì)量情況。同時(shí)還由于各黃麗類成分之間物理 化學(xué)性質(zhì)的較大差異，現(xiàn)有的HPLC分離方法均存在分離選擇性小，分離度差和分離時(shí)間長 的缺點(diǎn)。另外，目前的HPLC分離方法中流動(dòng)相含有高比例的甲醇或己膳，該對(duì)身體及環(huán)境 也是十分有害的。因而，建立一種綠色環(huán)保高效的分析測(cè)定大花羅布麻葉中多種黃麗類成 分的方法具有重要意義。
[0004] 微乳液相色譜（microemulsion liquid C虹omatography, MELC)法是W微乳為流 動(dòng)相的高效液相色譜法。微乳流動(dòng)相通常是由水相、油相、表面活性劑和助表面活性劑組 成，是一種透明或半透明的，低粘度的，各向同性且熱力學(xué)穩(wěn)定的水油混合系統(tǒng)，粒徑小于 lOOnm。MELC法與常規(guī)HPLC法相比，具有不使用或極少使用有機(jī)溶劑、分離效率高和分離速 度快的優(yōu)勢(shì)，可用于復(fù)雜樣品的分離，復(fù)雜樣品經(jīng)過簡(jiǎn)單的稀釋后便可W直接進(jìn)樣分析，無 需預(yù)處理。在低紫外波長（200nm)檢測(cè)方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。
[0005] 本發(fā)明建立了一種W微乳液作為流動(dòng)相的高效液相色譜法（即微乳液相色譜 (MELC))對(duì)大花羅布麻葉中搬皮素-3-0-槐糖巧、羅布麻甲素、搬皮素、金絲桃巧、紫云英巧 和H葉豆巧等6種黃麗類成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，并應(yīng)用該方法分別對(duì)6批樣品進(jìn)行分析， 進(jìn)而比較不同批次大花羅布麻葉藥材在化學(xué)成分組成和含量上的異同，為臨床上大花羅布 麻葉藥材的應(yīng)用提供更好的理論指導(dǎo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于，提供一種同時(shí)測(cè)定大花羅布麻葉中6種黃麗類成分含量的HPLC 方法，該方法W微乳液作為流動(dòng)相的高效液相色譜法，微乳流動(dòng)相中水相的比例一般都在 90% W上，與目前常規(guī)高效液相色譜法中流動(dòng)相相比大大減少了有機(jī)溶劑的使用，大大降 低了對(duì)身體的危害、環(huán)境的污染和分析的時(shí)間和成本。通過對(duì)微乳色譜條件的優(yōu)化，在等度 洗脫條件下，大花羅布麻葉中6種黃麗類成分同時(shí)得到了有效的分離，建立了一種綠色環(huán) 保、準(zhǔn)確可靠、穩(wěn)定的快速檢測(cè)方法?？朔爽F(xiàn)有大花羅布麻葉黃麗類成分測(cè)定中的缺陷。
[0007] 本發(fā)明所述的一種同時(shí)測(cè)定大花羅布麻葉中6種黃麗類成分含量的HPLC方法，按 下列步驟進(jìn)行：
[0008] a、樣品溶液制備；稱取真空干燥至恒重的大花羅布麻葉粉末0. 5g，精密稱定，過 3號(hào)篩，加入40mL濃度為70 %己醇，浸泡比，超聲處理30min，放冷，濾過，準(zhǔn)確移取續(xù)濾液 2mL，置10血容量瓶中，W濃度為70 %己醇定容，搖勻后，用0. 45 y m濾膜過濾，取續(xù)濾液，即 得樣品溶液；
[0009] b、對(duì)照品溶液制備；分別稱取真空干燥至恒重的搬皮素-3-0-槐糖巧、羅布麻甲 素、搬皮素、金絲桃巧、紫云英巧和H葉豆巧對(duì)照品適量，精密稱定，加入濃度為70%己醇超 聲溶解，制成2mg/ml的混合對(duì)照品溶液，作為膽備液，密封，溫度4°C保存；
[0010] C、微乳流動(dòng)相配制；將體積分?jǐn)?shù)2. 0 %表面活性劑Genapo 1 X-080，體積分 數(shù)3. 0%助表面活性劑正下醇，體積分?jǐn)?shù)0. 6%油相己酸己醋，體積分?jǐn)?shù)0. 2 %H己胺和 94.2%水溶液混合，用2〇1111電口〇4調(diào)節(jié)抑=5.0，超聲3〇111111，經(jīng)0.4511111濾膜過濾，超聲 30min，即得透明穩(wěn)定的微乳溶液，靜置過夜，備用；
[0011] d、色譜條件：色譜柱為 Zorbax SB-Cig4. 6mmX 150mm，5 Ji m 柱，流速 0. 8血/min, 檢測(cè)波長 360nm，柱溫3(rC，流動(dòng)相為2.0%GenapolX-080-3.0%正下醇-0.6%己酸己 醋-0. 2%H己胺-94. 2%水溶液，用20mM H3PO4調(diào)節(jié)抑=5.0,進(jìn)樣量IOyL,采用外標(biāo)法 定量，色譜圖記錄與處理由工作站完成，理論培板數(shù)按羅布麻甲素峰計(jì)算不低于8000。
[0012] 本發(fā)明采用微乳液相色譜法，同時(shí)測(cè)定了大花羅布麻葉中的6中黃麗類成分的含 量，結(jié)果該6種黃麗成分在15min內(nèi)達(dá)到基線分離，在l-500mg/L范圍內(nèi)，6個(gè)黃麗成分的線 性相關(guān)系數(shù)r 2 > 0.9996,回收率98. 9-100. 8%。本方法可應(yīng)用于大花羅布麻葉中6種主 要黃麗成分的質(zhì)量分析。
[0013] 本發(fā)明所述的同時(shí)測(cè)定大花羅布麻葉中6種黃麗類成分含量的HPLC方法，該方法 的優(yōu)點(diǎn)在于，在微乳液相色譜中，6種主要黃麗成分分離效率高（完全分離），分離速度快 (分離時(shí)間僅為常規(guī)HPLC方法的1/3)，該是由于溶質(zhì)在固定相、微乳液滴和水相之間進(jìn)行 分配，有利于提高色譜的分離能力，與常規(guī)HPLC相比，微乳液相色譜對(duì)化合物的溶解能力 較強(qiáng)，尤其適用于極性或溶解度差異較大的復(fù)雜樣品分離，等度洗脫即可達(dá)到基線分離，且 有機(jī)溶劑用量極少，分析成本低，有經(jīng)濟(jì)和環(huán)保方面的顯著優(yōu)勢(shì)。
[0014] 本發(fā)明所述的同時(shí)測(cè)定大花羅布麻葉中6種黃麗類成分含量的HPLC方法，該方法 的創(chuàng)新點(diǎn)在于使用了微乳為流動(dòng)相的高效液相色譜法（HPLC)，與常規(guī)HPLC法相比，具有不 使用或極少使用有機(jī)溶劑、分離效率高和分離速度快的優(yōu)勢(shì)，可用于復(fù)雜樣品的分離，復(fù)雜 樣品經(jīng)過簡(jiǎn)單的稀釋后便可W直接進(jìn)樣分析，無需預(yù)處理。不僅綠色環(huán)保，分析時(shí)間大大縮 短。專利申請(qǐng)?zhí)?01010120856是常規(guī)的HPLC方法，不僅流動(dòng)相大量使用了甲醇和己膳等 有毒有機(jī)溶劑，而且分析時(shí)間長達(dá)70分鐘W上。而本發(fā)明流動(dòng)相中沒有使用任何有毒有機(jī) 溶劑，其中絕大部分是水巧4. 2%)，并且分析時(shí)間只有10分鐘左右。該大大提高了分析效 率。同時(shí)根據(jù)HPLC方法的原理，簡(jiǎn)單的說，就是樣品溶解在流動(dòng)相中，隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜 柱，經(jīng)過固定相（填料）時(shí)，會(huì)受到固定相的吸附。樣品中不同組分受到的吸附不同，于是 流出色譜柱的時(shí)間順序就不同。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明建立MELC方法的對(duì)照品溶液高效液相色譜圖；
[0016] 圖2為本發(fā)明建立MELC方法的樣品溶液高效液相色譜圖；
[0017] 圖3為本發(fā)明建立MELC法（A)與常規(guī)HPLC法做比較的高效液相色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 一、實(shí)驗(yàn)部分 [001引儀器與試劑：
[0020] Agilent 1100高效液相色譜儀、四元梯度粟、DAD檢測(cè)器、Agilent色譜工作站 (Agilent公司）；FZ102植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；DGSY電熱恒溫水浴鍋 (北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；TCL-16G臺(tái)式高速離也機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠）；SK5200L肥超 聲處理器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；RE-3000C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）； P服-3C精密抑計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）；
[0021] 搬皮素-3-0-槐糖巧、羅布麻甲素、搬皮素、金絲桃巧、紫云英巧和H葉豆巧對(duì)照 品均購自Sigma公司（純度大于98%);大花羅布麻葉藥材由新疆本草堂中藥飲片有限 公司提供，經(jīng)新疆中藥民族藥研究所鑒定為大花羅布麻（Poacynum hedersonni化ook. F.) Woodson);月桂醇聚氧己帰離（Genapol X-080,分析純，Sigma公司），己酸己醋、庚焼、甲 苯、正辛醇、正丙醇和正己焼（分析純，Merck公司），磯酸、H己胺（分析純，北京化學(xué)試劑 公司），己膳（色譜純，F(xiàn)isher公司），水為超純水，其余試劑均為分析純；
[00過液相色譜條件：
[0023] 色譜柱；Zorbax SB-Cis (4. 6mmX 150mm，5 y m)柱；
[0024] 流動(dòng)相；2. 0 % Genapol X-080-3. 0 % 正了醇-0. 6 % 己酸己醋-0. 2 % H 己 胺-94.2%水溶液（用2〇1111畔〇4調(diào)節(jié)抑5.0);
[00巧]流速；0. 8血/min ;
[0026] 檢測(cè)波長；360nm ;
[0027] 柱溫；3(TC ;
[0028]進(jìn)樣體積；IOii L ;
[0029] 色譜分離結(jié)果見圖1，由圖I可知，6種黃麗類成分能良好的分離；
[0030] 對(duì)照品溶液的制備：
[0031] 分別稱取真空干燥至恒重的搬皮素-3-0-槐糖巧、羅布麻甲素、搬皮素、金絲桃 巧、紫云英巧和H葉豆巧對(duì)照品適量，精密稱定，加入濃度為70%己醇超聲溶解，制成2mg/ ml的混合對(duì)照品溶液，作為膽備液，密封4°C保存；
[00礎(chǔ)樣品溶液制備：
[0033] 稱取真空干燥至恒重的大花羅布麻葉粉末（過3號(hào)篩）0. 5g，精密稱定，加40mL濃 度為70%己醇，浸泡比，超聲處理30min，放冷，濾過，準(zhǔn)確移取續(xù)濾液2mU置IOmL容量瓶 中，W濃度為70 %己醇定容，搖勻后，用0. 45 y m濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。
[0034] 二、結(jié)果與討論 [00巧]色譜條件的優(yōu)化
[0036] 表面活性劑的選擇：
[0037] 考察了 SDS、化ij35、Genapol X-080、TritonX-114等表面活性劑對(duì)管花肉巧蓉中 6種黃麗類成分的分離效果，結(jié)果表明，在流動(dòng)相中加入Genapol X-080,可使6種成分的保 留因子達(dá)到合適的范圍（=2?8)，同時(shí)色譜基線平穩(wěn)。當(dāng)在流動(dòng)相中加入SDS時(shí)，由于 SDS為離子型表面活性劑，其對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似的親水性化合物分離度差，6種黃麗類成 分幾乎分離不開；而在流動(dòng)相中加入化i j35、TritonX-114等非離子型表面活性劑時(shí)，由于 化i j35、TritonX-114在210nm處存在吸收，色譜基線也不穩(wěn)定，會(huì)干擾測(cè)定。而非離子型表 面活性劑Genapol X-080在210nm處無吸收，色譜基線穩(wěn)定，故選擇Genapol X-080作為最 佳表面活性劑。按一定比例配制分別含0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%和2. 5%Genapol X-080 的微乳流動(dòng)相，考察Genapol X-080的含量對(duì)大花羅布麻葉中6種黃麗類成分的分離選擇 性的影響。結(jié)果顯示；隨著Genapol X-080含量的增加，大花羅布麻葉中6種黃麗類成分的 保留因子明顯減少，當(dāng)Genapol X-080含量為2. 0%時(shí)，6種黃麗類成分的保留因子達(dá)到合 適的范圍，分離效果最好，故選擇Genapol X-080含量為2. 0%。
[0038] 助表面活性劑的選擇：
[0039] 分別選擇正下醇、正戊醇、正丙醇、異丙醇為助表面活性劑，考察其對(duì)色譜行為的 影響。結(jié)果顯示，W正下醇為助表面活性劑時(shí)，6種黃麗類類成分的保留時(shí)間均減少，改變 正下醇的含量1. 0-5. 0%，考察其對(duì)6種黃麗類類成分分離效果的影響。結(jié)果顯示；正下醇 含量在3. 0% W前，隨著正下醇含量的增加，6種苯己醇巧類成分的保留時(shí)間都隨著有所縮 短，當(dāng)高于3. 0%時(shí)，保留時(shí)間又相應(yīng)延長，故確定助表面活性劑正下醇含量為3. 0%時(shí)分 離效果最為理想。
[0040] 油相的選擇：
[0041] 考察了正庚焼、甲苯、己酸己醋、正辛焼作為油相對(duì)分離的影響。結(jié)果表明；油相對(duì) 6種黃麗類成分的洗脫能力最強(qiáng)的為己酸己醋，且己酸己醋作為油相時(shí)各組分分離度最好， 而正辛焼、正庚焼和甲苯不能使被測(cè)成分達(dá)到基線分離，故選擇己酸己醋為油相。改變油相 己酸己醋的含量，可W改變物質(zhì)的分離度?？疾旒核峒捍缀吭?. 2% -1. 0%范圍變化時(shí) 對(duì)分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)隨著己酸己醋含量的增加，6種黃麗類成分的分離度相應(yīng)提高。當(dāng) 己酸己醋的含量為0. 6%時(shí)，分離效果最理想，故確定油相己酸己醋的含量為0. 6%。
[004引添加劑和抑值對(duì)分離的影響：
[0043] 因?yàn)辄S麗類成分多帶有輕基，因此H己胺濃度對(duì)黃麗類成分的保留時(shí)間有較大影 響。考察H己胺濃度為0%、0. 1%、0.2%、0.3%、0.4%時(shí)，對(duì)6種黃麗類成分分離效果的 影響。結(jié)果表明：H己胺濃度為0. 3%時(shí)6種黃麗類成分的保留時(shí)間均縮短，最后選擇H己 胺濃度為0. 2%。在最優(yōu)微乳流動(dòng)相的基礎(chǔ)上，改變抑值（用20mM畔〇4調(diào)節(jié)），范圍在 3. 0-7.0,對(duì)6種黃麗類成分的保留時(shí)間和分離度有影響，隨著抑的增加，6種黃麗類成分的 保留時(shí)間有所縮短，但當(dāng)抑=5. 0時(shí)，6種黃麗類成分分離得最好，因此，選擇抑=5. 0 (用 20mM H3PO4 調(diào)節(jié)）。
[0044] 柱溫對(duì)分離的影響：
[0045] 采用Genapol X-080-正下醇-己酸己醋-H己胺-水溶液微乳流動(dòng)相，分別在溫 度201：、251：、301：、351：和401：的條件下考察柱溫對(duì)微乳液相色譜分離選擇性的影響。結(jié) 果表明：隨著柱溫升高，各組分的保留因子減小，當(dāng)柱溫低于3(TC時(shí)，各組分的峰寬較大， 柱效較低；當(dāng)柱溫等于或高于3(TC時(shí)，各組分的峰形較好，柱效明顯提高?？紤]到樣品和色 譜柱對(duì)溫度的耐受性，最終選擇柱溫為3(TC。
[004引 方法驗(yàn)證：
[0047] 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限：
[0048] 取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用微乳流動(dòng)相稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按"實(shí)驗(yàn)部分2 中"的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，W峰面積Y對(duì)濃度X (mg/L)作行線性回歸，得出6種黃麗類成分 的線性回歸方程、定量限（LO曲和檢出限（LOD)見表1 :
[0049] 表IMELC法測(cè)定6種黃麗類成分標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量限和檢出限
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種同時(shí)測(cè)定大花羅布麻葉中6種黃酮類成分含量的HPLC方法，其特征在于按下列 步驟進(jìn)行： a、 樣品溶液制備：稱取真空干燥至恒重的大花羅布麻葉粉末0. 5g，精密稱定，過3號(hào) 篩，加入40 mL濃度為70%乙醇，浸泡1 h，超聲處理30 min，放冷，濾過，準(zhǔn)確移取續(xù)濾液 2mL，置10 mL容量瓶中，以濃度為70%乙醇定容，搖勻后，用0.45 μ m濾膜過濾，取續(xù)濾 液，即得樣品溶液； b、 對(duì)照品溶液制備：稱取真空干燥至恒重的槲皮素-3-0-槐糖苷、羅布麻甲素、槲皮 素、金絲桃苷、紫云英苷和三葉豆苷對(duì)照品適量，分別加入濃度為70%乙醇超聲溶解后，轉(zhuǎn) 移至25 mL容量瓶中，定容，搖勻，作為對(duì)照品貯備液，密封，溫度4°C保存； c、 微乳流動(dòng)相配制：將體積分?jǐn)?shù)2. 0 %表面活性劑Genapol X-080,體積分?jǐn)?shù)3. 0%助 表面活性劑正丁醇，體積分?jǐn)?shù)0.6%油相乙酸乙酯，體積分?jǐn)?shù)0.2%三乙胺和94. 2%水溶液 混合，用20mM Η3Ρ04調(diào)節(jié)pH =5. 0,超聲30 min，經(jīng)0. 45μπι濾膜過濾，超聲30 min，即得 透明穩(wěn)定的微乳溶液，靜置過夜，備用； d、 色譜條件：色譜柱為 Zorbax SB_C18 4. 6mmX 150mm，5 μ m 柱，流速 0· 8 mL/min，檢測(cè)波長 360 nm，柱溫 30°C，流動(dòng)相為 2· 0% Genapol X-080-3. 0% 正丁 醇-(λ 6%乙酸乙酯-0.2%三乙胺-94. 2%水溶液，用20mM Η3Ρ04調(diào)節(jié)pH =5.0,進(jìn)樣量 10 μ L，采用外標(biāo)法定量，色譜圖記錄與處理由工作站完成，理論塔板數(shù)按羅布麻甲素峰計(jì) 算不低于8000。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104237416SQ201410510844
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月27日
【發(fā)明者】周軍, 張瓊, 孫江兵, 雷權(quán), 曾平 申請(qǐng)人:中國人民解放軍蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院